长链非编码RNA作为ceRNA在胃癌上皮间质转化中的作用研究进展

唐银炳，张鹤腾，张文波，蒋鹏程

0 引言

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，是癌症相关死亡的第三大原因，2020年全球新发胃癌病例约占所有癌症的5.6%，死亡病例占7.7%，对全球卫生健康构成了沉重负担[1]。深入探究胃癌的发病机制，尤其是胃癌的转移机制，对于胃癌的诊治具有重要意义。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是细胞从上皮表型转化为间质表型的过程，在肿瘤的进展和转移中发挥着重要作用。众多研究表明EMT与胃癌的预后密切相关，是胃癌晚期转移的关键环节，现阶段关于EMT调控机制的研究和EMT机制在胃癌领域的转化应用研究仍有待突破。近些年随着非编码RNA研究的深入，ceRNA网络被发现，其涉及lncRNA、circRNA、miRNA和mRNA等多个RNA分子，可广泛参与肿瘤细胞的增殖和转移，并与EMT的关系密切。本文综述了lncRNA作为ceRNA在胃癌EMT中发挥的作用和分子机制，从而加深在胃癌等恶性肿瘤中ceRNA网络的认识。

1 胃癌与EMT

EMT是上皮表型细胞向间充质表型细胞转化的过程，与胚胎发育、伤口愈合、纤维化以及癌症转移有关。其与间质上皮转化（mesenchymalepithelial transition,MET）之间的变换为肿瘤细胞适应微环境提供了基础，是肿瘤发展与转移过程中的重要环节，也是肿瘤免疫逃逸和治疗抵抗的重要因素。在EMT过程中，上皮细胞失去了原本的形态和黏附能力，细胞极性降低，E-cadherin等上皮标志表达下调，而N-cadherin、Vimentin和Fibronectin等间质标志表达上调。上皮表型的丧失与间充质表型的获得，使肿瘤细胞获得转移和侵袭能力，从而发生远处转移。

适当的微环境刺激，如生长因子、细胞因子、缺氧、细胞外基质和免疫反应，或信号通路的突变激活可能诱发EMT，从而影响肿瘤细胞的EMT/MET平衡。EMT的调控是一个复杂的网络，EMT转录因子（如SNAIL/SLUG、TWIST1/2、ZEB1/2）在其中发挥着关键诱导作用[2]，此外EMT的调控还与细胞因子、miRNAs（如miR-200家族）等的参与有关，并涉及TGF-β、Wnt/β-catenin和Notch等多个信号通路。

众多研究表明，EMT与胃癌患者的不良预后密切相关，是导致胃癌转移的重要原因。研究胃癌EMT的潜在调控机制，探索新的调控因子，将进一步阐明胃癌的发生发展机理，为胃癌的诊治提供有效手段。

2 LncRNA在胃癌EMT中的作用

LncRNA是一类长度超过200个核苷酸的功能性RNA分子，除部分短肽外，几乎没有编码蛋白的潜能。其广泛参与了人体生物学行为的不同层次，如细胞发育、干细胞分化、细胞稳态和疾病等，特别是在癌症领域，lncRNA发挥着极为关键的作用。研究报道大量lncRNA在肿瘤组织中异常表达，其中多种lncRNA分子与胃癌的发生发展密切相关[3-4]。lncRNA可以通过不同方式调控胃癌的进展，如影响细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡等，此外，lncRNA在胃癌细胞的侵袭与转移中也发挥着重要调控作用，而这一过程与EMT的发生极为密切。

