1，25(OH)2D3对人骨肉瘤MG63细胞基质GLA蛋白及Wnt信号通路的影响

杨雅 谢菲飞 张洁 符刘晨 符晓玲 赖晓阳

1. 南昌大学第二附属医院内分泌代谢科，江西 南昌 330006 2. 赣州市立医院内分泌代谢科，江西 赣州 341000 3. 南昌大学第二附属医院骨科，江西 南昌 330006

骨质疏松是一种骨吸收与形成失衡，骨量减少，骨的微结构破坏，骨强度减退而脆性增加的退化性疾病，发病率随着年龄的增长而增加。维生素D与骨质疏松发病有密切联系。维生素D通过促进肠道和肾脏对钙和磷酸盐的吸收，这为骨基质的正常矿化提供了充足的矿物质。1，25(OH)2D3/维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)可以促进小肠上磷酸盐的吸收，特别是磷酸盐含量低时，能增加II型钠依赖性磷酸转运蛋白的表达[1]。此外，1，25(OH)2D3通过作用于成熟的成骨细胞/骨细胞上其同源受体增加LRP5活性促进骨形成，两者联合起来直接增加骨小梁量和皮质骨厚度[2]，而流行病学研究资料表明维生素D和骨密度密切相关。Li等[3]对25个研究进行Meta分析，总共4075名中国女性，发现中国绝经后女性的VDR Bsml和Apal多态性和骨密度有明显联系。Wang等[4]纳入3243名绝经后亚洲女性进行Meta分析发现VDR Fokl多态性与骨密度有关联，并可以和其他遗传标志物一起用于识别骨质疏松的高危人群。另外，维生素D可协同雌激素的作用[5]，调节成骨细胞样细胞的雌激素受体表达和雌激素介导的信号通路[6-7]，还可通过维生素D受体介导上调雌激素的合成[8]。

基质Gla蛋白(marix gla protein，MGP)是14Kda的N-末端γ-羧基化蛋白家族的成员，最初从牛骨骼中分离的维生素K依赖性循环蛋白，富含赖氨酸、谷氨酸残基，有84个氨基酸，其中包含了5个γ-羧基化的谷氨酸残基和一个双硫键[9-10]。Cancela等[11]使用MGP cDNA 探针克隆人类MGP基因，长3.9Kb，有4个外显子，3个长的内含子序列分隔的一种多功能细胞分化调控因子。在骨骼中MGP主要参与骨钙化调节。MGP基因敲除小鼠出现身材矮小，低骨量，骨质疏松、骨折[12]。日本、韩国等国家关于老年绝经后女性的研究发现MGP基因的多态性与女性绝经后骨质疏松症有密切联系[13]。以上结果均提示MGP可能在骨质疏松中有重要的作用。许多与成骨分化相关的蛋白或因子可调节体内MGP的表达。

笔者前期研究已证实1，25(OH)2D3促进原代SD大鼠颅骨成骨细胞及人骨肉瘤细胞MGP的表达[14]，但具体机制仍不清楚。许多研究已经证实了1，25(OH)2D3对Wnt /β-catenin信号传导通路有促进作用。在成骨细胞、人成骨样TE-85骨肉瘤细胞上，VDR可以通过增加β-catenin转录而调节Wnt信号通路，明显增强骨的合成代谢[10]但其具体机制仍不清楚。故本研究探讨1，25(OH)2D3是否通过Wnt信号通路调节MGP的表达来影响骨形成，为维生素D在骨质疏松的防治机制提出新理论奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人成骨肉瘤MG63细胞株购自美国培养保存中心(ATCC号：CRL1427)；活性维生素D，美国Sigma公司；DMEM培养基、I型胶原酶(collagenase type I)，美国 Solarbio公司；0.25%胰酶一ED’FA、胎牛血清，美国Gibco公司；25 em2细胞培养瓶、细胞培养板，美国Coming公司；一次性滤器，美国Millipor公司；RNAstore样本保存液、DP408 RNase-free水，天根生化科技有限公司；DP408-02 RNAiso Plus(D9108S)、PrimeScript@RT reagent kit(Perfect Real Time，DRR037S)、Premix Ex Taqll (Perfect Real TimeDRR039A)及PCR配套试剂，宝生物工程(大连)有限公司，DKK-1美国PeproTech公司；MGP、β-catenin、Runx2、LRP5、GAPDH引物，上海Invitrogen公司；Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)，美国Invitrogen公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：取10代人成骨肉瘤细胞MG63细胞株复苏，于含5%的CO2、37℃培养箱中培养，培养液为含有10%FBS的无酚红MEM培养液。细胞达汇片后按5×105细胞/瓶接种于25 cm2培养瓶，细胞培养液每2天换一次。

