免疫检查点抑制剂的免疫相关不良事件预测生物标志物研究进展

李颖，尹皓原，潘丽，冯磊

doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.0997

0 引言

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）是近年来癌症治疗的热点之一，在转移性黑色素瘤（metastatic melanoma,MM）、非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）等多种肿瘤中取得了很好的疗效。然而随着ICIs应用的推广，ICIs的局限性和不良反应也引起了临床的关注和重视。一方面，ICIs只对部分患者有效，其客观缓解率仍有待提高；另一方面，ICIs在抑制肿瘤细胞的同时，也破坏着患者的免疫稳态，引起一系列不良反应，即免疫相关不良事件（immunerelated adverse events,irAEs）。

irAEs的临床表现复杂，影响患者的生活质量，严重的irAEs甚至需要停用ICIs，从而延误了患者治疗。因此，对使用ICIs治疗的肿瘤患者，寻找预测irAEs的生物标志物显得尤为重要。国内外关于irAEs预测生物标志物的研究越来越多，从各层面提出了对irAEs预测的可能性。本文基于irAEs的相关概念、机制、临床表现，在血清学、微生物学、遗传学等多个层面，归纳出具有代表性的能够预测irAEs的生物标志物，并期望这些生物标志物在未来能够应用于预测irAEs、指导ICIs用药的临床实践。

1 ICIs的种类和机制

通过阻断对T细胞的负性共刺激，ICIs可诱导抗肿瘤T细胞的活化，促使其杀伤肿瘤细胞，从而改善肿瘤患者病情。根据作用靶点不同，目前已在临床应用的ICIs药物主要分为抗程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1,PD-1）单抗、抗程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）单抗和抗细胞毒性相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4）单抗。PD-1与受体PD-L1的结合会抑制肿瘤微环境中T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。ICIs能够抑制PD-1和PD-L1的结合，解除其对T细胞的抑制，使相关T细胞攻击肿瘤细胞，从而达到肿瘤治疗的目的。CTLA-4与抗原提呈细胞表面的B7分子配体结合后能诱导T细胞无反应性，抗CTLA-4单抗抑制了这种免疫负调节，使T细胞活化识别攻击肿瘤细胞。目前，经FDA认证并进入使用的ICIs有作用于CTLA-4的ipilimumab、作用于PD-1的pembrolizumab、nivolumab，以及作用于PD-L1的atezolizumab、avelumab、durvalumab。

2 irAEs的机制和临床表现

近年来，部分研究认为轻中度irAEs的存在能为肿瘤患者带来更长的生存时间，是一种人体对ICIs产生应答的标志[1-2]。然而也有其他研究得出了与之矛盾的结论，irAEs的发生与疗效改善的关系尚无定论。irAEs的确切病理生理机制尚不明确，但据信与免疫检查点在维持免疫平衡中的作用有关。免疫检查点的生理作用是负向调节免疫应答，防止免疫应答对自身组织的损伤。CTLA-4以多种方式抑制免疫应答，包括在免疫应答初始阶段抑制T细胞激活。与此相反，人们通常认为PD-1在外周组织免疫应答的后期抑制T细胞。接受抗PD-1治疗的患者与接受抗CTLA-4治疗的患者的irAEs不尽相同，抗CTLA-4治疗的不良事件通常更为严重。例如，结肠炎和垂体炎更常见于抗CTLA-4治疗，而肺炎和甲状腺炎更常见于抗PD-1治疗。Postow等[3]在对irAEs机制的讨论中认为，导致irAEs的可能机制包括：针对肿瘤和健康组织共同携带的抗原T细胞活性增强、预先存在的自身抗体水平升高、炎性细胞因子的水平升高以及在表达CTLA-4的正常组织中，抗体与CTLA-4直接结合导致补体介导的炎性反应增强。

