健骨颗粒对ER表达沉默成骨细胞株ROS1728的分化的研究

林煜 肖莉莉 林焱斌 张怡元 黄云梅 吴银生 林燕萍*

1. 厦门大学附属福州第二医院骨科，福建 福州 350007 2. 福建中医药大学，福建 福州 350102

骨质疏松(osteoporosis)是一种常见的与年龄、性激素相关的退行性疾病，机体在达到骨峰值后，随着年龄的增长、性激素水平的降低，成骨细胞活性逐渐降低，而破骨细胞活性相对增强，导致骨吸收大于骨形成，骨量减少。因此，骨质疏松是与衰老密切相关性疾病，而端粒酶在衰老过程中起着关键作用。端粒酶是一种特异的染色体末端转移酶，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生化[1]。端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)是端粒酶活性的决定因素，TERT表达与端粒酶活性高度相关，能激活端粒酶抑制端粒DNA的消耗[2]。端粒、端粒酶调节机制与机体雌激素水平的关系十分密切，研究证实，雌激素主要作用于TERT基因的启动子，对TERT转录水平进行调节而激活端粒酶[3]。前期研究显示：成人男性和女性骨组织中TERT、雌激素受体α(estrogen receptorα，ERα)均会随着年龄的增加逐渐下降[4]。而以补肾健脾立法的健骨颗粒，能明显提高大鼠体内雌二醇(estradiol，E2)水平，促进成骨细胞的增殖和分化，提高细胞的代谢活力，延缓成骨细胞的凋亡，改善骨组织结构，达到防治骨质疏松的目的[5-8]。因此，本研究拟采用采用补肾健脾中药健骨颗粒干预不同性别不同年龄老年鼠，从雌激素调节TERT活性角度探讨健骨颗粒防治骨衰老机制的可能机制，为临床治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验药物

健骨颗粒由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、党参、山药等药味组成，原药材统一由福建省医药公司提供，福建中医药研究院中试车间负责加工制备，每克颗粒含原生药2.9 g。

1.2 实验细胞及动物

成骨细胞株ROS1728(由中科院上海细胞库提供)，3月龄清洁级雄性SD大鼠20只(由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供)用于制备含药血清。

1.3 实验试剂

低糖DMEM培养基、小牛血清、青/链霉素(新西兰Hyclone公司产品)，细胞碱性磷酸酶(AKP)染色试剂盒、ALP、BGP、 ColⅠ酶联免疫吸附测试试剂盒(上海西唐公司)，TRIZOL(MBI Fermentas公司)，PCR引物(博尚生物技术有限公司)，反转录试剂盒、SYBRPremix Ex TaqTMPCR Kit(日本TaKaRa公司)。ERα、TERT、c-MYC抗体(德国Calbiochem公司)；β-actin抗体(美国Cell Signaling公司)；WesternBreeze(美国invitrogen公司)；PVDF膜(Amersham公司)。

1.4 主要实验仪器

二氧化碳恒温培养箱(BB16/BB5060型，德国Heraus公司)，Olympus倒置相差显微镜(日本TKO光学仪器株式会社)，Du650紫外分光光度计(美国Beckman公司)，BT224半自动生化分析仪(意大利生物技术公司)，9600DNA扩增仪(美国PE生物系统公司)，7500型实时定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 ER抑制的大鼠成骨细胞株ROS1728细胞模型的建立：于37℃、5%的CO2培养箱中培养。细胞传代24 h后加药，药物(ICI182780) 溶解于二甲亚枫(DMSO)，终浓度为1×105mol/L。加药60 h后取细胞，采用Western Blot法检测干预后细胞中ERα的表达。

1.5.2 含药血清制备：取3月龄清洁级雄性SD大鼠30只，分别喂服健骨颗粒、生理盐水、雌二醇连续灌胃7 d，于最后1次灌胃后1 h腹主动脉无菌取血，常温下静置60 min，3000 r/min离心10 min后取同组血清混合，再离心1次，56℃灭活30 min，过滤除菌，-20℃保存备用。

1.5.3 分组：将ER抑制的大鼠成骨细胞株ROS1728细胞以1×105/mL传代接种于培养皿、培养瓶或培养板中，加入不含小牛血清的单纯DMEM培养基，饥饿24 h，使细胞同步化于G0或G1期，对照组为正常ROS1728细胞加入最佳浓度的生理盐水血清，模型组为ER抑制的ROS1728细胞模型，药物刺激组在ER抑制的ROS1728细胞加入最佳浓度的健骨颗粒颗粒含药血清，雌激素组在ER抑制的ROS1728细胞加入最佳浓度的雌二醇含药血清。