1.2.2 干预实验：药物干预：MG63细胞体积达到90%左右时，改用含0.1%BSA的无血清MEM培养液培养2d，(1)空白对照组：1%BSA+无酚红MEM培养；(2)10-8M 的1，25(OH)2D3组；(3)200 ng/ml DKK-1组；(4)10-8M 1，25(OH)2D3+200 ng/mlDKK-1组干预48 h。

1.2.3 荧光定量PCR：按Trizol操作步骤提取总RNA。逆转录合成cDNA：按照试剂盒(PrimeScript RT reagent kit，TaKaRa)要求操作，取9ulRNA样本做逆转录反应，反应体系20 ul，反应条件：37 ℃ 15 min 85 ℃ 5 s，1个循环，结束。荧光定量PCR反应：管家基因GAPDH作为内参基因，引物均由上海Invitrogen公司设计合成，引物序列见表1。优化反应体系，PCR反应条件：95 ℃预变性3 s,进入循环，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。每次实验均设置复孔，重复2次。Ct值代表每个样本2次重复的平均Ct值。比较目的基因与GAPDH基因的扩增效率的斜率有无显著性差异，如果没有，以GAPDH基因作为内参照，利用Ct值，应用比较阈值法，即2-△△CT,(2-△△CT所得结果即表示目的基因相对于对照组的倍数，公式为△△Ct=(CtMGP-CtGAPDH)实验组-(CtMGP-CtGAPDH)对照组。如果有显著性差异，按Rasmussen计算出相对表达差异。

表1 各基因的引物序列及产物的长度Table 1 Sequence of the primer of gene

1.2.4 Western-blot杂交：按照蛋白抽提试剂盒操作要求抽提总细胞蛋白，测蛋白浓度，取60 μg细胞总蛋白于SDS-PAGE胶中电泳，电湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶封闭2h，敷育一抗过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗敷育2 h，化学发光增强试剂自显影，洗片显带，杂交信号用Imagemaster VDS成像分析系统行吸光度检测。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 1,25(OH)2D3对MG63细胞MGP蛋白表达的影响

Western-blot结果显示(如图1)：使用1,25(OH)2D310-8mol/l、DKK1 200 ng/ml时，MGP蛋白的表达分别是对照组的1.21倍、0.86倍，差异有统计学意义(P<0.05)。与1,25(OH)2D3相比，与DKK1联用时MGP蛋白的表达下降0.87倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 1,25(OH)2D3对MG63细胞Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白表达的影响

2.2.1 1,25(OH)2D3及DKK-1对MG63细胞β-catenin蛋白表达的影响：1,25(OH)2D3作用于MG63细胞以后，能明显提高β-catenin的表达，是对照组的1.13倍，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。DKK-1 200 ng/ml作用于细胞以后，能明显下调β-catenin的表达0.87倍。DKK-1与1,25(OH)2D3联用β-catenin蛋白的表达下调0.93倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 western-blot 检测1，25(OH)2D3及DKK-1对MG63细胞MGP蛋白表达的影响(*P<0.05与对照组相比，**P<0.05与1，25(OH)2D3组相比)Fig.1 The effect of 1,25(OH)2D3 and DKK-1 on the expression of MGP protein in MG63 cells, detected by western-blot(*P<0.05 compared with the control group,**P<0.05 compared with the 1,25(OH)2D3 10-8 mol/l group)

图2 Western-blot 检测1，25(OH)2D3及DKK-1对MG63细胞β-catenin表达的影响(与对照组相比*P<0.05，与1，25(OH)2D3组相比**P<0.05)Fig.2 The effect of 1,25(OH)2D3 and DKK-1 on the expression of β-catenin protein in MG63 cells, detected by western-blot(Compared with the control group*P<0.05, compared with the 1,25(OH)2D3 10-8 mol/l group**P<0.05)

