选择性剪接在口腔鳞状细胞癌中的研究进展

武晓芬，孙睿,2

0 引言

许多前体mRNA分子经过加工只产生一种成熟的mRNA，翻译成相应的一种多肽；有些则可剪切或（和）剪接加工成结构有所不同的mRNA，这一现象称为可变剪接，又称选择性剪接（alternative splicing,AS）[1]。

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤。尽管在过去几十年诊断和治疗方面取得了一定的进展，但OSCC的死亡率仍然很高，迫切需要揭示OSCC的发生和发展机制。已有研究表明，前体mRNA的AS异常与OSCC密切相关。下面就近几年来与OSCC相关的AS研究作一综述，为探索OSCC靶向治疗之路提供阶段性借鉴。

1 OSCC中的选择性剪接调控

AS是一个依赖于顺式作用元件和反式作用因子[AS中主要为剪接因子（splicing factor,SF）]高度受控的过程。顺式作用元件主要有外显子剪接增强子、内含子剪接增强子、外显子剪接沉默子和内含子剪接沉默子，分别促进或抑制对特定剪接的选择；剪接因子主要有SR（serine-arginine rich）蛋白家族和核不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP）家族，还有其他RNA结合蛋白[2]。

1.1 顺式作用元件上基因多态性对剪接的影响

长正五聚蛋白3（long pentraxin 3,PTX3）促进癌细胞迁移和侵袭，其2号外显子上有定位于外显子剪接增强子序列的PTX3rs3816527。经生物信息学工具分析发现其C等位基因较A等位基因具更强的增强活性，可能更利于促进PTX3基因的剪接修饰[3]。结肠癌转移相关基因1（metastasis associated with the colon cancer-1,MACC1）过表达与舌鳞癌（占OSCC的25%～40%）患者总体生存率低高度相关。位于其4号外显子的某段序列经分析，其上MACC1rs4721888为C等位基因时则被推定为外显子剪接增强子序列，可能被人类特异性的SR蛋白——SC35蛋白所识别[4]。至于基因多态性对OSCC的AS到底有无实质性影响有待逐步研究。

1.2 剪接因子的过表达和调节失控

1.2.1 剪接因子的过表达 实体肿瘤中的剪接因子直接与前体mRNA结合并以浓度依赖的方式调控其下游靶点，故表达水平的改变会导致剪接失调[5]。

OSCC细胞中hnRNP A1的过表达与G2/M转变相关联。微阵列数据分析显示，细胞周期蛋白依赖型激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）5号外显子的AS受hnRNP A1调节，hnRNP A1敲低后CDK2亚型1（5号外显子包含，其编码区域位于蛋白激酶结构域中间，可能影响CDK2的功能）的表达降低[6]。RNA上的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修饰与原癌基因和肿瘤抑制基因的异常表达密切相关。与正常癌旁组织相比，OSCC组织中m6A水平显著上调，包括hnRNP C在内的8个发生m6A修饰的基因表达差异被鉴定出来。系列分析表明仅hnRNP C可能是OSCC中一个独立的生物标志物和治疗靶点[7]。与正常口腔黏膜组织相比，hnRNP L在OSCC组织中明显过表达，主要聚集在细胞核某些区域，形成斑点状结构。与在上皮组织中不同，hnRNP L在间充质组织中表达更多。SRSF3是hnRNP L的新靶点，hnRNP L可能通过在转录和转录后AS两个层面调控SRSF3的表达[8]。

SRSF3在正常口腔黏膜、口腔上皮中至重度不典型增生组织和OSCC中的表达水平逐渐增加且呈显著差异，SRSF3可能通过调节Slug和N-钙黏蛋白参与了OSCC的迁移过程[9]。

CUGBP胚胎致死性异常视觉样家族成员1（CUGBP embryonic lethal abnormal vision-like family member 1,CELF1）可能是肿瘤进展过程中的潜在调控因子。利用RNA-seq技术在口腔癌细胞中鉴定出1283个由CELF1调控的与细胞增殖、血管生成和信号转导相关的mRNA，发现CELF1促进了282个前体mRNA的选择性剪接，其中最常见的剪接模式是盒式外显子跳跃和包含，CELF1或其调控的mRNA有望成为治疗性干预的候选项[10]。

1.2.2 剪接因子的调节失控 AS是一个高度调控的过程，故SF本身也受到严格调控。自调节在SR蛋白中很常见。

SRSF3的4号外显子含框内终止密码子，转录后产物中若无4号外显子，则产生全长SRSF3；若含4号外显子，则经无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）或产生失去RS功能域的截断SRSF3。OSCC中SRSF3的过表达可致其4号外显子的包含增加，自调节作用显现。多聚嘧啶区结合蛋白1/2（polypyrimidine tractbinding protein 1/2,PTBP1/2）可与4号外显子上的外显子剪接抑制子结合以抑制4号外显子包含从而削弱SRSF3的自调节，SRSF3表达水平的稳定被打破[11]。复发或转移的头颈部鳞状细胞癌中单独使用紫杉醇（Paclitaxel,PTX）时，估计有效率为40%。PTX和抗SRSF3的反义寡核苷酸——SR-3都可能通过抑制OSCC细胞中SRSF3的4号外显子包含下调全长SRSF3蛋白的表达最终诱导细胞凋亡，故二者联合可使OSCC患者对PTX的治疗敏感，使用抗SF的反义寡核苷酸可能是一种有用的抗肿瘤新方法[12]。