lncRNA可发挥信号、诱饵、支架和向导作用，通过与DNA、mRNA、蛋白质、非编码RNA等生物分子进行通信，在基因、转录和转录后等多个水平调控胃癌的EMT过程:（1）染色质修饰：HOTAIR可招募多梳抑制性复合物2（PRC2），使组蛋白H3赖氨酸27（H3K27）在E-cadherin启动子处由乙酰化转为甲基化状态，诱导胃癌EMT[5]；（2）转录调控：有研究发现PVT1在胃癌细胞中通过850-1770 nt片段与转录因子STAT3相互作用并将其激活，促进STAT3向SLUG启动子募集并上调SLUG表达，从而触发EMT[6]；（3）调控mRNA：研究发现ZEB2-AS1通过阻止其mRNA中包含IRES元件的内含子的剪接促进ZEB2翻译过程，或可在转录后水平诱导胃癌EMT的发生[7-8]；（4）调控蛋白质：linc00261可增强GSK3β和SLUG之间的相互作用促进SLUG蛋白的降解，同时linc00261本身也可降低SLUG蛋白的稳定性，从而抑制胃癌EMT进程[9]；（5）miRNA海绵：lncRNA可以通过竞争性结合miRNA，改变其下游靶基因的表达，调控肿瘤的EMT，见图1。近年来，越来越多的研究证实在胃癌EMT过程中存在lncRNA参与的ceRNA网络。

3 ceRNA网络

microRNA（miRNA）是一种长度约20～24个核苷酸的内源性小RNA，可与mRNA中的miRNA识别元件（MREs）互补配对。成熟的miRNA将miRNA程序化RNA诱导沉默复合物（miR-RISC）引导到MREs，引起mRNA的稳定性下降或者翻译抑制。与此同时，非编码RNA亦可通过MREs与miRNA竞争性地结合，导致miRNA水平降低和活性减弱。Selmena等在此基础上提出了ceRNA假说[10]，这些非编码RNA被称为ceRNA或miRNA海绵，可通过miRNA靶向下游mRNA发挥作用，同时也作为非编码RNAs之间相互“通信”的新语言。

ceRNA机制的发现揭示了更为复杂和精细的转录调控网络，涉及包括lncRNA、circRNA、假基因RNA、mRNA、tRNA和rRNA等多种RNA分子，研究发现一个ceRNA可结合多个miRNA，而每个miRNA又能靶向大量的MREs并抑制多达数百个转录本，预计超过60%的人类蛋白质编码基因是其潜在靶标，提示ceRNA-miRNA-mRNA的相互作用广泛参与人体的生理病理过程。研究表明lncRNA作为ceRNA影响了众多肿瘤的发生、转移和放化疗抗性等[11]，与胃癌的恶性进展密切相关[12]。

4 LncRNA作为ceRNA在胃癌EMT中的作用

有关EMT的研究对于阐明胃癌的发病机制极为关键，目前已有大量研究证实lncRNA可作为miRNA海绵，与miRNA及下游靶基因共同构成ceRNA网络，调控胃癌的EMT过程，见图2。

4.1 调控EMT诱导转录因子

在这些ceRNA网络中，最重要的是lncRNA与EMT诱导转录因子之间的关系。ZEB1/2是在ceRNA网络中研究最多的EMT诱导转录因子，Yuan等发现CAT104在胃癌细胞中高表达，并可促进胃癌细胞的迁移和侵袭，这一过程与其竞争性结合miR-381上调ZEB1的表达有关[13]，提示CAT104可通过ceRNA机制诱导胃癌EMT。此外HOTAIR、CASC15、MAGI2-AS3、SNHG6、ZEB1-AS1、H19、UCA1等lncRNAs也可作为ceRNA调控ZEB1/2[14-21]。研究发现，EMT诱导转录因子SNAIL和SLUG也可与某些miRNAs（PVT1、SNHG7、GCMA等[22-24]）特异性结合，从而受到lncRNA的调控，介导胃癌EMT进程。Wang等[22]发现PVT1作为miRNA海绵可通过miR-30a，上调SNAIL的表达，促进胃癌细胞的迁移，而过表达miR-30a逆转了SNAIL表达水平的变化和胃癌细胞表型的改变。目前尚没有lncRNA通过ceRNA机制调控TWIST的报道。

