ω-3多不饱和脂肪酸对去势大鼠骨微结构的改善

杨敏 蒋红樱 何振坤 曾怡 白彝华* 陈良敬

1. 昆明医科大学第二附属医院肾脏内科，云南 昆明 650101 2. 温州市中心医院外科，浙江 温州 325000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减低和骨微结构退化导致骨脆性增加,骨折风险性增加为特征的一种疾病[1]。绝经后OP是骨质疏松症中最常见类型，与雌激素缺乏有关，并且约有 40%-50% 的50岁以上妇女可能发生绝经后骨质疏松性骨折[2]，严重影响绝经后女性健康。目前尚无有效的方法再生已经丢失的骨小梁，因此，有效地延缓骨量减少速度，对预防绝经后女性骨质疏松症和脆性骨折意义重大。ω-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)来源于深海冷水鱼类(如鲑鱼、鲭鱼、蹲鱼、金枪鱼等)，安全无毒，主要成员有二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)，目前在临床方面主要用于降脂、抗凝、免疫营养支持和抗炎等[3]。近期有研究表明，骨代谢[4]、骨质疏松[5]与ω-3 PUFA关系密切。骨强度取决于骨密度和骨质量，骨强度下降是OP的根本特点。但是骨密度仅反映了骨强度的70%[1]，并不能体现骨微结构，而后者是骨脆性的决定因素，可独立于骨密度而起作用[6]。目前的研究多限于ω-3 PUFA对骨密度及生物力学指标的影响[7,8]，有关ω-3 PUFA对骨微结构影响的研究极少。因此，本研究拟以去势雌性大鼠为研究对象，观察ω-3 PUFA对去势大鼠骨微结构的影响，为更好地防治绝经后骨质疏松提供一定的实验支持。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级11 w龄雌性大鼠30只，体重250±25 g，实验动物由上海西普尔-必凯实验动物公司提供，实验动物许可证号：SCXK(沪)2006-0010；动物使用许可证号：SXK(沪)2006-0010。整个实验中，所有大鼠自由进食和饮水，使用标准饲料，其中钙含量为1.33%，磷含量为0.95%。动物饲养环境温度为25±2℃，相对湿度50%～70%，12 h昼夜循环周期。ω-3 PUFA采用多烯酸乙酯胶丸，每粒含EPA乙酯和DHA乙酯(0.25g/丸)。国药准字H20003082，由厦门鱼肝油厂制造，产品批号为11354001。雌二醇(E2)试剂盒购于北京北方生物技术研究所。

1.2 分组及模型构建

所有雌性SD大鼠适应性喂养1 w后随机分为假手术组、模型组和实验组3组，每组10只。假手术组仅切除卵巢周围脂肪组织(卵巢大小)，其余两组切除双侧卵巢。

1.3 实验干预

术后恢复2 w开始干预。模型组和假手术组给予生理盐水灌胃，量为1 mL/(100 g·d)，实验组给予ω-3 PUFA，量为150 mg/(kg·d)，此剂量可改善生物力学性能、改善骨质高转换状态[8,9]。ω-3 PUFA与生理盐水混合，按照1 mL/(100g·d)的量灌胃，干预12 w。每周称量1次空腹体重，按体重调整用药量。

1.4 指标检测

干预12 w后，处死所有大鼠，经下腔静脉采血，4℃离心分离血清用于检测血钙、磷、碱性磷酸酶(ALP)和雌激素水平。钙、磷、ALP应用日本日立7080全自动生化分析仪测定。雌二醇采用放射免疫法测定，严格按使用说明操作。完整分离右侧整段股骨，剔除肌肉组织，10%甲醛固定液固定24 h，转75%乙醇过夜，应用micro-CT检测骨密度和骨微结构参数，后者包括松质骨骨微结构参数(骨小梁体积比率(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.n)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁间隙(Tb.sp)和皮质骨骨微结构参数(皮质体积比率(BV/TV)、皮质厚度(Cor·Th)和皮质骨的孔隙率。

1.5 统计学方法

使用SPSS16.0做统计分析，连续变量用平均数±标准差表示。在满足总体方差齐性、样本独立及正态分布的前提下，按照one-way ANOVA的方法对总体均数进行统计分析，两两比较采用SNK法。所有的检验均为双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验过程中，假手术组1只大鼠因术后感染死亡，模型组1只大鼠因麻醉药误入下腔静脉死亡，其余大鼠术后恢复及生活状态良好。实验结束时，各组大鼠总数为假手术组9只，模型组9只，实验组10只。

2.2 各组之间骨代谢指标和E2比较

各组大鼠血清钙、磷无显著性差异。模型组、实验组ALP水平均显著高于假手术组，见表1。E2在3组之间存在显著差异，表现为模型组水平最低，而假手术组水平最高，见表1。

表1 3组大鼠骨代谢指标和雌二醇比较±s)Table 1 Comparison of bone metabolism indexes and estradiol levels among three groups (±s)

