生物标志物在肺癌早筛早诊应用中的研究现状

李辉辉，孙小单，赵沛妍，张爽，程颖

0 引言

最新癌症统计数据显示，2020年全球约有220.7万肺癌新发病例，约有179.6万肺癌死亡病例[1]。肺癌起病隐匿，进展迅速，早期临床症状通常不明显，待出现特异性表现时，已错失治疗黄金时期[2]。因此，全球各大医疗研究机构均将肺癌早期筛查作为肺癌防治的重点，并在相关研究中取得了突破性进展。其中，影像学检查中低剂量螺旋CT（low-dose computed tomography,LDCT）的筛查价值已被著名的国家肺癌筛查试验（national lung screening trial,NLST）[3]证实。随着LDCT在国内外的广泛应用，很多问题逐渐突显出来，包括高危人群的定义标准不一、假阳性率过高、过度诊断及成本效益问题等。现在，我们迫切需要开发新的筛查方式来解决LDCT存在的问题，从肺癌发病机制上着手开展研究，将目光放在生物标志物上。近年来“液态活检”技术作为一种非侵入性检查方式逐渐受到关注，其在肺癌早筛早诊中显示出了一定的潜力[4]。因此，寻找适合肺癌早期诊断的生物标志物是我们未来需要努力的方向。

1 生物标志物用于肺癌早期诊断的研究

1.1 肿瘤标志物

肿瘤标志物在肺癌的诊断与鉴别诊断中占据重要地位。据现有研究表明[5]，肺癌发病与进展过程中，癌胚抗原（CEA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）、胃泌素释放肽前体（ProGRP）和鳞状细胞癌抗原（SCCA）等为肺癌相对高特异性的肿瘤标志物。一项在中国人群中进行的以肿瘤标志物为研究对象的大规模多中心研究，成功开发了肺癌风险模型，该模型在肺癌早期诊断中显示出了很好的预测效能，并且这些新模型适用于中国高危人群[6]。最新研究显示[7]，联合检测以上五种肿瘤标志物，可弥补单一标志物检测敏感度相对不足的缺点，进一步提高了肺癌诊断效能，但早期患者的阳性率（35.29%）明显低于晚期患者（76.34%）。虽然多项研究都证实了传统肿瘤标志物可以辅助诊断肺癌，但对于肺癌早期诊断阳性率较低。

1.2 肺癌相关自身抗体

肺癌相关自身抗体的检测也是当前肺癌早期诊断的研究热点之一。有研究发现[8]肺癌自身抗体组合在肺癌高危人群中检测具有高特异性，但敏感度相对较低，这种抗体组合被称为EarlyCDTLung。为评估EarlyCDT-Lung对肺癌早期诊断的能力，进行了一项大规模前瞻性筛查研究[9]，结果表明，在偶发肺结节的患者中，使用EarlyCDT-Lung作为辅助手段诊断肺癌与单独通过CT监测此类结节相比可获得更好的成本效益。而最近有研究[10]对EarlyCDT-Lung检查在高危人群中的价值作了进一步的探讨，发现其检测肺癌的敏感度仅为33%，此研究结果提示EarlyCDT-Lung检测尚不可以作为肺癌筛查标准的一部分，暂不适合应用在肺癌早期筛查中。7种肺癌自身抗体（7-AAB）是最近研究的热点，有研究前瞻性的验证了其对肺癌诊断的价值，特异性为90.2%，阳性预测值为92.7%，并且根据7-AAB结果构建了肺癌风险预测诺模图，该预测模型在肺癌的诊断中显示出了巨大的潜力[11]。

1.3 外泌体

近年来关于外泌体作为新型潜在标志物诊断早期肿瘤的研究越来越多。外泌体作为遗传物质的载体，可以实时监测肿瘤动态变化，在肺癌诊断和治疗方面均有很好的价值[12]。外泌体通过参与肺癌的多种生物学过程，影响着肿瘤细胞的微环境，从而参与肺癌的形成和进展。因此，外泌体相关研究在推进肺癌早期筛查进展中具有重要意义[13]。