2.2.2 1,25(OH)2D3对MG63细胞LRP5蛋白表达的影响：1,25(OH)2D3作用于MG63细胞以后，能明显提高LRP5的表达，分别是对照组的1.14倍，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。DKK-1 200 ng/ml作用于细胞以后，能明显下调LRP5的表达0.87倍。DKK-1与1,25(OH)2D3联合用于LRP5蛋白的表达下调0.92倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 1,25(OH)2D3及DKK-1对MG63细胞Runx2蛋白表达的影响

1,25(OH)2D3作用于MG63细胞以后，能明显提高Runx2的表达，是对照组的1.17倍，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。DKK-1 200 ng/ml作用于细胞以后，能明显下调Runx2的表达0.86倍。DKK-1与1,25(OH)2D3联用Runx2蛋白的表达下调0.87倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 1,25(OH)2D3对人骨肉瘤MG63细胞Wnt/β-catenin信号通路中相关基因及MGP基因表达的影响

1,25(OH)2D310-8mol/L作用于MG63细胞以后，能明显提高β-catenin、Runx2、LRP5、MGP基因的表达，分别是对照组的2.73倍、3.72倍、1.53倍、2.31倍，差异有统计学意义(P<0.05)，如图5所示。DKK-1 200 ng/ml作用于细胞以后，能明显下调β-catenin、Runx2、LRP5、MGP基因表达，分别是对照组的0.34倍、0.52倍、0.42倍、0.78倍，表达有显著差异(P<0.05)。DKK-1与1,25(OH)2D3联用与单独使用1,25(OH)2D3相比，β-catenin、Runx2、LRP5、MGP的表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)。

图5 实时荧光定量PCR检测1，25(OH)2D3及DKK-1对MG63细胞β-cateninm、Runx2、LRP5及MGP基因表达的影响(与对照组相比*P<0.05，与1，25(OH)2D3组相比**P<0.05)Fig.5 The effect of 1,25(OH)2D3 and DKK-1 on the expression of β-cateninm, Runx2, LRP5 and MGP mRNA in MG63 cells, detected by real time RT-PCR (Compared with the control group*P<0.05, compared with the 1,25(OH)2D3 10-8 mol/l group**P<0.05)

3 讨论

维生素D是一种惟一由相应的维生素D原经阳光照射由皮肤合成的脂溶性维生素。维生素D对维持骨健康和骨骼功能方面有着重要的作用。成骨细胞上维生素D受体的过表达可影响成骨细胞的生长和分化，从而刺激骨细胞的骨形成和矿化，促进人间充质干细胞和基质细胞成骨分化[15]。体内活性维生素D抑制骨吸收可能存在两种机制：一是体内长期活性维生素D可能影响钙的内分泌系统，它以一种复杂的方式抑制成骨细胞上RANKL表达。二是活性维生素D可能降低成骨细胞上RANKL的活性或诱导成骨细胞的细胞结构变化[15]。Lisse等[16]研究发现mi RNA在维生素D对成骨细胞分化和功能的微调效应中起关键作用。近来还发现维生素D受体基因多态性与绝经后骨质疏松的发展有关。随着研究的深入，笔者推测维生素D对骨代谢可能存在新的机制。

MGP是血管和软骨组织钙化的抑制剂。在血管钙化病变中发现MGP调节成骨细胞和软骨细胞的分化[17]。近年的研究证实MGP与绝经后骨质疏松症有着千丝万缕的联系。笔者的前期动物实验发现使用雌激素干预去卵巢SD大鼠后大鼠腰椎血清、尿液MGP水平升高，骨密度也增加，由此提示骨密度的增加可能与血清MGP水平的增加有关，两者之间有密切联系[18]。PTH、维生素K、雌激素等治疗骨质疏松症的药物能调节MGP的表达[14]。Tuón-Le Poultel等再次证实了男性MGP基因变异可能预测骨量丢失进展的高风险[19]。以上临床研究均提示MGP与骨密度存在密切联系。本研究中使用10-8M 1,25(OH)2D3干预骨肉瘤MG63 48h后，与对照组相比MGP蛋白及基因的表达增加。前期研究也显示1,25(OH)2D3呈剂量依赖性增加原代SD大鼠颅骨成骨细胞MGP mRNA的表达[14]。James等[20]通过放射免疫法及Northern blot技术检测证实1,25(OH)2D3能呈浓度和时间依赖性刺激骨肉瘤细胞株UMR106-01、ROS 25/1、ROS 25/4的MGP mRNA表达，经1,25(OH)2D3干预后MGP表达增加6～15倍。以上研究结果均与本研究一致，1,25(OH)2D3可上调MGP的表达。原代成骨细胞及本研究的细胞株体外实验结果共同证实了维生素D对可调节MGP的表达，但1,25(OH)2D3具体通过何种途径调节MGP的表达尚不清楚。