irAEs大部分开始于ICIs治疗后的3～6月，其临床表现多种多样，可以发生在人体的任何一个组织或器官。irAEs的发生率介于15%～90%之间，这可能与ICIs的种类、剂量、以及癌症的类型有关[4]。根据症状的严重程度，第四版通用不良反应术语标准（the Common Terminology Criteria for Adverse Events,CTCAE）将irAEs分为4个等级。其中，轻度和中度分别为Grade1、Grade2，只需对患者采取相应的对症治疗，不影响ICIs的使用。但当Grade2的患者irAEs对症治疗无效且症状持续存在时，需停止ICIs的使用，直到irAEs情况得到改善。而对于Grade3和Grade4的患者，必须停止ICIs的治疗并咨询相关专科医生。

irAEs可以按照器官分类，如结肠炎、垂体炎、肺炎、甲状腺炎、肝炎、皮疹等[5]。也有学者将irAEs按系统分类，如常见的内分泌irAEs包括1型糖尿病、垂体功能异常，甲状腺功能异常。风湿样irAEs主要表现为炎性关节炎、风湿性多肌痛、肌炎或肌病等[6]。血液系统的不良反应包括血小板减少、溶血性贫血、中性粒细胞减少、再生障碍性贫血等[7]。细胞因子释放综合征和严重神经毒性两种irAEs虽然罕见，但其致命性高，往往被单独讨论。这些irAEs与单纯的传统疾病相似但不相同，需要临床医生及时而准确地鉴别诊断。

3 预测irAEs的生物标志物

3.1 趋化因子和细胞因子

3.1.1 CXC趋化因子 对irAEs患者趋化因子变化的研究发现，CXC亚族的趋化因子中CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL19在治疗前基线水平较没有发生irAEs的患者低，而治疗后，只有CXCL9和CXCL10出现明显升高[8]。另一项研究中，irAEs患者在ICIs治疗后只出现趋化因子CCL5的升高[9]。CXCL9、CXCL10在肿瘤微环境中有调节T细胞的分化、引导免疫细胞向肿瘤组织迁移等功能。CCL5则被认为与移植物抗宿主病有关。这些趋化因子对免疫系统有着不同的调节作用，监测其变化对irAEs有一定预测作用。

3.1.2 IL-6 作为一种多功能的细胞因子，IL-6在炎性反应、免疫调节和肿瘤形成中都有重要作用。其与irAEs的相关报道和研究也较多。Valpione等通过Logistic回归分析发现经ipilimumab治疗的转移性黑色素瘤患者血清中IL-6基线值与irAEs相关[10]：IL-6基线值低的患者发生irAEs的风险高于IL-6基线值高的。另一项研究中，经nivolumab治疗出现银屑病样irAEs的黑色素瘤患者呈现出IL-6治疗后升高，同时没有银屑病样表现的患者呈现出IL-6降低[11]。这可能是由于升高的IL-6促进了Th17的分化，从而加剧了皮肤的炎性反应，使表皮异常增长，呈现银屑样病变。在肿瘤微环境中，结肠癌细胞能够分泌miR-21和miR-29b两种循环microRNAs，刺激免疫细胞分泌IL-6，而免疫细胞分泌的IL-6能反过来增强结肠癌细胞的侵袭性，同时使炎性反应转向免疫抑制。IL-6是联系肿瘤与免疫的关键因素之一[12]。目前，已有研究在探索IL-6阻滞剂维持ICIs药物活性及预防结肠炎irAEs的可能性[13]。

3.1.3 IL-17 IL-17由TH17细胞分泌，在炎性反应中有多种作用。而TH17细胞和调节性T细胞之间的平衡紊乱在打破母胎免疫耐受中发挥着关键作用，如IL-17的明显升高与炎性肠病有关。Tarhini等对经ipilimumab治疗的黑色素瘤患者的irAEs进行研究，发现IL-17的基线值与Grade3结肠炎irAEs有关[14]：Grade3结肠炎患者的IL-17基线值显著高于Grade0～2结肠炎患者。Kim等发现，irAEs患者的滑膜液中，IL-17和分泌IL-17的CD4+T细胞都明显升高[15]。滑膜液中的IL-17能够招募中性粒细胞，后者通过释放大量酶类，导致关节损伤。

