微生物与结直肠癌的发病机制、早期诊断和治疗的研究进展

陆玮，肖乾，胡烨婷，孔祥兴，丁克峰

0 引言

结直肠癌是威胁人类健康的重大疾病之一，全世界范围内每年约有130万新发结直肠癌患者，约86万结直肠癌患者死亡[1]。越来越多的证据表明，饮食习惯变化、生活环境改变、微生物暴露、免疫炎性反应、基因改变及表观遗传等多种因素在结直肠癌的发生发展过程中起推动作用。消化道是人体内微生物多样性和丰度最高的部位之一，目前有很多研究报道了微生物与消化系统疾病之间的密切关系[2-3]。在结直肠癌领域，随着近年来微生物组学技术以及生物信息分析方法的发展，结直肠癌与正常人群之间肠道菌群多样性和丰度的差异也被广泛报道[4-5]；在结直肠癌的发生发展过程中，研究者们发现微生物通过产生基因毒性物质、诱导慢性炎性反应、抑制宿主免疫功能等机制，发挥促进结直肠癌发生的作用[6-7]；某些特定细菌如具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum），除了在结直肠癌患者的原发灶中富集，还存在于结直肠癌患者的肝转移灶中[8]；利用结直肠肿瘤患者与健康人群肠道菌群的差异，研究者们建立了结直肠肿瘤的早期筛查、诊断模型[9]；微生物不仅能够参与结直肠癌的发生发展，还能够影响结直肠癌的治疗效果[10-11]。本文以微生物与结直肠癌的关系为切入点，结合近年的相关文献及自身研究，综述微生物与结直肠癌的发病机制、早期诊断和治疗的研究进展。

1 微生物与结直肠癌的发病机制

肠道菌群在结直肠癌发生过程中发挥关键作用，它们可以产生基因毒性物质，直接造成DNA损伤、诱发基因突变，促进结直肠癌的发生[2,12]。Boleij等[12]研究报道，超过80%的结直肠癌患者肠黏膜中存在产肠毒素的脆弱拟杆菌（enterotoxigenicBacteroides fragilis,ETBF），而脆弱拟杆菌毒素（Bacteroides fragilistoxin,BFT）可以通过升高反应活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平造成宿主细胞DNA损伤[13]。一些细菌毒素还含有能够直接与DNA形成加合物的活性基团，而这种庞大的DNA双链加合物如果不能及时修复，可能会造成DNA双链断裂以及基因突变。Wilson等[2]报道，pks岛阳性的大肠杆菌（pks+Escherichia coli）可以表达大肠杆菌素活化肽酶（ClbP），其可以促进毒性代谢产物大肠杆菌素（colibactin）的活化，而大肠杆菌素中含有的环丙烷基团是DNA烷基化基团，其可以与宿主细胞双链DNA交联形成烷基化的加合物。大肠杆菌素对宿主DNA的破坏并非随机而是具有选择性的，大肠杆菌素选择性地诱导宿主DNA损伤的序列被称为大肠杆菌素破坏基序（AAWWTT序列），并且大肠杆菌素破坏基序与结直肠癌基因组中的突变热点，尤其是结直肠癌的关键驱动基因APC的突变位点高度一致[14]。随着这些细菌来源的基因毒性物质促进结直肠癌发生的分子机制不断被阐明，它们将来有希望成为结直肠癌预防和治疗的重要靶点。

炎性反应与肿瘤的发生密不可分，基因毒性物质造成的DNA损伤和炎性反应互为因果，协同促进肿瘤发生[15]。肠道菌群失衡引起的慢性炎性反应、局部免疫微环境紊乱会使肠道黏膜屏障持续受到破坏，进而使正常肠道上皮细胞、免疫细胞持续暴露于促肿瘤微生物及其产物中，促进结肠癌的发生[16]。Kostic等研究发现，具核梭杆菌可以诱导宿主细胞高表达COX-2、NF-κB、TNF-α等炎性反应相关基因，促进IL-1β、IL-6、IL-8等促炎细胞因子分泌[17]。除此之外，具核梭杆菌还可以通过招募骨髓来源的抑制性细胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）、通过其外膜表面的Fap2和RadD蛋白直接诱导淋巴细胞死亡，从而抑制宿主的抗肿瘤免疫功能，促进肿瘤生长和转移[17-18]。具核梭杆菌除了在结直肠癌患者的原发灶中富集，Bullman等还在结直肠癌患者的肝转移灶中分离培养得到了具核梭杆菌，并且发现肝转移灶和原发灶中具核梭杆菌的基因组序列高度相似，相对丰度也较为接近[8]。因此，在结直肠癌肝转移过程中，肿瘤细胞可能与具核梭杆菌等某些特定细菌共同转移至肝脏，形成肝转移灶周围的微生物微环境。而目前对于肝转移灶中微生物发挥的生物学功能尚无研究报道，探索其是否对晚期结直肠癌患者具有预后预测价值、是否能够影响化疗及靶向治疗疗效等都将成为今后的研究热点。