注：ALP：碱性磷酸酶；与假手术组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05

Note:ALP:alkaline phosphatase; compared with Sham operation group，aP<0.05; compared with model，bP<0.05

2.3 ω-3PUFA对松质骨骨密度和骨微结构的影响

实验组松质骨骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N均显著低于假手术组，而Tb.Sp显著高于假手术组；实验组松质骨骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N均显著高于模型组，而Tb.Sp显著低于模型组，见表2。

表2 3组大鼠松质骨骨密度及骨微结构指标比较±s)Table 2 Comparison of bone mineral density and microstructure of cancellous bone among three groups(±s)

注：BV/TV：骨小梁体积比率；Tb.Th：骨小梁厚度；Tb.N：骨小梁数目；Tb.Sp：骨小梁间隙；与假手术组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05

Note:BV/TV:Trabecular bone volume ratio; Tb.N:trabecular number;aP<0.05,compared with Sham operation group;bP<0.05,compared with model

2.4 ω-3PUFA对皮质骨骨密度和骨微结构的影响

实验组皮质骨骨密度、BV/TV和Cr.Th均显著低于假手术组，而孔隙率显著高于假手术组；实验组皮质骨骨密度、BV/TV和Cr.Th均显著高于模型组，而孔隙率显著低于模型组，见表3。

表3 3组大鼠皮质骨骨密度及骨微结构指标比较±s)Table 3 Comparison of bone mineral density and bone microstructure among three groups(±s)

注：BV/TV：骨皮质体积比率；Cr.Th：皮质厚度；与假手术组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05

Note:BV/TV:Trabecular bone volume ratio; Cr.Th:cortical thickness;aP<0.05,compared with Sham operation group;bP<0.05,compared with model

3 讨论

绝经后雌激素水平降低，雌激素的缺乏破坏了骨吸收和骨形成的平衡，导致骨吸收速度超过骨形成速度，因此绝经后骨质疏松症属于高转换型骨质疏松。在本研究中，血清钙磷水平无差异，而模型组的ALP水平显著升高，提示骨形成增加，符合绝经后骨质疏松的机制[1]。随着对骨质疏松机制认识的加深，治疗骨质疏松症的药物研究也在不断深入和完善。ω-3PUFA属长链不饱和脂肪酸，目前在临床方面主要用于降脂、抗凝、免疫营养支持和抗炎等[3]。近期有ω-3PUFA治疗骨质疏松的报道，但是多从骨密度和营养的角度分析[7,9]。本实验以去势大鼠骨微结构作为切入点，探讨ω-3PUFA对骨质疏松症的防治作用。

高分辨率micro-CT是用于实验室测量末梢骨的超高分辨率CT扫描机，可显示桡骨和胫骨的小梁骨结构，并可对骨组织进行影像学三维重建和形态结构的分析，获取描述骨内部微结构的参数。micro-CT所测的骨微结构参数指标如骨容积、骨小梁数目等能够非常灵敏地反映骨质疏松的早期改变，甚至要早于传统的骨组织计量学的相应指标[6]。本研究即是应用该技术对3组大鼠的股骨进行扫描、重构和分析，测量其骨密度、皮质骨和松质骨骨微结构变化。结果表明，无论是松质骨还是皮质骨，实验组大鼠的骨量减少较模型组轻，这与近期国内外的研究[7,8,10]结果相似。本研究的一个重要结果是发现实验组骨微结构显著优于模型组，从骨微结构的角度证实ω-3PUFA对于骨质疏松的防治作用。通过降低骨量丢失和改善骨微结构，ω-3PUFA可改善骨矿密度和骨质量，从而提高骨强度，这对于预防骨质疏松及其最常见并发症脆性骨折均具有重要意义。国外已有动物实验[11]表明，ω-3 PUFA能够增加蛋鸡的骨强度，减少骨折发生。将来可进行临床试验进一步证实。

ω-3PUFA改善骨矿密度和骨质量的确切机制并不明确。Yao等[10]以去卵巢大鼠为研究对象并体外培养其破骨细胞，发现ω-3PUFA能够显著降低其抗酒石酸酸性磷酸酶活性，提示抑制破骨细胞的产生和活性可能是ω-3PUFA延缓去卵巢大鼠骨丢失的机制之一。Watkins 等[12]发现用EPA干预前成骨细胞系细胞MC3T3-E1 48 h后其骨形成标记物碱性磷酸酶水平显著高于花生四烯酸，提示促进成骨细胞作用可能是ω-3PUFA改善骨量和骨微结构的另一机制。本研究比较了3组大鼠的雌激素水平，发现实验组的雌激素水平较模型组有所改善，与钱康[7]的研究结果相似，提示改善雌激素水平也是ω-3PUFA防止骨质疏松的机制之一。

总之，本研究表明，ω-3 PUFA对去卵巢大鼠的骨微结构有一定的改善作用，这对于防治骨质疏松具有一定的意义。