1.3.1 肺癌相关的外泌体miRNA miRNA是一类短链非编码RNA，主要在转录水平对基因进行表达调控，因此，其可能在肺癌发病过程中扮演着重要作用[14]。为证明miRNA对肺癌诊断的能力，Jin等[15]应用miRNA测序方法对46例Ⅰ期非小细胞肺癌（NSCLC）患者和42名健康者进行外泌体miRNA图谱分析，发现miRNA可以区分鳞癌和腺癌，其中miR-181b-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p、miR-361-5p是肺腺癌特异性标志物，而miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b是肺鳞癌特异性标志物。该研究证实了外泌体miRNA在肺癌诊断方面的价值。Kanaoka等[16]发现外泌体miR-451a在NSCLC患者中高表达，并且其表达水平与疾病进展呈正相关，在肺癌分期中显示出了显著相关性。另外，有研究报道[17]，miR-660-5p在NSCLS患者血浆中的水平显著升高，并且miR-660-5p可能通过下调KLF9促进NSCLC的进展，该研究仅证实了KLF9一个靶点，还需要进一步研究miR-660-5p发挥作用的其他机制。Huang等[18]分析从临床血清标本中提取的外泌体发现，NSCLC患者外泌体miR-34c-3p的水平较健康者明显降低，进一步研究发现低水平miR-34c-3p通过上调整合素α2β1促进NSCLC的侵袭和迁移。因此，外泌体miR-34c-3p参与了NSCLC的发展，可以作为肺癌早期诊断的标志物。Liu等[19]利用荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测技术，发现miR-216B能区分NSCLC患者和正常者，敏感度和特异性分别为86.7%和75.0%，结果明显优于肿瘤标志物（CEA、CYFRA21-1、SCCA），与肿瘤标志物联合检测特异性和敏感度均有提高，并且miR-216B低表达与淋巴结转移、TNM分期等密切相关，该研究证实了外泌体miR-216B可作为NSCLC患者总生存期的独立预测因子。最近有研究评估miRNA的敏感度和特异性，发现miR-20a、miR-10b、miR-150和miR-223可以作为NSCLC诊断的良好生物标志物，而miR-205是诊断鳞状细胞癌的特异性生物标志物[20]。

1.3.2 肺癌相关的外泌体蛋白质 除miRNA外，外泌体内还含有丰富的蛋白质。外泌体蛋白携带肿瘤特异分子，可以在肺癌发病早期发现[21]。有研究[22]对比分析了外泌体蛋白图谱，发现有三种外泌体蛋白（CD151、CD171和Tetraspan8）是鉴别肺癌患者与正常者的生物标志物，其中CD151、Tetraspan8在肺鳞癌中高度表达，而CD151可作为小细胞肺癌特异的蛋白标志物。该研究展示了外泌体蛋白作为生物标志物的应用前景，未来还需要进一步优化外泌体标志物模型来验证外泌体蛋白诊断肺癌的能力。Gao等[23]用ELISA法检测103例NSCLC患者和29名健康对照者外泌体中TIM-3和Galectin-9的含量，发现它们在NSCLC患者中高表达，并且与肿瘤大小、远处转移等预后因素呈明显相关性。为进一步研究外泌体蛋白在肺癌发生过程中的作用，有研究[24]分析了肺癌来源的外泌体TRIM59蛋白，发现其通过激活巨噬细胞促进肺癌进展，癌细胞与激活的巨噬细胞相互作用导致NLRP3炎性反应体活性失调，从而驱动肿瘤的进展。

现有的研究发现了大量的miRNA及外泌体蛋白参与肺癌的发病过程，有望成为肺癌早期诊断最有前途的液体活检标志物[25]。目前外泌体的分类较多，关于其研究结果重叠太少，肺癌特异性外泌体还需要大样本临床研究进一步探讨。

1.4 循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell,CTC）是存在于循环系统的肿瘤细胞，其来源于肿瘤病灶脱落，可作为肺癌诊断的一种指标[26]。在一项研究中[27]，将CTCs分为上皮型（E-）、间叶型（M-）和上皮-间叶型（E&M-）CTC，18例Ⅰ期肺腺癌中有17例可检测到CTC，其中E-CTCs检出5例，M-CTCs检出10例，E&M-CTCs检出14例，另外20名健康对照组中未发现CTC，该研究提示早期肺腺癌患者中可检测到CTCs。Lv等[28]通过检测NSCLC患者中CTC，发现肿瘤大小、淋巴结转移和病理分期与CTC计数增高显著相关，表明通过CTC检测有利于评估肺癌的发展情况。Li等[29]采用负富集-荧光原位杂交（NE-FISH）方法检测肺癌患者的CTC，结果显示，CTC诊断肺癌的敏感度和特异性分别为68.39%和100%，但该研究没有发现CTC计数与肺癌的病理特征有明显相关性，之后该研究又联合了肿瘤标志物，发现联合检测的敏感度为78.69%，这提示我们CTC与肿瘤标志物联合检测可能是未来的发展方向。一项前瞻性多中心队列研究的结果否定了CTC检测在肺癌早期筛查的价值，该研究应用ISET技术测试CTC诊断肺癌的能力，发现即使是在肺癌高危人群中，CTC检测的敏感度也很低[30]。该研究结果虽然不如预期的那样理想，但是并不代表CTC检测在肺癌早期诊断中没有可能性，未来我们还应使用不同的检测方法来进一步验证和评估CTC对于肺癌早期诊断的价值。