有益的肠道菌群可以产生抗肿瘤物质，降低结直肠癌的发病风险。肠道菌群可以利用膳食纤维发酵产生丁酸等短链脂肪酸，而丁酸可以作为正常肠道上皮细胞的供能物质，对于维持上皮细胞的屏障功能以及损伤修复具有重要作用[19]。Furusawa等研究发现，丁酸可以提高肠道组织中的Treg细胞FOXP3基因启动子区域的组蛋白乙酰化水平，从而增加FOXP3基因的表达和FOXP3+Treg细胞的比例，抑制结肠炎症的形成[20]。丁酸还能够间接作用于肠道内其他细菌，其在高浓度的抗炎作用下会限制其他肠道菌群引起的炎性免疫反应，但是其在低浓度时反而会诱发炎性反应，抑制潜在病原体的生长从而恢复丁酸菌群的丰度[21]。丁酸在不同浓度下的抗炎、促炎双重作用可能是肠道菌群维持稳态的机制之一。

在结直肠癌的发展早期对肠道微环境进行干预，可能会降低结直肠癌的发生率、延缓结直肠癌的发展过程。但是目前对于微生物在结直肠癌发生发展中的分子机制有待完善，仍然需要在大样本的人群中进行验证。未来对于肠道菌群与结直肠癌相互作用分子机制的进一步阐明，将有助于发现新的预防与治疗靶点，从而有希望降低结直肠癌的发病率。

2 微生物与结直肠癌的早期诊断

目前结直肠癌的诊断流程主要是粪便隐血筛查、电子肠镜检查以及病理活检确诊[22]。但是目前的诊断流程仍然存在缺陷，例如粪便隐血筛查的敏感度和特异性较低[23]，电子肠镜检查虽然能够确诊结直肠癌，但是作为侵入性检查，患者对肠镜的接受程度以及成本效益关系决定了肠镜不适合用于人群结直肠癌的筛查，而适用于高度怀疑为结直肠癌患者的确诊检查。因此，寻找更加准确的结直肠癌筛查、诊断方法是近年来的研究热点。

2.1 肠道菌群与结直肠癌的早期诊断

近年来随着微生物组学技术以及生物信息分析方法的发展，很多大规模的研究报道了结直肠癌与健康人之间肠道菌群多样性和丰度的差异[4-5]。Shah等[24]采用16S rDNA测序分析了结直肠癌患者与健康人群粪便菌群丰度的差异，鉴定获得数十个丰度显著差异的操作分类单元（operational taxonomic units,OTU），对这些OTU进行注释发现它们来源于卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、胃链球菌属（Peptostreptococcus）、微单胞菌属（Parvimonas）、阿克曼菌属（Akkermansia）和梭杆菌属（Fusobacterium）；利用这些OTU的丰度建立分类预测模型，能够较好的区分结直肠癌患者与健康人群（AUC=0.76）；除此之外，将OTU的丰度与患者的临床信息一起纳入分类预测模型，模型的预测效果可以进一步提升（AUC=0.833）。Yu等[9]采用宏基因组测序分析了中国人群中结直肠癌患者与健康人群粪便细菌基因的差异，鉴定得到包括来自具核梭杆菌的丁酰CoA脱氢酶在内的20个相对表达量具有显著差异的细菌基因，采用这些细菌基因的相对表达量建立分类预测模型，也能够达到区分结直肠癌患者与健康人群的效果（AUC=0.71）。除了肠道中的细菌，采用宏基因组测序还可以获得肠道中的其他微生物的丰度。Nakatsu等[25]还报道了结直肠癌患者粪便中的噬菌体病毒多样性显著高于健康人群，结直肠癌患者粪便中细菌的多样性低于健康人群，并且基于结直肠癌患者与健康人群粪便中丰度显著差异的病毒例如巨细胞病毒属（Cytomegalovirus）、正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）等建立分类预测模型，也能够较好地区分结直肠癌患者与健康人群（AUC=0.802）。