4.2 调控EMT相关标志物

有研究表明，上皮/间质标志物也可成为miRNA的直接靶点，间接受lncRNA的调控，参与胃癌EMT进程。Chen等[25]在胃癌细胞中通过双荧光素酶报告基因检测发现RP11-789C1.1/miR-5003/E-cadherin轴的存在，沉默RP11-789C1.1可以降低胃癌细胞中E-cadherin的表达，促进EMT的发生，这是目前唯一被证实直接涉及上皮标志物E-cadherin的ceRNA网络。间质标志物Vimentin（VIM）也被发现通过ceRNA机制参与胃癌EMT调控过程，Guo等[26]研究发现lnc01503作为致癌lncRNA，可通过结合miR-133a-5p上调Vimentin的表达，从而促进EMT进程及胃癌进展。

4.3 调控其他转录因子

除此之外，lncRNA也可通过miRNA调控其他肿瘤相关转录因子进而影响胃癌EMT。上游刺激因子1（USF1）是基本螺旋环螺旋亮氨酸拉链（b HLH LZ）家族转录因子的重要组成部分，可以与基因启动子区域的E盒结合，在包括癌症在内的众多疾病中作为重要调控因子发挥作用。Sun等[27]发现LOXL1 AS1和USFI在胃癌中高表达，并通过研究证实LOXL1 AS1可竞争性结合miR-708-5p上调USF1，诱导胃癌细胞增殖、迁移和EMT。在胃癌ceRNA网络中，SOX4、HMGA1、OCT1、EGR2等转录因子也参与了EMT的调控[28-31]。

4.4 调节表观调控因子

Zeste基因增强子同源物2（EZH2）是PRC2的催化活性亚单位，可对H3K27进行甲基化修饰，从而介导目的基因沉默和转录抑制。研究发现XIST的高表达与胃癌侵袭性肿瘤表型及不良预后相关，而EZH2是XIST负向调控基因miR-101的直接靶点，EZH2受lncRNA XIST调节，发挥促进EMT等生物学效应[32]。

4.5 调控其他肿瘤相关分子

（1）γ微管蛋白环状复合物是微管的一种高效集结结构，其蛋白组分（GCPs）决定了物质在微管中的运输形式和方向，微管蛋白的组装变异与包括癌症在内的多种疾病有关，而关于GCPs如何影响肿瘤发生发展的机制尚未完全阐明。GCP5是γ微管蛋白环状复合物的组分之一，Dong等[33]发现HOTAIR可负向调控miR-217在胃癌中的表达，通过抑制miR-217上调GCP5表达，从而促进胃癌的增殖、凋亡与EMT过程，这为研究GCPs在肿瘤尤其是胃癌EMT中的作用提供了思路；（2）Makorin环指蛋白3（MKRN3）被认为具有泛素-蛋白同肽连接酶（E3）活性，同时也可作为转录调节因子发挥作用，该基因的突变与女性性早熟有关。Xu等[34]发现PCAT6通过miR-30靶向MKRN3，可促进胃癌EMT的发生，一定程度上验证了青春期基因调控与癌症易感性的关系；（3）CLDNs家族是维持细胞间紧密连接结构的关键蛋白，广泛分布于各种上皮组织，参与上皮细胞渗透压的维持、屏障功能和免疫防御过程，同时与肿瘤的发生发展联系紧密。CLDN4是CLDNs家族的重要成员，在胃癌、胰腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中存在表达模式的改变，其异常表达可引起细胞间紧密连接的破坏，降低细胞间黏附的稳定性，从而促进肿瘤细胞的分离和转移。研究发现RTAP5-AS1、TUBB2A可通过减少miRNA对CLDN4的抑制，促进胃癌EMT过程[35]；（4）DNAJB12是一种内质网相关的Hsp40家族蛋白，在严重的内质网应激下DNAJB12可被降解并促进癌细胞凋亡，同时该基因的缺失可增强促凋亡化疗药物的敏感度。而Ma等发现在胃癌中HCG18通过竞争性结合miR-152-3p上调DNAJB12的表达，引起E-cadherin等上皮标志物表达下调、间质标志物Vimentin表达升高[36]，提示HCG18/miR-152-3p/DNAJB12轴可能通过影响凋亡之外的方式调控EMT过程；（5）ADAM9是ADAMs家族的成员，是一种膜锚定蛋白，该家族主要通过崩解素结构域黏附和金属蛋白酶结构域脱落包括E-cadherin在内的多种细胞表面蛋白，促进肿瘤进展、治疗耐药和癌症转移。Yin等[37]发现linc00689通过调控miR-526b3p/ADAM9轴促进了胃癌的EMT过程；（6）血管生成素2（Angiopoietin-2,ANGPT2）是受体酪氨酸激酶Tie-2的配体，主要由内皮细胞产生，是血管成熟的关键因子，ANGPT2的上调与肝癌、神经胶质瘤等多种肿瘤的恶性侵袭有关。Piao等[38]检测发现ANGPT2在胃癌中呈高表达，其表达水平与不良预后相关，进一步研究发现linc00184可以通过阻断miR-145对ANGPT2的抑制作用，促进胃癌细胞的生长、侵袭和EMT。