1.5.4 成骨细胞分泌ALP、BGP、 ColⅠ的测定：分别按各试剂盒说明书。

1.5.5 实时荧光定量SYBR GREEN法检测ERE、ERα、c-MYC、P53、Pot1、NF-κBmRNA的表达：收集连续培养3d细胞，采用实时荧光相对定量SYBR GREEN法检测。ERE引物：ERE引物序列：上游引物F：5’-AAGGAGCACCTCTCAAACC-3’，下游引物R：5’-AAATGGACTACAGCCGCTT-3’，产物长度：189bp；ERα引物序列：上游引物F：5’-ACCTCAAGATGTGCCACTC-3’，下游引物R：5’-TGCTCTCTCCAAACCAGAC-3’，产物长度：197bp； c-MYC的引物序列：上游引物F：5’-CTGATGAAGGAACCTCTGAGTT-3’ 下游引物R：5’-CTGACAGTTGATGCGAGTG-3’，产物长度：189bp；内参β-actin引物：上游5‘AGGCTGTGTTGT CCCTGTA3’，下游5‘ ATGTCACGCACGATTTCC3’，产物长度 193bp。采用Trizol法提取总RNA，抽提后的RNA加入溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果通过凝胶图像分析系统对条带进行分析；检验RNA无降解，测定RNA的吸光度值，计算出RNA的浓度，在根据浓度计算出体积后取RNA 500ng按试剂盒步骤进行反转录。反转录后在ABI7500上按照试剂说明进行mRNA扩增，得到扩增曲线与CT值。将得到的各组目的基因及β-actin基因的值分别代入各自的标准曲线，换算出各自的起始模板量。以β-actin作为参比基因对所有样品进行RNA校正，用待测基因的定量结果除以β-actin定量结果即可得到校正值。以阴性对照组mRNA的表达量作为“1”，再根据校正值计算出其他各组的相对量，进行组间相对量的比较。

1.5.6 Western Blot 检测TERT、ERα、c-MYC蛋白的表达：提取细胞的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，以每泳道30μg蛋白上样，进行12%十二烷基磺酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE), 电转移将胶上蛋白转印至PVDF膜。膜以封闭液室温封闭30 min。将与目的蛋白融合表达的标签抗体1∶5 000稀释，封闭膜1 h。每次 40 mL 洗液漂洗膜6次，即：1 min 2 次；20 min 2 次；5 min 2 次。然后将碱性磷酸酶标记的二抗室温封闭膜30 min，然后如前洗膜。将 AP化学发光底物与膜室温下孵育反应5 min，暗室中压X片曝光、显影。应用Phoretix 1D生物电泳图象分析系统分析胶片中的目的条带，计算机自动读取并记录每条带的光密度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 Western Blot 检测ER抑制的大鼠成骨细胞株ROS1728细胞模型的是否建立

用ICI182780干预ROS1728细胞后，Western blot分析目的蛋白的表达发现：模型组ERα表达呈阴性，而正常ROS1728细胞表达呈阳性，组间比较均有显著性差异(P<0.05)(见图1)。

图1 各组ERα蛋白表达1-正常ROS1728细胞组；2-模型组Fig.1 Expression of ER protein in each group

2.2 不同浓度含药血清促成骨细胞增殖

AlamarBlue检测绘制成骨细胞增殖曲线图，生理盐水血清组细胞随血清浓度增加增殖速度改变不明显，当浓度达到50%时，细胞增殖明显降低；健骨颗粒血清组细胞随血清浓度增加而增殖加快，并在含药血清浓度为20%时增殖速度最快；雌激素血清组细胞随血清浓度增加而增殖加快，并在含药血清浓度为35%时增殖速度最快；两组与同浓度生理盐水血清组比较差异有统计学意义(P<0.05)，随后随着血清浓度继续增加，其增殖速度下降(见图2)。因此确定20%健骨颗粒血清、35%雌激素血清组为促成骨细胞增殖最佳浓度。

图2 不同浓度不同组别血清对ROS1728增殖的影响Fig.2 Effect of different concentrations of serum on the proliferation of ROS1728 cells

2.3 细胞培养液中ALP、BGP、ColⅠ等信号因子的表达

采用不同血清干预成骨细胞后，ELISA法分析细胞液中的ALP、BGP、 ColⅠ发现：随着干预时间的延长，培养液中的三种信号因子的含量逐渐上升，各组内不同天数比较差异无统计学意义(P>0.05)。而组间比较显示：对照组3种信号因子的水平最高，雌激素组次之，健骨颗粒组再次之，模型组最低，各组比较有显著性差异(P<0.05)。(见表1-3)

表1 4组成骨细胞培养液中ALP的含量(μg/mL) Table 4 Content of ALP in osteoblast culture medium in the 4 groups (μg/mL)

注：与同期模型组比较，aP<0.05；与同期健骨颗粒组比较，bP<0.05；与同期雌激素组比较，cP<0.05；与同期对照组比较，dP<0.05

表2 4组成骨细胞培养液中BGP的含量 μg/mLTable 2 Content of BGP in osteoblast culture medium in the 4 groups (μg/mL)

注：与同期模型组比较，aP<0.05；与同期健骨颗粒组比较，bP<0.05；与同期雌激素组比较，cP<0.05；与同期对照组比较，dP<0.05

表3 4组成骨细胞培养液中ColⅠ的含量(μg/mL)Table 3 Content of Col I in osteoblast culture medium in the 4 groups (μg/mL)