1.5 循环游离DNA与循环肿瘤DNA

循环游离DNA（circulating free DNA,cfDNA）存在于外周血中，来源于肿瘤细胞和正常细胞（主要是淋巴细胞），其中把来自肿瘤细胞的cfDNA称之为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）[31]。近年来，ctDNA及cfDNA检测在肿瘤的诊断方面受到了广泛的关注，有望为肺癌早期诊断提供可靠的方向[32]。一项前瞻性研究中使用DELFI技术对365例肺癌高危人群进行cfDNA的基因测序，发现被诊断为肺癌的患者中检测出大量cfDNA片段突变，之后又在385例非癌症患者和46例肺癌患者中验证了该技术的有效性[33]。另外，还有被开发出来的新技术是GRAIL，该技术通过检测cfDNA中突变位点或甲基化谱作为阳性信号，其中甲基化谱具有更高的敏感度。GRAIL研究团队进一步探讨了cfDNA甲基化信号与多种癌症预后的相关性，发布了循环游离基因组图谱（circulating cell-free genome）最新数据，结果表明泛癌种早筛（multi-cancer early detection,MCED）没有检测出的癌症比检测出的癌症预后更好[34]。除了泛癌筛查分析的液态活检技术，针对肺癌的基因测序分析方法不断被开发出来。有研究采用靶向测序方法检测58例早期NSCLC患者的血液和肿瘤样本，发现在EGFR、KRAS、PIK3CA和TP53中存在ctDNA和组织DNA（tissue DNA,tDNA）的驱动突变，该研究证实ctDNA突变在肺癌进展中发挥着不可忽视的作用，并展示了ctDNA检测在NSCLC诊断中的潜在应用价值[35]。之后有研究[36]分析了早期NSCLC患者ctDNA检测与组织学类型的相关性，发现肺鳞状细胞癌ctDNA突变检出率明显高于肺腺癌，提示ctDNA检测与早期NSCLC的组织学亚型和基因突变相关，其对早期NSCLC的临床诊断和组织学分型具有潜在的优势。这些发现还需要大样本前瞻性的研究来验证。随着ctDNA检测技术的不断开发和应用，ctDNA的诊断率有了更大的提高[37]。有研究开发出来一项超敏感的ctDNA分析技术—CAPP Seq，该技术可识别95%以上的肿瘤突变，应用该技术分析NSCLC患者的ctDNA，发现Ⅰ期患者敏感度为50%，Ⅱ～Ⅳ期患者的敏感度为100%，检测特异性为96%，并且错误率可降至0.02%[38]。为进一步提高早期患者ctDNA检测的敏感度，在此成果的基础上，Chabon等[39]对CAPP Seq进行了优化，进一步开发了基于NGS和机器学习的Lung-CLiP（lung cancer likelihood in plasma）的检测技术，为肺癌的早筛早诊提供了更敏感的检测方法，但该方法还需要前瞻性试验来验证。ctDNA检测技术的进步为肺癌早期诊断提供了可能，并且Lung-CLiP检测技术有望成为ctDNA检测的一种新手段，未来该检测技术与LDCT结合可能会进一步提高肺癌筛查能力。

