伊班膦酸钠对大鼠膝骨关节炎关节软骨及软骨下骨的影响

李能 廖瑛, 廖源 孙光华 李新红 周君*

1. 南华大学附属第一医院骨科，湖南 衡阳 421001 2. 南华大学附属第一医院康复科，湖南 衡阳 421001 3. 广州中医药大学针灸推拿康复临床医学院，广东 广州 510405 4. 湖南环境生物学院护理学院，湖南 衡阳 421005

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种十分常见的退变性关节疾病，几乎涉及关节的所有组织，包括关节软骨、滑膜、软骨下骨及周围软组织的结构改变，关节的生物力学及生物化学环境发生改变，最终使关节软骨变薄、糜烂；严重时可出现裂隙、溃疡及全层关节软骨面消失等现象[1]。其病理特点是关节软骨变性、破坏，软骨下骨反应性增生及硬化，并伴随骨赘形成[1]。同时，有基础研究[2]表明：丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信号通路参与骨关节炎的发生与发展过程。其主要包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)、C-jun N末端激酶(c-Jun)和p38激酶(p38)。3种亚型可独立或同时被激活[3]。近来有研究[4]发现：双膦酸盐药物有抗骨质疏松，保护关节软骨的作用，但具体作用机制尚不明确。在本实验中，我们观察伊班膦酸钠对关节软骨及软骨下骨影响，同时探讨伊班膦酸钠治疗骨关节炎的机制，为临床应用伊班膦酸钠治疗骨关节炎提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

三月龄雄性SD大鼠30只，平均体重362.0g，由南华大学动物部提供。

1.2 主要仪器设备和试剂

主要试剂：伊班膦酸钠(艾本；河北医科大学生物医学工程中心)；引物合成及探针修饰：上海生物工程有限公司；Taq DNA PCR反应试剂盒；TAKARA大连宝生 批号ck3501AA； Trizol：美国invitrogen批号50563209；dNTP：购自美国普洛麦格(Promega)公司；批号251230；DNA分子量标准(DNA Marker：Marker I，显示条带：100、200、300、400、500、600bp)，购自北京TIANGEN公司。②主要仪器：奥林巴斯光学显微镜(日本)；FTC2000实时荧光定量基因扩增仪，加拿大枫岭(FUNGLYN)公司；MSE Micro-Centaur Centrifμge微型台式离心机，日本Sanyo公司；Micro-CT，广州中科恺盛医疗科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组：采用随机生成数字表分成3组，假手术组、ACLT组(切断右前交叉韧带骨关节炎组)、治疗组(切断右前交叉韧带致膝骨关节炎+伊班膦酸钠治疗组)，每组10只。参照文献[5]：ACLT组及治疗组均采用切断大鼠的右侧前交叉韧带方法(ACLT术)建立膝关节炎动物模型。假手术组只切开关节腔，不切断前交叉韧带。术后不固定老鼠，允许自由活动。温度(20～26℃)，湿度为60%～70%， 12 / 12h的光/暗循环，自由饮水和饮食。实验程序符合《动物保护法》中华人民共和国(2001)。手术后1 w，治疗组：予以伊班膦酸钠10 μg/kg, 腹腔注射,每周1次,共12 w；ACLT组：予以等量生理盐水, 腹腔注射,每周1次,共12 w；假手术组：不予以特殊处理。

1.3.2 检测指标：①使用显微CT技术观察软骨下骨：Micro-CT扫描及定量分析实验周期完成后，采用颈椎脱臼法处死大鼠。并取大鼠的右侧胫骨近端于40 g/L多聚甲醛中固定。再将大鼠胫骨近端放置于Micro-CT的工作槽中。其中，Micro-CT的扫描参数为：旋转角度为220°，其增量为0.6°，分辨率45.0 μm，曝光时间为3000 ms，每层的间距为16 μm。对同一样本获得大概200张不同横截面图像。并对骨组织行定量分析，具体分析指标如下：骨体积分数(bone volμme fraction, BV/TV)以%表示；骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)以像素值表示；骨小梁数量(trabecular nμmber, Tb.N)以 1/像素值表示；骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)以像素值表示。②关节软骨组织光学显微镜观察和改良Mankin评分：完成Micro-CT检测后，取右侧胫骨近端标本，使用20%EDTA二钠(pH 7.15)溶液浸泡，至组织完全脱钙。再经乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡后切片。切片常规脱蜡、自来水冲洗。0.5%番红O染液滴染1 min，再采用95%乙醇分化，风干，二甲苯透明，最后中性树胶固定。显微镜下然后观察各组右胫骨平台软骨组织学形态改变。并根据Mankin评分标准[6]，从不同方面对关节软骨的损伤进行评估。包括：软骨外观改变、软骨细胞数、软骨钙化层和软骨下骨改变、潮线的形态变化等方面。③使用RT-PCR 技术检测mRNA表达：取SD大鼠右侧膝关节股骨端关节软骨为材料。用Trizol试剂提取总关节软骨RNA，取总RNA 5 μL，在20 μL的逆转录体系中合成cDNA，以5 μL cDNA为模板加入靶基因上下游引物，在50 μL体系中进行PCR扩增。本实验中以“β-actin”(肌动蛋白)为内参基因。引物序列见表1。