此外尚有一些ceRNA网络中的miRNA下游靶基因未被发现，仍需要后续的实验研究加以完善，如沉默PCAT6后miR-15a的水平得到上调，从而抑制RB/E2F和Wnt/β-catenin信号通路，最终促进胃癌间质表型的转变[39-40]，针对RB/E2F和Wnt/β-catenin信号通路关键分子的研究或可找到miR-15a的直接靶点，在ceRNA机制上解释上述现象。

值得注意的是，lncRNA作为ceRNA可以结合多个miRNA，而同一个miRNA又可结合多个MREs，引起不同信号通路的改变，因此ceRNA网络中单个分子发挥的作用及作用对象并非完全单一，它们之间发生的次级、间接和协同作用共同影响着胃癌的EMT过程。Song等发现KRTAP5-AS1、TUBB2A与miR-3620-3p、miR-596在胃癌细胞中组成EMT调控网络，协同促进CLDN4的表达，从而下调E-cadherin，上调N-cadherin,TWIST1和ZEB2，最终诱导EMT的发生[35]。同时lncRNA和miRNA也可互相调控，并影响对应靶基因的表达。如miR-141与H19特异性结合，前者可调控H19的靶基因（miR-675、Igf1r和Igf2）表达，而H19也调节miR-141靶基因ZEB1的变化[19]。除特异性结合miRNA外，lncRNA也可通过其他方式抑制下游miRNA，Liu等发现HOTAIR通过与PRC2结合表观沉默miR34a基因，下调C-Met（HGF/C-Met/SNAIL通路）和SNAIL的表达，从而促进胃癌细胞的EMT，加速肿瘤的转移[41]。而lincRNA-ATB则在作为ceRNA直接结合miR-141-3p的同时[42]，可通过TGF-β间接调控miR-200s（TGF-β/miR-200s/ZEB轴），诱导胃癌EMT[43]。关于这一方面的研究可以进一步完善胃癌EMT中ceRNA网络的构建，见表1。

表1 胃癌EMT中的lncRNA/miRNA/mRNA网络Table 1 LncRNA/miRNA/mRNA network in EMT of gastric cancer

5 结论和展望

综上所述，胃癌由于起病隐匿、晚期治疗困难，是困扰公共健康的重大难题。EMT是肿瘤进展过程的重要环节，除了参与肿瘤侵袭，还可维持肿瘤细胞干细胞特性、介导免疫逃逸、拮抗化学免疫疗法等，因此关于胃癌与EMT的研究至关重要。

ceRNA网络在胃癌EMT中具有重要的调控作用，目前利用生物信息学工具，围绕胃癌EMT建立的ceRNA调控网络正被不断拓展和完善。这些新发现的功能网络尚需要可靠的实验去验证，同时以往实验中非编码RNA的浓度常常被人为地放大，导致其研究结果并不能很好地反映真实生理水平中ceRNA网络的功能。此外，目前大部分研究主要集中在单个轴或单个分子上，缺乏对于ceRNA网络复杂性的认识和整体把握。这需要在大量可靠实验的基础上归纳出网络中的共性规律，从而使ceRNA网络作为更加系统的理论依据，为阐明胃癌的进展与转移机制提供思路，并在已有的基础上进行临床转化，以期获得更有前景的胃癌检测与治疗策略。