1.6 DNA甲基化

近年来随着对DNA甲基化的深入研究，其已成为用于肺癌早期诊断和预测治疗的新型生物标志物。SHOX2甲基化从2010年就开始作为生物标志物被国内外研究，研究发现[40]SHOX2基因在许多恶性肿瘤中都异常表达，并且在肺癌的癌组织中高度甲基化。为进一步探讨SHOX2甲基化对肺癌诊断的价值，多次研究[41-42]发现SHOX2和RASSF1A基因在肺癌的进展中扮演着重要的角色，并且联合检测可以明显提高肺癌的诊断效果。DNA甲基化检测在肺癌早期诊断中发挥着巨大的潜力，其价值值得我们探讨，因此，越来越多的研究者开始开展此类研究，Liu等[43]发现NSCLC患者血浆和尿液中CDO1、Tac1、HOXA9和SOX17基因甲基化的检出率高于对照组，进一步提示DNA甲基化水平可以为肺癌的早期诊断提供参考。另外，有研究发现[44]，DNA甲基化水平升高可促使肿瘤的发生发展，并提出构建基因甲基化模型用于肺癌早期诊断的可能性。为了验证甲基化模型的价值，基于肺癌患者抑癌基因（FHIT、CDK10、P16、MGMT、RASSF1A、APC、EGFR、DAPK）启动子CpG岛甲基化筛查模型被构建出来，发现以上基因启动子区CpG岛甲基化水平升高可促进肺癌的发生，该模型可用于肺癌高危人群的早期筛查[45]。综上，我们已在肺癌患者中发现多种异常的基因甲基化，并且基于抑癌基因甲基化筛查模型的出现，预示着DNA甲基化检测在肺癌早期诊断中具有巨大优势，但未来我们仍需深入探索，找出针对肺癌早期诊断特异的甲基化标志物，使甲基化检测为肺癌早期诊断提供全新的依据。

2 代谢组学技术在肺癌诊断的应用

近年来代谢组学辅助诊断肺癌已成为研究的热点，有研究[46]通过使用核磁共振氢谱（1H NMR）评价代谢组学在肺癌诊断的潜力，发现NSCLC患者血清样本中表现出特殊的代谢组学特征，并且早期和晚期代谢组学特征有显著差异，这一研究结果提示通过代谢组学特征可能有助于区分NSCLC患者和健康者。为证明代谢组学是一种很有前途的肺癌诊断技术，另有研究[47]采用液相色谱-质谱法（LC-MS）检测肺癌患者和对照组的代谢物浓度，分析发现14种代谢产物（其中包括6种多胺途径的代谢物）可以正确区分肺癌患者和健康者。这一研究结果肯定了代谢组学在肺癌诊断中的潜在价值。近年来，肺癌在非吸烟女性中的发病率逐渐上升，为揭示非吸烟女性NSCLC患者血清学代谢特征，有研究[48]采用假靶向气相色谱-质谱法分析非吸烟女性代谢谱发现，NSCLC非吸烟患者中共有51条代谢途径发生明显改变，并定义了三种代谢物（半胱氨酸、丝氨酸和单油酰甘油）可作为诊断NSCLC的生物标志物组合。这一发现可能为非吸烟女性肺癌患者的发病机制提供了线索。为验证代谢组学在癌症高危人群中的诊断价值，有研究[49]分析了参与肺癌筛查研究者的血清代谢组谱，观察到癌症患者血清中脂质水平降低，特别是胆固醇酯，结果显示基于代谢组学的生物标志物既可用于筛选肺癌高危人群，也可用于鉴别良、恶性结节，但血清代谢物具有很大的异质性。因此，基于代谢组学的生物标志物用于肺癌的早期诊断还需要考虑可能影响血清代谢物水平的其他因素。以上研究都提示了代谢组学在肺癌早期诊断的潜力，此技术从代谢水平揭示了肺癌发生发展的过程，但由于个体的差异性以及机体内环境的复杂性，还没有找到肺癌特异性表达的代谢产物，并且现有研究都是小规模研究，未来我们需扩大研究力度，使代谢组学技术成为肺癌早期诊断的新方法。

3 小结及展望

综上所述，液态活检技术可以作为肺癌早期诊断的一种辅助手段，这一检测技术可改善LDCT筛查肺癌存在的过度诊断和假阳性率过高等问题，并且联合检测可提高肺癌诊断的敏感度和特异性。目前多数新型生物标志物尚处在研究阶段，临床应用方面还未发展成熟。因此，未来我们还应从基因组学、蛋白质组学、表观遗传学、转录组学、代谢组学等多组学寻找特异生物标志物建立肺癌早诊模型，使液态活检技术为肺癌筛查和早期诊断提供可靠依据。随着新检测技术的不断开发，生物标志物应用于肺癌早期诊断将成为可能。