SRSF5参与了细胞周期特别是S期的进展。SRSF5的表达也受自调节机制控制，其6号外显子存在两个3’剪接受体位点，使用近端位点产生的是长转录本（包括一个956 bp的片段和一个框内终止密码子），可能编码一个缺少RS结构域的SRSF5蛋白，也可能通过NMD导致RNA降解；使用远端位点产生的是短转录本，编码全长的有功能的SRSF5。SRSF3过表达显著增加了SRSF5的6号外显子远端位点的使用和SRSF5蛋白的表达，也减弱了SRSF5的自调节功能[13]。

2 OSCC中的选择性剪接事件

AS导致肿瘤相关剪接变体的产生或表达量变，这些剪接变体在OSCC细胞增殖、迁移、侵袭、抗凋亡和化疗耐药[12]方面发挥重要作用。

2.1 NOX5α

舌鳞癌中观察到的具独特生长模式（即有显著高度扩张形成肿瘤块倾向）的亚群被称作肿瘤起始细胞（tumor-initiating cells,TICs），高表达CD271的TICs可在放化疗后持续存在。NADPH氧化酶5（NADPH oxidase 5,NOX5）是内源性高活性氧（reactive oxygen species,ROS）的主要来源，有6个剪接变体，其中NOX5α是舌鳞癌中关键的ROS生成酶，NOX5α/ROS介导了舌鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭。NOX5α的增加伴随着CD271+细胞的增加，CD271+细胞中OCT4（干细胞标志物）表达水平很高，细胞成球能力（衡量肿瘤细胞干性的金标准）增强。NOX5α调节CD271增加后，舌鳞癌对顺铂和NK细胞的敏感度随之降低，故靶向NOX5α活性可能有助于激活或改善口腔癌患者的NK细胞监测程序[14]。

2.2 STAT3

信号转导和转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）是一种致癌基因，在细胞增殖、凋亡和转移中起着非常重要的作用，通过其23号外显子的AS产生两种异构体——STAT3α和STAT3β（不同于STAT3α，STAT3β在肿瘤发生中发挥负作用），分别编码全长致癌的STAT3蛋白和截断蛋白。多聚胞嘧啶结合蛋白1（poly(rC)-binding protein1,PCBP1）为肿瘤抑制剪接因子，可通过与23号外显子内的外显子剪接沉默子结合抑制近端剪接位点的使用促进抑瘤型STAT3β的生成。PCBP1还可抑制由STAT3激活的抗凋亡基因如Bcl-xL和survivin的表达，故上调PCBP1的表达很可能是抑制OSCC中STAT3的有效方法[15]。

2.3 VEGF165b

血管生成与否取决于促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡变化[16]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的8号外显子选择近端剪接位点产生促血管亚型，如VEGF165在血管生成中发挥作用；选择远端剪接位点产生抗血管亚型，如VEGF165b拮抗VEGF165诱导的内皮细胞增殖。VEGF165b使成纤维细胞与细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的黏附力更强，而VEGF165更能诱导明胶酶表达，故VEGF165b可能通过抑制明胶酶表达和激活肿瘤细胞周围癌相关成纤维细胞（carcinomaassociated fibroblasts,CAFs）与ECM的黏附能力来促进抗血管生成过程；VEGF165b在OSCC与CAFs边界处的表达呈增长趋势，故VEGF165b阳性染色可能更有助于监测恶性细胞，尤其是4C/4D组织的浸润前端[17]。

2.4 oncTn-C

细胞外基质蛋白——细胞黏合素C（Tenascin-C,Tn-C）与肿瘤转化进展相关。其成熟蛋白中纤维连接蛋白Ⅲ型样重复序列（fibronectin type Ⅲlike repeats,FNⅢ）所含的结构域数量由AS过程确定，形成的亚型被称作癌胚胎Tn-C变体（oncofetal Tn-C variants,oncTn-C），致瘤性转化过程中SRSF6参与了Tn-C的剪接。OSCC中除大量表达的几乎含所有剪接域的大Tn-C外，还存在几个新的Tn-C剪接变体（含FNⅢ中A3-A4-B结构域，C结构域极少表达），与恶性程度及入侵模式相关联。这种OSCC细胞特异性的oncTn-C的合成被证明是口腔病变刷拭活检中鉴别肿瘤细胞的一个非常好的附加标记[18]。