注：与同期模型组比较，aP<0.05；与同期健骨颗粒组比较，bP<0.05；与同期雌激素组比较，cP<0.05；与同期对照组比较，dP<0.05

2.4 各组细胞中ERE、ERα、c-MYC基因表达

qPCR结果表明：健骨颗粒组及雌激素组的ERE、ERα、c-MYC、的RNA的表达均高于模型组，但低于对照组，且雌激素组的ERE、ERα、c-MYC表达高于健骨颗粒组，各组间比较差异有统计学意义(P<0.01)(见表4)。

表4 各组细胞中ERE、ERα、c-MYC的mRNA的表达结果±s)Table 4 mRNA expression of ERE, ER, and c-MYC ±s)

注：a与模型组比较，P<0.01；b与健骨颗粒组比较，P<0.01；c与雌激素组比较，P<0.01；d与对照组比较，P<0.01

2.5 各组细胞中TERT、ERα、c-MYC蛋白表达

4组TERT、ERα、c-MYC蛋白表达量情况以对照组的蛋白表达含量最高，雌激素组次之，健骨颗粒组再次之，模型组最低。各组比较均有统计学意义(P<0.05)(详见图3)。

图3 各组TERT、ERα、c-MYC蛋白表达1-模型组，2-健骨颗粒组，3-雌激素组，4-对照组Fig.3 Expression of TERT, ER, and c-MYC protein in each group

3 讨论

端粒酶是一种具有特殊逆转录酶活性的核糖核蛋白复合物，能保证染色体结构的稳定性和完整性、防止细胞的衰老和凋亡。而TERT是端粒酶起作用的关键结构，可通过逆转录端粒酶RNA模板序列，合成端粒DNA重复序列并添加到染色体末端，从而延长端粒长度。在TERT 启动子序列上有两个雌激素反应元件(ERE)通过雌激素受体α(ERα) 结合TERT基因启动子区域的ERE，激活TERTmRNA的转录进行[9-11]。在表达ER的细胞中，雌激素可与胞质内的ER结合，通过ERE直接激活端粒酶逆转录酶的表达[12]。此外在增龄性衰老过程中，TNF-α 基因表达和活性的抑制也与衰老具有时间相关性：TNF-α可通过端粒酶依赖机制，直接损伤DNA导致的端粒紊乱，降低端粒酶的活性导致端粒损伤来诱导细胞衰老、凋亡[13]；另外TNF-α可以通过诱导与NF-κB结合的TERT蛋白，由细胞浆转移到细胞核来调节端粒酶的活性。NF-κB被TNF-α激活后，调节其下游的靶点TERT，抑制其活性[14,15]。因此随着衰老、性腺功能降低，体内雌激素水平的下降导致TERT水平的降低，使骨组织中ER表达阳性的成骨细胞功能衰退，骨形成低于骨吸收，从而导致骨质疏松的发生。本实验采用ERα特异性抑制剂ICI182780阻断ROS1728细胞ERα表达后，模型组TERT、ERα、c-MYCmRNA及蛋白表达量均显著低于对照组(P<0.05)，同时模型组细胞中ALP、BGP、ColⅠ的含量也低于对照组，表明ER介导的TERT信号通路与成骨细胞功能衰退密切相关。

补肾健脾中药健骨颗粒是针对骨质疏松“肾亏脾虚”的病机特点，以“肾主骨”、“补先后天”理论为组方原则，选用煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、党参、山药等药物。方中煅狗骨味甘，性温，功能补益肝肾、活血通络；淫羊藿味辛甘，性温，与煅狗骨共奏补肾益精，强筋健骨之效。山茱萸味酸涩，性微温，酸涩主水，温能助阳，故能柔润助阴，补益肝肾，滋养精血而助元阳之不足，进一步增强煅狗骨、淫羊藿之补肾益精。党参、山药健脾益气，使气血生化有源，气旺则精足，精足则髓充，髓充则骨养，为肾中精气的充养提供来源。诸药合用，可通过补肾健脾，达到强筋壮骨之目的。在使用健骨颗粒含药血清后，随着干预时间的延长，培养液中的ALP、BGP、ColⅠ的含量逐渐上升。其中对照组3种信号因子的含量最高，雌激素组次之，健骨颗粒组再次之，模型组最低(P<0.05)。4组TERT、ERα、c-MYCmRNA及蛋白表达量情况以对照组的蛋白表达含量最高，雌激素组次之，健骨颗粒组再次之，模型组最低(P<0.05)。提示健骨颗粒通过补肾健脾，调节机体雌激素水平，提高成骨细胞ERα的表达，从而使TERT表达增强，提升了成骨细胞活性和功能，抑制成骨细胞的凋亡，促进骨重建过程中骨形成量的增加。

总之，健骨颗粒是通过影响雌激素介导的TERT及其相关因子的变化，从而促进成骨细胞分化及延缓细胞凋亡，是有效防治绝经后骨质疏松症的一个重要环节。