3.1.4 可溶性CD163 可溶性CD163衍生于巨噬细胞，在多种自身免疫性疾病中都有明显升高，如类风湿关节炎、寻常性天疱疮等。CD163阳性的巨噬细胞能分泌趋化因子CXCL5。Fujimura等[16]检测了nivolumab治疗前及治疗42天后可溶性CD163和CXCL5的浓度，与没有irAEs的患者相比，有irAEs的患者CD163和CXCL5都出现明显升高。

3.1.5 其他细胞因子 关于细胞因子与irAEs的报道很多，除以上列举的几种外，还有大量其他细胞因子的研究，包括IL-8、IL-10、IL-1RA、IL-2RA、可溶性CD25等等[17-18]。对黑色素瘤患者irAEs的一项研究中，甚至一共观察到11种基线浓度升高的细胞因子[19]。遗憾的是，这些丰富的实验结果尚缺乏进一步的验证，部分细胞因子的相关研究结果甚至互相矛盾。这可能与血清中细胞因子的不稳定性有关：患者血清的采集时间、基础代谢率、激素类药物的使用，甚至短暂剧烈运动等都会对细胞因子的浓度产生影响。这些因素导致对ICIs治疗患者细胞因子的检测很难标准化，检测出的结果不能统一整合。在未来的研究中，细胞因子的检测需要建立一个统一的标准，对结果的分析也应结合患者的自身情况进行讨论。

3.2 自身抗体

部分患者体内自身抗体阳性，但没有呈现抗体相关自身免疫疾病的症状，这种潜在自身免疫状态会提高发生irAEs的风险。治疗前患者体内的甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody,TgAb）和甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody,TPOAb）与甲状腺功能异常的irAEs相关。Osorio等[20]研究中，经pembrolizumab治疗的NSCLC患者，共有10例甲状腺功能异常irAEs，其中8例表现为甲状腺自身抗体阳性，4例为治疗前抗体阳性。Kimbara等[21]回顾性分析了168例经nivolumab治疗的癌症患者，其中出现甲状腺功能异常irAEs的患者共23例，14例在治疗前TgAb和（或）TPOAb阳性。检测患者体内的TPOAb和TgAb对其发生甲状腺功能异常irAEs有一定的预测作用。Stamatoulie等[22]研究中检测了糖尿病患者相关自身抗体GAD-65、IAA、IA-2，发现在治疗开始前体内就有1型糖尿病相关抗体的患者，出现糖尿病相关irAEs的概率高于体内没有抗体的患者。抗核抗体，作为自身免疫疾病的标志物，在irAEs患者中也有相关报道。Sakakida等[23]发现治疗前抗核抗体阳性与出现结肠炎irAEs显著相关。据统计，约11%的irAEs患者呈抗核抗体阳性，其中27%在治疗后检测到抗核抗体谱的种类增多[24]。大疱性类天疱疮（bullous pemphigoid,BP）属于皮肤类irAEs中的一种。在一次研究中，研究者通过分析肺癌组织的RNA测序结果，找到了同时在肺鳞癌和健康皮肤中表达的3种抗原：BP180、BP230和Ⅶ型胶原蛋白。他们进一步分析患者治疗前后血清中相关抗体的滴度，发现BP180IgG抗体与皮肤类irAEs的发生有关[25]。检测BP180IgG自身抗体的存在对预测皮肤类irAEs有一定指导作用。

与细胞因子相比，自身抗体的滴度相对稳定，其检测也相对方便。对于自身抗体与irAEs关系的研究，不仅有助于预测irAEs，对irAEs机制的揭示也有重大意义。此外，自身抗体滴度在治疗过程中并非一成不变，动态监测自身抗体滴度及相关激素的浓度，在出现异常时及时采取治疗也能够有效预防严重的irAEs。