2.2 口腔菌群与结直肠癌的早期诊断

除了寻找结直肠癌患者与健康人群在肠道中显著差异的微生物，一些研究还报道了结直肠癌患者身体其他部位、器官的菌群失衡。口腔是上消化道的起始，每一个个体都具有独特的口腔菌群。Russo等[26]报道了结直肠癌患者口腔中具核梭杆菌的含量较健康人群显著增加。研究者们还采用了16S rDNA测序技术对于结直肠癌患者与健康人群口腔差异菌群进行了探索。Flemer等[27]发现结直肠癌患者与健康人群口腔菌群显著差异的OTU主要来源于嗜血杆菌属（Haemophilus）、胞菌属（Parvimonas）、普雷沃氏菌属（Prevotella）、拟普雷沃氏菌属（Alloprevotella）等菌属，利用16个显著差异的OTU的丰度建立分类预测模型，能够较好的区分结直肠癌患者与健康人群（AUC=0.905）以及结直肠息肉患者与健康人群（AUC=0.891）。相比于粪便菌群检测，口腔菌群检测的便捷性更好，患者的依从性更高，但是饮食习惯、地域、人种等因素可能会对口腔菌群造成较大影响，此项研究结果也需要进行多中心的独立验证。

2.3 血液游离细菌DNA与结直肠癌的早期诊断

传统观念认为，在没有系统性感染存在的情况下血液是无菌的。Kowarsky等[28]发现，健康人群血液中的游离DNA（cell-free DNA,cfDNA）中有约0.5%～10%的读段无法比对到人的基因组，其中一部分读段可以比对到细菌、病毒和真菌的基因组。Huang等[29]研究发现乳腺癌患者血液中的游离DNA中也含有无法比对到人的基因组的读段，而这些非人源的DNA片段大部分都来源于细菌基因组。我们前期对12例结直肠癌患者和11例健康人群的cfDNA进行了宏基因组测序，也发现了其中微量的非宿主来源的DNA片段，它们主要来源于丙酸杆菌属（Cutibacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、四联球菌属（Tetragenococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、多核杆菌属（Polynucleobacter）、巴氏杆菌属（Pasteurella）和肠球菌属（Enterococcus）等。进一步将这些非宿主来源的DNA片段比对到细菌基因组并进行差异分析，发现结直肠癌患者与健康人群的cfDNA存在127个显著差异的细菌（FDR＜0.1）。基于差异细菌的丰度数据，采用随机森林模型对这些显著差异的细菌进行筛选并建立分类预测模型，最终纳入分类预测模型的细菌共有28个。我们将该模型在另一批样本中进行独立验证，共包含13例结直肠癌患者、10例结直肠腺瘤患者和11例健康人群，并计算每个个体患结直肠癌的概率。我们发现该模型不仅能够很好的区分结直肠癌患者与健康人群（AUC=1），也能够很好的区分结直肠腺瘤患者与健康人群（AUC=1）。该研究尚未正式发表，可在预印本网站BioRxiv查询相关结果（https://www.biorxiv.org/content/10.1104/647644v1）。

采用cfDNA中细菌DNA的丰度对结直肠癌进行早期诊断是一个新兴领域，其具有非侵入性、患者依从性高、准确率高等特点，并且结直肠腺瘤也能在该分类预测模型中得到很好的识别。但是目前我们对于这些细菌DNA的来源仍然未知，虽然我们发现它们与胃肠道的菌群存在一部分重合，提示它们可能来源于受损的消化道黏膜屏障，但是全身其他部位与器官常驻细菌的DNA也能够在血液中检测到，提示cfDNA中细菌DNA可能是全身各个部位细菌DNA的综合。在血液循环中，仅仅存在细菌的DNA还是有存活细菌尚未知，鉴于Bullman等[8]报道结直肠癌肝脏转移灶中也有可培养的活细菌存在，因此在血液循环中很可能有微量的存活细菌，而它们是否发挥了生物学功能仍然未知。此外，年龄、地域、人种等混杂因素可能会对cfDNA中细菌的组成造成影响，cfDNA中细菌成分用于结直肠癌早期诊断的结果未来也需要多中心研究进行独立验证。

