中医不同治法对绝经后骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)含量影响的比较研究

金成日 姜奥 杨芳

1. 辽宁中医药大学附属第四医院，辽宁 沈阳 110100 2. 沈阳市第五人民医院，辽宁 沈阳 110023 3. 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。随着老龄化社会的到来，骨质疏松症将会越来越引起人们的重视。中医药在防治骨质疏松症方面具有副作用小、费用低、远期疗效较佳的优势，通过改善全身情况以提高患者的生活质量。临床上常用的中医治疗骨质疏松症的方法有补肾方法、健脾方法、活血化瘀方法等。

本研究采用分子生物学实验方法，通过研究骨质疏松症大鼠的骨骼、骨骼肌甲状旁腺激素相关肽(parathyroid hormone-related peptide，PTHrP)含量变化，观察补肾方法、健脾方法、活血化瘀方法对骨质疏松症的防治效果和作用机制的异同。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

实验选用清洁级Wistar雌性大鼠60 只，体重(200±50)g，4～5月龄，未曾交配，实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物质量合格证明号：1100170659。

先将术前大鼠按照随机分组的方法分为正常组(8只)、手术组。摘除大鼠双侧卵巢的方法复制绝经后骨质疏松症模型。术后7d 将手术组存活的大鼠随机分为4组(每组8只)，即：模型组、补肾方法组(简称补肾组)、健脾方法组(简称健脾组)、活血方法组(简称活血组)。

1.2 药品

补肾组用药左归丸，制备方法：按大鼠每千克体重一日药量计算，熟地2.52 g，山药1.26 g，枸杞子1.26 g，山茱萸1.26 g，川牛膝1.26 g，菟丝子1.26 g，鹿角胶(河南老君堂制药有限公司) 1.26 g，龟板胶(河南老君堂制药有限公司，国药准字241020792) 1.26 g，打碎、烊化，混合上述颗粒剂，加20 mL 水。健脾组用药补中益气颗粒(北京汉典制药有限公司)。活血组用药身痛逐瘀汤(辽宁中医药大学附属医院)。

1.3 主要试剂

PTHrP试剂盒(AMEKO 公司)内含：96微孔板、一抗液、样品稀释液、酶标抗体液、底物稀释液、洗涤液。

1.4 主要仪器设备

多功能酶标仪(型号：Infinite M200)、低温高速离心机(型号：MR1822)。

1.5 实验方法

1.5.1 造模：用10%的水合氯醛将实验大鼠肌肉注射麻醉，麻醉后的大鼠采用俯卧位姿势固定于手术台上，从腰背部脊柱两侧做纵行切口切开皮肤及肌肉，摘除两侧卵巢组织后逐层缝合，关闭创口。正常组不手术。

1.5.2 给药：术后7 d开始给药，每日上午灌胃1次，连续灌胃12 w。上述补肾组、健脾组和活血组的大鼠每日用药量按成人用药量的6.3倍计算。正常组和模型组以等量0.9%的氯化钠溶液灌胃。灌胃期间，每周一对大鼠称重一次，按照体重调整给药剂量。

1.5.3 取材：实验大鼠在第12 周灌胃后，禁食24 h 后取材。实验大鼠用10%的水合氯醛肌肉注射麻醉后取材。无菌条件下，取大鼠右后肢股骨，剔除附着的肌肉筋膜，保留骨膜，生理盐水冲洗后，用生理盐水浸润后的医用纱布包裹，再用预先准备的锡纸包裹后置-70℃冰箱冻存，待骨密度测定。取大鼠右后肢腓肠肌的白肌部分和左右后肢的全股骨，并放入高压灭菌的EP管内，做好标记，放入-70℃冰箱保存备用。

1.6 检测指标及方法

应用XR-26型双能X线骨密度仪(美国NORLAND公司)，及其所附带的“The Small Subject Scout Scan”软件，测定大鼠离体股骨上1/3的骨密度(g/cm2)。

采用ELISA 法检测大鼠骨骼、骨骼肌PTHrP含量，用酶联仪在450 nm 波长依序测量各孔的吸收度(OD值)，绘制标准曲线，计算样品的实际浓度。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 检测各组大鼠左后肢股骨骨密度结果

与正常组比较，模型组大鼠离体股骨上1/3骨密度极显著降低(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组大鼠股骨上1/3骨密度均有不同程度的升高(P<0.01)，其中以补肾中药组升高最为显著。见表1。

2.2 检测各组大鼠骨组织PTHrP含量结果

与正常组比较，模型组大鼠骨骼的PTHrP含量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，补肾组、健脾组、活血组骨骼的PTHrP含量明显升高(P<0.01)，其中补肾组升高程度比较明显。见表2。

表1 各组大鼠离体股骨上1/3骨密度值比较±s)Table 1 Comparison of bone mineral density at the 1/3 region of the isolated femur of rats in each group(±s)

注：与正常组比较：*P<0.01；与模型组比较：▲P<0.01。

表2 各组大鼠骨组织PTHrP含量±s)Table 2 Comparison of bone tissue PTHrP content of±s)

注：与正常组比较：*P<0.01；与模型组比较：▲P<0.01。

2.3 检测各组大鼠骨骼肌PTHrP含量结果

与正常组比较，模型组大鼠骨骼肌的PTHrP含量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，补肾组、健脾组、活血组骨骼肌的PTHrP含量明显升高(P<0.01)，其中健脾组升高程度比较明显。见表3。

表3 各组大鼠骨骼肌PTHrP含量±s) Table 3 Comparison of skeletal muscle PTHrP content of±s)