2.5 FGFR1Ⅲc

促进上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）的主要事件之一是来自于肿瘤相关基质细胞的多种生长因子如转化生长因子-β（TGF-β）将包括E盒结合锌指蛋白1/2（Zinc finger E‑box‑binding homeobox 1/2,ZEB1/2）在内的转录因子激活。TGF-β介导的信号通路是目前被广泛接受的调节EMT的机制[19]。上皮剪接调节蛋白1和2（epithelial splicing regulatory proteins 1 and 2,ESRP1 and ESRP2）的功能是调节细胞上皮表型相关的AS事件，在TGF-β诱导的EMT过程中表达减少，诱导成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor,FGFR）的异构体转换，使得细胞对FGF-2敏感[20]。FGFR1～FGFR4的胞外配体结合部分由三个免疫球蛋白样结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）组成，所有FGFR基因的7号外显子编码Ⅲ结构域的N端，8、9号外显子编码C端（分别产生Ⅲb和Ⅲc异构体）。越来越多的证据表明FGFR1可能通过与FGF2相互作用在OSCC侵袭转移中发挥重要作用[21]。ZEB1/2在侵袭性癌细胞中维持高水平表达，结合至ESRP1/2的启动子区域抑制其转录。低表达ESRP1/2和高表达ZEB1/2的癌细胞与侵袭行为和不良预后相关，且只表达FGFRⅢc亚型；表达低水平ZEB1/2和高水平ESRP1/2的细胞与良好的预后相关，并呈FGFRⅢb亚型的组成性表达。可总结：（1）OSCC早期时，TGF-β逐渐积累，进而通过诱导ZEB1/2的表达诱导EMT；（2）ZEB1/2表达增加，OSCC细胞只表达FGFR1Ⅲc，分泌的可溶性因子FGF2（FGF2 mRNA在间充质样细胞中高表达）激活FGFR1Ⅲc和细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2），从而维持ZEB1/2的高表达；（3）因FGF2自分泌信号由TGF-β启动并由FGF2维持，故即使在无TGF-β的情况下，细胞也能维持EMT表型；（4）OSCC细胞间充质表型的维持已从TGF-β信号轴转为FGFFGFR信号轴[22]。

2.6 ΔNp63β

p 63 为p 53 的同源基因，其两类转录产物之一ΔNp63有三种剪接变体ΔNp63α、ΔNp63β和ΔNp63γ。已证明ΔNp63β介导了OSCC中的EMT[23]。研究表明，一些miRNAs通过靶向EMT相关转录因子也参与了EMT，miR-205就可能和ΔNp63β通过调控OSCC中ZEB1/2的表达抑制EMT[24]。

2.7 ORAOV1-B

染色体11q13区域的基因被认为在OSCC进展特别是肿瘤转移过程中发挥关键作用。口腔癌过表达序列1（oral cancer overexpressed 1,ORAOV1），位于11q13的一个候选OSCC癌基因，其剪接变体ORAOV1-A与较差的组织学分化相关；ORAOV1-B为长非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA），与OSCC转移相关，其可直接与Hsp30结合激活NF-κB-TNFα环路以诱导EMT[25]。

2.8 XBP1

内质网应激过程中的关键成分即被视作标记物的X盒结合蛋白1（X-box binding protein 1,XBP1）的mRNA，在非常规剪接下得以表达转录因子XBP1。OSCC细胞中给予MG132（一种蛋白酶抑制剂，能诱导内质网应激并部分下调XBP1的表达）的同时阻断XBP1 mRNA的剪接，可导致严重的内质网应激反应从而激活一系列促凋亡信号通路，OSCC细胞凋亡且生存途径被阻断。这种旨在延长内质网应激的治疗方法可能是新的、有效的癌症治疗策略[26]。

3 OSCC中基于选择性剪接的预后模型

有两篇文献基于TCGA HNSCC数据集中提取的OSCC数据识别出了与预后相关的AS事件，并开发了OSCC的预后AS模型。一篇Zhang等[27]开发的综合预测模型（训练队列和验证队列的曲线下面积分别为0.891和0.70）具有好的敏感度和准确性，在风险评估和预后预测方面表现良好，对TNM分期等是很好的补充；OSCC中7种SF——RBM4、HNRNPD、HNRNPC、HNRNPH3、CELF2、SRP54和SRSF9与患者生存相关，SF-AS调控网络表明大多数预后不良的AS事件与SF呈正相关，SF过表达可能促进预后不良AS事件的发生。另一篇Cao等[28]开发的模型中3年和5年总生存期的曲线下面积分别为0.83和0.82；bootstrap验证模型（内部验证的首选方法）和5倍交叉验证模型中3年和5年的曲线下面积分别为0.83和0.82。依据模型，纳入的患者可分作高风险组和低风险组，研究两组患者对138种化疗药物的敏感度，发现3种筛选药物（MK.2206、EHT.1864和Nutlin.3a）在低风险组中的IC50明显降低。研究鉴定了5个与生存相关的SFs——CELF2、TIA1、HNRNPC、HNRNPK和SRSF9，机制各异。

4 总结

尽管OSCC的治疗取得了显著进展，但其5年总生存率几乎无变化，约为50%。OSCC中AS的调节失控和下游靶基因的表达失调提供了新的潜在的生物标志物和治疗靶点，基于TCGA HNSCC数据集的AS预后模型正在开发，与细胞增殖、迁移、侵袭、抗凋亡和化疗耐药过程相关的选择性剪接事件发挥的作用及相关机制，使利用反义寡核苷酸等新治疗方法的探索成为可能。