3 微生物与结直肠癌的治疗

随着微生物促进结直肠癌发生发展的分子机制研究不断深入，研究者们发现某些微生物可能成为抑制结直肠癌发生发展的药物靶点。Cougnoux等以大肠杆菌素活化肽酶为靶点，筛选了2种小分子抑制剂，在体外实验中它们能够减弱pks+E.coli的基因毒性、逆转宿主细胞的DNA损伤，并且它们在小鼠模型中还可以抑制pks+ E.coli诱导结直肠肿瘤的发生率[30]。具核梭杆菌是革兰氏阴性专性厌氧菌，对于甲硝唑敏感。Bullman等采用具核梭杆菌阳性的结直肠癌组织样本建立了人源肿瘤异体移植小鼠模型（patient-derived tumor xenograft,PDX），发现甲硝唑能够显著抑制具核梭杆菌的载量和肿瘤组织的生长[8]。但由于甲硝唑除了能够杀死具核梭杆菌还会杀死其他厌氧菌，因此研发具核梭杆菌特异的抗菌药物将更具有临床实用价值。除了直接以细菌作为靶点进行药物研发，细菌调控肿瘤细胞发生改变的信号通路也可以作为靶点。具核梭杆菌能够激活结直肠癌细胞的TLR4/MyD88信号通路，从而促进结直肠癌细胞的自噬水平并抑制奥沙利铂（oxaliplatin）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）诱导的促肿瘤细胞凋亡作用，从而引起肿瘤耐药[11]。抑制具核梭杆菌引起结直肠癌细胞升高的自噬水平，也是增加结直肠癌化疗敏感度的新策略之一。

除了作用于肿瘤细胞影响化疗敏感度，一些微生物可以使化疗药物或其代谢产物的活性发生改变，从而导致化疗药物的不良反应增强。如伊立替康（irinotecan）是晚期结直肠癌患者常用的化疗药物，伊立替康会经肝脏的羧酸酯酶（carboxylesterase）代谢成为抗肿瘤活性产物SN-38，而SN-38会被药物代谢Ⅱ相反应中的关键酶UDP-葡萄糖醛酸基转移酶（UDP-glucuronosyltransferase,UGT）代谢成为失活产物SN-38G，并通过胆汁分泌进入肠道；而大肠杆菌产生的β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase），可以催化肠道内的失活产物SN-38G重新转变为活性产物SN-38，从而引起严重腹泻等不良反应[10,31]。以β-葡萄糖醛酸苷酶作为靶点设计的小分子抑制剂，目前已经在动物实验中被证明，其在不影响伊立替康抗肿瘤活性的同时能降低伊立替康导致的严重腹泻等不良反应[32]。

目前许多研究报道了某些特定微生物的促结直肠癌作用，而益生菌等微生物制剂能够促进肠道微生物恢复稳态，那么这些微生物制剂能否辅助结直肠癌的治疗呢？Gao等报道，益生菌补充疗法能够改善结直肠癌患者肠道菌群的多样性，并且能够显著降低促进结直肠癌的梭杆菌属细菌的丰度达5倍以上[33]；除此之外，益生菌还可以通过下调宿主细胞COX-2的表达水平，抑制肠道内的免疫炎性反应从而抑制结直肠癌的发生[34]。虽然目前关于益生菌等微生物制剂抑制结直肠癌的作用和分子机制已经在细胞、动物模型中取得很多研究进展，但是未来仍然需要在人群中进行大量的随机对照试验。传统的微生物制剂成分较为单一，很多益生菌在患者肠道中无法长期存活，而粪菌移植可以将健康人群的肠道菌群移植到患者的肠道中，其作为一项新兴技术，已经在炎性肠病等疾病中取得较多进展[35]。但是，粪菌移植能否应用于结直肠癌治疗，目前还缺少临床实践的证据，并且对于供体的选择、粪菌移植的时机等目前尚无定论，在将来这些可能是微生物用于结直肠癌治疗的重点研究方向。

4 结论

综上所述，微生物与结直肠癌发生发展的密不可分，对于该领域的探索，有助于更好地认识结直肠癌发生发展的分子机制，使早期干预结直肠癌的发生发展成为可能；利用结直肠癌患者与健康人群之间的差异微生物，建立基于微生物标志物的结直肠肿瘤早期筛查、诊断模型，有助于结直肠肿瘤的早期发现；以微生物作为靶点研发药物、恢复肠道微生物稳态，可能在今后成为结直肠癌预防和治疗的新策略。