注：与正常组比较：*P<0.01；与模型组比较：▲P<0.01。

3 讨论

3.1 中医学对骨质疏松症发病的认识

根据骨质疏松症的腰脊疼痛、胫膝酸软、易骨折、足跟疼痛等临床表现，中医学将其归属于“骨痿”、“骨痹”的范畴。在《黄帝内经》中，首载“骨痿”之病名，《素问·痿论》中提到：“肾主身之骨髓……肾气热、则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”“肾者水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿。”可以看出肾虚是骨质疏松症的病理机制的关键，从肾论治骨质疏松症是中医治疗本病的基本原则。

中医学认为“脾肾相关”，而骨骼与肌肉关系密切，肾藏精主骨，脾主四肢肌肉。若脾胃亏虚，水谷精微化生不足，肌肉得不到水谷精微的充养，而肾失所藏，后天之精又不得滋养，肾精不足，筋骨失养，则骨骼与肌肉协调性下降而骨痿不用。《黄帝内经》中的《灵枢·经脉》篇就提到：“足少阴气绝，则骨枯。少阴者，冬脉也，伏行而濡骨髓者也，故骨不濡，则肉不能着也；骨肉不相亲，则肉软却；肉软却，故齿长而垢，发无泽；发无泽者，骨先死。”可以看出肌肉痿软无力，影响骨骼的生长发育，可导致骨枯髓减而发病为“骨痿”。

清代医家王清任在《医林改错》中提到：“元气既虚，必不能布于血管，血管无气，必停留而瘀”。说明老年人肾精不足，血液运行不畅，容易形成病理产物之瘀血，疼痛是瘀血致病的典型症状之一，骨质疏松症患者最常见的症状便是疼痛，因此血瘀也被认为是本病发生的常见因素之一。

3.2 PTHrP含量的变化对骨质疏松症的影响

PTHrP可表达于皮肤、骨髓、脑、心血管、甲状腺、甲状旁腺和骨等多种组织，通过自分泌、旁分泌等方式发挥不同的生理作用。PTHrP的结构比较复杂，可以由激素原转化酶家族加工为3个功能片断，即氨基酸末端PTHrP(1-36)、中间片断的PTHrP(38-94)、以及羧基端的PTHrP(107-139)[1]。目前PTHrP在骨细胞代谢、恶性肿瘤及心血管疾病中的作用研究相对较多。

PTHrP可保持软骨细胞增殖和延迟软骨细胞分化和程序性死亡，促进髁突生长发育。Ihh 通过促进 PTHrP的表达，同时 PTHrP 也可通过自分泌或旁分泌细胞内因子激活其受体保持细胞增殖，降低有增殖潜能的软骨细胞向肥大的软骨细胞转化，因而抑制软骨细胞的终末分化。当 PTHrP不足以刺激软骨细胞增殖时，软骨细胞开始分泌Ihh，从而反馈性上调 PTHrP 的表达水平，该反馈环路协调软骨细胞的增殖和成熟[2-4]。有研究表明PTHrP(1-36)是PTHrP的保守分泌形式，可以促进肾脏钙的重吸收和延缓骨质疏松的发生[5]。相关体内外实验研究表明，PTH/PTHrP的短暂作用会使成骨细胞的Runx2 无论在蛋白水平还是mRNA 水平都升高，而Runx2是一个重要的促进间叶细胞向成骨细胞家族转化的转录因子[6-8]。也有相关研究表明，PTH 在骨合成代谢中主要起凋亡抑制作用，每天给予成年小鼠一定剂量PTH，之后观察到股骨的干骺端成骨细胞凋亡进程下降。上述内容可以看出，PTHrP对成骨细胞的分化和抑制成骨细胞的凋亡具有一定的作用[9-10]。

3.3 中医不同治法对骨质疏松症治疗效果的比较研究

通过对各组大鼠骨密度的检测结果分析，与正常组比较，模型组大鼠离体股骨上1/3骨密度极显著降低，说明去卵巢法建立骨质疏松症动物模型成功。本实验中补肾方法组用药左归丸，出自《景岳全书》，具有滋阴补肾，填精益髓的功效。健脾方法组用药补中益气颗粒，出自《脾胃论》，具有补中益气，升阳举陷的功效。活血方法组用药身痛逐淤汤，出自《医林改错》，具有活血祛瘀，祛风除湿，通痹止痛的功效。检测各组大鼠骨组织、骨骼肌中PTHrP含量，与模型组相比，中医不同方法治疗组大鼠的骨组织、骨骼肌中PTHrP含量均有不同程度的升高，其中补肾组大鼠骨组织PTHrP含量升高趋势最为明显，其次为健脾组；健脾组大鼠骨骼肌PTHrP含量升高趋势最为明显，其次为补肾组。说明补肾方法可以通过提高骨组织的PTHrP含量，减缓成骨细胞的凋亡过程，延缓骨质疏松症的进一步发展；健脾方法提高骨骼肌的PTHrP含量，可以提高肌肉的收缩和舒张能力，进一步改善肌肉与骨骼的营养状态，增加骨骼的物质代谢，从而增加骨质的弹性及韧性，防止骨质疏松的发生。

上述实验结果印证了中医学中“肾藏精主骨”、“脾主运化主四肢肌肉”、“脾肾相关”的理论，同时也可以看出补肾填精方法是中医药防治骨质疏松症的根本方法，健脾方法从一定方面也能有效防治骨质疏松症，是防治骨质疏松症的另一重要方法。