Wnt/β-catenin信号通路对骨代谢有非常密切的联系[21-22]。Wnt信号通路可间接调节破骨细胞功能及抑制分化并促进成骨细胞分化，维持正常骨密度和骨矿物沉积。β-catenin、LRP5等相关因子的丢失可能是骨质疏松发生的重要原因。近年研究发现Wnt/β-catenin信号通路与绝经后骨质疏松症相关。1,25(OH)2D3可以增加Wnt/β-catenin信号通路中相关因子β-catenin、LRP5、Runx2的表达。本研究中使用10-8M 1,25(OH)2D3干预骨肉瘤MG63细胞 48h后，与对照组相比Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin、LRP5、Runx2蛋白及基因的表达都增加了，由此提示1,25(OH)2D3可上调骨肉瘤MG63细胞中Wnt/β-catenin信号通路中相关因子的表达。本研究结果与Royan等[27]结果一致，不仅发现1,25(OH)2D3可促进Wnt/β-catenin信号通路中相关因子的表达，而且还发现在促进β-catenin、Runx2表达的同时，也上调了MGP的表达。1,25(OH)2D3可通过促进Wnt/β-catenin信号通路的核心β-catenin与T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)整合而上调Runx2，促进间充质前体细胞的成骨细胞分化，并可通过Wnt刺激成骨细胞释放OPG，降低RANKL的表达，因此也降低破骨细胞生成和破骨细胞的激活、促进破骨细胞的凋亡从而促进骨的合成代谢、抑制骨的吸收[23-25]，这可能是维生素D维持骨量和骨骼强度的机制之一，维生素D有可能通过影响Wnt/β-catenin信号通路调节MGP的表达。

近来生化和遗传研究认为，DKK1作为Dickkopf家族中的一员，是一种天然的可溶性Wnt信号通路抑制剂，直接或间接通过与受体复合物的LRP5/6竞争性结合抑制Wnt信号通路，破坏成骨细胞分化。DKK1作为β-catenin/TCF途径的下游目标，参与了Wnt信号通路的负反馈[26]。DKK1缺失的人和鼠可导致骨形成的增加[27]。转基因大鼠过度表达Wnt蛋白拮抗因子DKK1可出现成骨细胞数目的急剧下降，也降低了骨钙素的表达[28]。为进一步证实笔者的推论，使用DKK1从另一方面验证Wnt/β-catenin信号通路是否对MGP存在影响。DKK1组与对照组相比，抑制β-catenin、Runx2、LRP5表达的同时也下调了MGP的表达，由此提示Wnt/β-catenin信号通路受到DKK1抑制时，MGP的表达也下调，MGP的表达可能受到了Wnt/β-catenin信号通路的影响。Alfieri等[29]使用成骨细胞培养基和Wnt拮抗剂sFRP3共同培养主动脉瓣膜间质细胞后可减弱对MGP的诱导表达，主动脉瓣间质细胞Wnt信号通路的增加可导致骨膜蛋白和MGP的表达。Fazenda等[30]在体内、外实验都证实了MGP是Runx2的主要靶基因，外源性Runx2过表达可上调MGP转录和表达。本研究结果与之前研究结果均提示Wnt/β-catenin可影响MGP的表达，但具体机制有待进一步证实。

由此可见，维生素D可同时促进Wnt/β-catenin信号通路中相关因子及MGP的表达，而Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK1则抑制信号通路同时下调MGP的表达，推测维生素D可能通过Wnt/β-catenin信号通路调节MGP的表达，这可能为维生素D对于防治骨质疏松症机制研究提供了新方向，但深入的机制仍需有待进一步研究。