3.3 免疫细胞

3.3.1 嗜酸性粒细胞（eosnophils,EOS）Delyon等[26]于2012 年的一次前瞻性研究中发现，ipilimumab治疗的黑色素瘤患者EOS的升高伴随着患者的生存周期延长。然而后来的一些研究中，EOS作为预后指标在不同的肿瘤治疗过程中表现截然相反，如在胃肠道肿瘤治疗中提示预后较好，但在霍奇金淋巴瘤则提示预后较差[27]。2017年，一项包括909例癌症患者嗜酸性粒细胞的研究中，作者认为EOS的增多本身应该属于irAEs，其升高是由于ICIs的不良反应[28]。2019年Kizawa等[29]通过Meta分析分析了73例经ICIs治疗出现irAEs的肿瘤患者，其中57例治疗后出现EOS增多。EOS的增多表现出与irAEs的显著相关性，尤其是内分泌性irAEs。他们认为EOS的数量变化可以作为irAEs的预测指标。同年的另一项关于血细胞计数与抗PD-1治疗黑色素瘤患者irAEs关系的报告中，EOS的基线值及治疗1月后的升高值可以作为预测内分泌性irAEs的生物标志物[30]。

3.3.2 中性粒细胞与淋巴细胞比例 外周血细胞计数预测irAEs的研究中，中性粒细胞与淋巴细胞数量比（neutrophil/lymphocyte ratio,NLR）也是候选指标之一。Diehl等[31]发现治疗前淋巴细胞基线值大于2 000，且治疗后1月仍然大于2 000与发生Grade 2以上irAEs有关，而在治疗前伴有淋巴细胞减少的患者治疗后出现irAEs的概率相对较小。Yasuhiro等[32]试图观察黑色素瘤患者irAEs的发生与血细胞计数波动的关系，他们认为WBC总数值增加，同时淋巴细胞相对计数降低与Grade3/4的irAEs发生相关，但这种相关性出现在irAEs发生后，对于irAEs的预测价值不大。Pavan等[33]将NSCLC患者开始接受ICIs治疗前一周内的NLR设为基线值，发现低NLR基线值与irAEs的发生相关。Li等[34]的研究也提出NLR低基线值与irAEs的相关性。

3.3.3 T细胞库多样化 CTLA-4抑制剂阻断了CTLA-4的免疫负调节作用，刺激T细胞增殖。T细胞的改变理论上能够帮助预测irAEs。Chaput等发现低水平的调节性T细胞与结肠炎的发生有关[35]。此外，T细胞库的克隆多样化也对irAEs发生有预测作用。经ipilimumab治疗出现irAEs的患者其T细胞克隆在开始治疗后的两周内增加，其中CD4+T细胞和CD8+T细胞克隆数明显增多，而调节性T细胞几乎没有变化[36]。Subudhi等对比患者T细胞TCR的β链测序结果发现：在irAEs发生之前，CD8+T细胞克隆数会增加，当CD8+T细胞克隆数超过55意味着可能发生严重的irAEs[37]。对T细胞库的监测也能预测irAEs的发生。

3.4 遗传标志物

自身免疫疾病的发生与遗传因素密切相关，同样，遗传因素与irAEs的发生也有关系。研究显示，HLA-DRB1*11:01单体型与皮肤瘙痒irAEs有关。HLA-DQB1*03:01与结肠炎irAEs有关[38]。HLA-B*52:01和HLA-C*12:02与ICIs导致的关节炎有关[39]。HLA-B*4002与nivolumab治疗霍奇金淋巴瘤出现的1型糖尿病有关[40]。HLA-DRB1*09:01-DQB1*03:03则与nivolumab治疗肾癌出现的甲状腺炎有关[41]。

除HLA分子外，CTLA-4和PD-1的相关基因突变也与irAEs有关。经ipilimumab治疗的MM患者，其CTLA-4基因发生1661 A＞G突变时，出现内分泌性irAEs的概率升高[42]。这可能是由于突变后产生的1661 G/G基因型能从翻译水平改变CTLA-4异构体的长度和可溶性，增强了其对T细胞的活化能力。Bins等收集了161个nivolumab治疗的NSCLC患者，检测其PD-1信号通路中相关基因的SNP位点，包括PD-1及其下游蛋白的编码基因PDCD1、PTPN11、ZAP70及IFNG等。他们发现PDCD1 804C＞T突变与降低nivolumab毒副作用有关，而IFNG 1616 T＞C突变增加了nivolumab的风湿毒性[43]。这些研究结果表明免疫相关基因SNP位点的突变及特定的HLA单体型对于预测irAEs有重要作用，对患者进行HLA分型及相关基因测序对预防irAEs有重要意义。