表2 不同组别的显微CT定量分析表±s)Table 2 Quantitative analysis micro-CT of different groups(±s)

注：与假手术组比较，*P<0.05,**P<0.01；与ACLT组比较，#P<0.05,##P<0.01

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 Micro-CT及骨组织定量分析

通过Micro-CT及骨组织定量分析可见：与假手术组相比，ACLT组的BV/TV、Tb.N显著降低，差异具有统计学意义(分别为P<0.05、P<0.05)，Tb.Th两组之间差异无明显统计学意义，而Tb.Sp显著增高，差异具有统计学意义(P<0.01)；治疗组的BV/TV、Tb.N明显高于ACLT组，差异具有统计学意义(分别为P<0.05、P<0.05)，Tb.Th两组之间差异无明显统计学意义，同时治疗组Tb.Sp明显小于ACLT组，差异具有统计学意义(P<0.05)。详细见图1及表2。

图1 各组Micro-CT图像 a假手术组 bACLT组 c治疗组Fig.1 Micro-CT images of each group. a Sham-operated group; b ACLT group; c Treatment group

2.2 软骨形态学比较及软骨mankin评分

假手术组：软骨细胞基本正常；ACLT组：关节软骨细胞结构紊乱，中度以上增生，潮线模糊，并可见纤维变形和裂隙存在；治疗组：软骨及基质排列尚有一定规律，关节软骨变薄，轻微的表面粗糙。ACLT组Mankin评分较假手术组显著增高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与ACLT组相比，治疗组Mankin评分显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。详细见图2、表3。

图3 不同组别MMP-13、C-JUN、ERK1及P38相对表达量 A.MMP-13相对表达量；B.C-jun相对表达量;C.ERK-1相对表达量;D.P38相对表达量与假手术组比较，** P<0.01；与ACLT组比较，## P<0.01Fig.3 The relative expression levels of MMP-13, C-JUN, P38, and ERK-1 in each groupA The relative expression levels of MMP-13; B The relative expression levels of C-JUN; C The relative expression levels of ERK-1; D The relative expression levels of P38

图2 各组软骨组织形态学比较(番红染色×100倍) a假手术组 bACLT组 c治疗组Fig.2 Comparison of cartilage tissue morphology among the group. (saffron-stained, ×100). a Sham-operated group; b ACLT group; cTreatment group.

组 别Mankin 评分假手术组0.67±0.707ACLT组 7.30±1.636 **治疗组 3.80±1.317 ##

注：与假手术组比较，**P<0.01；与ACLT组比较，##P<0.01

2.3 C-JUN、ERK1、P38及MMP-13的mRNA表达水平

本实验计算扩增循环数(Ct值)，mRNA的相对表达量使用标化后2-△△Ct值来表示，计算基因初始拷贝数的相对量。与假手术组相比，ACLT组中的 C-JUN、ERK1、P38、MMP-13mRNA表达水平明显高于假手术组，差异具有统计学意义(分别为P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01)；与ACLT组相比，治疗组中的C-JUN、ERK1、 P38、 MMP-13mRNA表达水平明显降低，差异具有统计学意义(分别为P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01)。具体见图3，如下。

3 讨论

在英国、美国约有5%～10%成年人患有膝关节炎；仅在美国，2009年因骨关节炎导致的髋、膝人工关节置换手术的医疗费用就高达423亿美元[7]。而在我国，有流行病学的调查研究表明：有症状的 OA 患病率约在 5.1%～20.8%之间[8]。随着中国人口老年化，OA这一问题也将越来越突出，严重影响人们的生活质量，社会医疗支出巨大，给个人、家庭、乃至社会带来沉重的负担。因此，探讨OA的有效治疗方法及作用机制具有重要的经济及社会价值。

OA的发病机制十分复杂，其中炎症细胞因子、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)、软骨下骨的重建失衡可能在骨关节炎致病过程中起了重要作用[9]。目前一致认为：在OA的早期，软骨下骨的重建以骨吸收为主[10, 11]；而在OA的后期，软骨下骨的重建以骨形成为主，并最终出现软骨下骨硬化[12]。本实验使用腹腔注射骨吸收抑制剂伊班膦酸钠，在OA发展的早期抑制骨吸收，恢复软骨下骨生物力学效应，并同时观察关节软骨的变化。