3.5 肠道微菌群

鉴于肠道微菌群在自身免疫性疾病中的作用，对irAEs的研究也不能忽略肠道微菌群。肠道菌群主要为柔嫩梭菌属（Faecalibaterium）和其他一些厚壁菌属（Firmicutes）的黑色素瘤患者，在ipilimumab治疗后更容易出现结肠炎性irAEs，相反，肠道含有拟杆菌属（Bacteroidetes）的患者则完全没有出现结肠炎性irAEs[35]。Dubin等进一步证实，拟杆菌属的存在确实对ipilimumab导致的结肠炎有预防作用[44]。这可能是由于拟杆菌属分泌的多糖A能刺激抗结肠炎调节T细胞的增长和相关细胞因子的分泌[45]。此外，罗伊氏乳杆菌，属于益生菌的一种，通过减少肠黏膜中天然淋巴细胞3（ILC3）的数量，在对ICIs治疗过程中出现的结肠炎也有一定的预防作用[46]。

4 与irAEs相关的其他指标

4.1 性别

研究显示，女性患者出现irAEs的概率显著高于男性患者[47]。值得注意的是女性自身免疫疾病的患病率同样也高于男性。这可能是由于男女性激素水平的差异，对人体免疫系统产生不同的调节作用。这种差异性导致免疫疾病的发病在性别上多倾向于女性。

4.2 肿瘤类型

irAEs的不同临床表现不仅仅是因为使用不同的ICIs药物，与患者的肿瘤类型也有关系。最近一项Meta分析发现：与NSCLC患者相比，MM的患者出现皮肤和胃肠类irAEs的几率高；与肾癌患者相比，MM患者多出现皮炎、关节炎和肌痛，而肺炎和呼吸困难较少见[48]。虽然具体机制尚不清楚，但MM患者的irAEs倾向性可能是因为特定的肿瘤细胞与正常组织存在某些交叉抗原。这类研究结果虽然不能预测irAEs，但在irAEs的鉴别诊断中有很大的帮助。

5 展望

irAEs的出现对癌症患者而言有利有弊。虽然越来越多的证据表明irAEs与ICIs的有效性相关，但严重的irAEs会对患者造成不可逆转的伤害，甚至威胁患者的生命。这就要求临床工作者严格把控，对ICIs治疗患者定期监测、主动预防，争取及时诊断irAEs。目前临床上一般通过实验室检查如生化常规、肌酐清除率、甲状腺功能检测、皮质醇、胰岛素生长因子等来监测特定类型的irAEs。但当这些指标出现异常时，往往意味着器官组织已经遭到破坏。寻找更早期可以预测irAEs的标志物并加以提前干预对患者更有价值。

令人欣慰的是，从irAEs出现至今，短短几年内国内外学者已在微生物学、遗传学、血清学等多个领域找到许多可能成为irAEs预测标志物的候选指标。这些标志物大部分都易获取，检测周期也不长，适用于大规模的筛查。多种检测方法的联合应用可能是未来irAEs预测的趋势。对irAEs的预测不仅能指导用药，也能进一步保障患者的安全。将irAEs控制在温和且可治愈的状态，既能有效规避严重的不良反应，提高患者生存质量，也能提高ICIs的治疗效果，为肿瘤患者带来更长久的受益。多方位、全面的生物标志物对irAEs的早期识别和治疗干预意义重大。

然而，这些新的生物标志物的研究也面临许多困难，如实验结果众多且存在不一致性、其准确性无法在临床实践中得到证实等，一定程度上限制着这些生物标志物的研究进展。我们期望在未来的研究中能够筛选出精确可靠而又经济便捷的理想生物标志物，并通过大规模多中心的临床试验来验证其临床实际应用价值。