本实验通过Micro-CT发现：ACLT组软骨下骨骨小梁较假手术组稀疏，部分骨小梁可见结构紊乱。而治疗组软骨下骨骨量虽然也伴有稀疏，但较ACLT组排列有序。同时通过骨组织定量分析显示：与假手术组相比，ACLT组的BV/TV、Tb.N显著降低，而Tb.Sp显著增高。说明ACLT组的骨小梁数量及其连接密度下降，存在骨质疏松现象。骨质疏松使得骨损伤发生概率增加，反复多次的骨损伤可导致骨形成启动，骨形成使得软骨下骨发生硬化，生物力学强度下降，关节软骨发生损伤，最终加速OA的发展。我们从上述实验结果可以看出，在OA发生发展过程中，软骨下骨扮演着重要角色。

OA中软骨下骨与关节软骨的串联增强[13]，使得软骨下骨有可能成为治疗OA的新作用靶点[10]。基础研究发现通过抑制软骨下骨重建[14]，可减缓关节的退变，从而使得骨性关节炎得到一定的缓解。而双膦酸盐类药物[15]可通过对破骨细胞的调控，阻碍其皱褶边缘形成而切断破骨细胞对于骨质的吸收与破坏，从而在OA早期抑制软骨下骨的骨质疏松，达到治疗或改善OA的目的。在本实验中：治疗组与ACLT组相比，BV/TV、Tb.N显著增高，Tb.Sp显著降低。说明伊班膦酸钠能抑制软骨下骨的骨质疏松，改善软骨下骨的生物力学性能，从而延缓关节软骨退变。而且，在本实验中：ACLT诱导软骨细胞及细胞外基质发生病理性紊乱，纤维组织增生；同时，Mankin评分显著增高，而伊班膦酸钠显著抑制关节软骨退变，使得Mankin评分降低。

目前，大多数研究人员一致认为：OA是在力学和生物学等多种因素共同作用下，软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨三者结构和功能失衡的结果[16]。其中关节软骨细胞外基质的降解是导致骨关节炎发生的重要特征[17]，而MMPs就是在细胞外基质的生理性和病理性降解中起重要作用的蛋白酶超家族，它广泛地存在于各种组织及细胞中。既往研究发现：在发生骨关节炎的过程中，MAPKs信号通路占据着重要角色[18-20]，它不仅能够调节软骨的成熟[21]，而且也能调控软骨细胞外基质的降解[16]，影响软骨下骨的重建。而MAPKs及其亚型均可在软骨细胞中表达，并可对MMPs的表达进行调控[22, 23]。目前，在基质金属蛋白酶家族成员中，MMP-13被认为是关节软骨在病理生理过程中与MAPKs信号通路联系最紧密的[2, 24-27]。此前使用人类细胞的研究中，肿瘤坏死因子(TNF)刺激OA软骨细胞中MMP-13的表达量增加是通过MAPK 44/42和JNK途径来实现的[19]。MMP-13能够降解软骨细胞外基质中最具有特征且含量最多的II型胶原。所以，软骨外基质中II型胶原的变化情况可以通过MMP-13的表达量来反映[28]。在本实验中：ACLT组中的MAPKs信号通路(C-JUN、ERK1、 P38)表达量及MMP-13表达水平明显高于假手术组，说明骨关节炎发生时，MAPKs信号通路被激活；而与ACLT组相比，治疗组的MAPKs信号通路(C-JUN、ERK1、P38)表达量及MMP-13水平同样明显降低，表明说明在使用伊班膦酸钠后，MAPKs信号通路被抑制，从而调控MMP-13的表达减少，减轻了关节软骨的退化，起到了保护软骨下骨及关节软骨的作用。其可能的机制为：伊班膦酸钠通过对MPAKs信号通路的抑制，使得MMP-13表达减少，从而II型胶原形成的网络结构分解较少，同时抑制了破骨细胞的效应，延缓了OA早期的骨吸收效应，使得骨小梁数量及密度增加，骨小梁间隔变窄，软骨下骨的骨质疏松得到改善，最后达到延缓或治疗OA的效应。

综上，本实验行ACLT术可使SD大鼠出现典型的骨关节炎的表现，同时也可以看到软骨下骨发生骨质疏松改变。使用伊班膦酸钠不仅可以改善软骨下骨的微观结构，抑制软骨下骨的骨质疏松，而且还可减少软骨细胞外基质的降解，抑制关节软骨退变。伊班膦酸钠可能通过调控MAPKs信号通路的机制缓解大鼠膝骨关节炎关节软骨退变，并且抑制软骨下骨的骨质疏松。因此，伊班膦酸钠可能成为治疗OA的潜在性药物之一。