补土雅解方治疗抗生素相关性腹泻的作用机制＊

肖 湉，于兴志，杨丽萍，段小花

（云南中医药大学云南省傣医药与彝医药重点实验室 昆明 650500）

世界卫生组织统计结果显示，近年来抗生素在我国医院中使用率已位居世界第一，超出国际平均水平的30%以上，且有近三成家庭自备抗生素但大多数未遵照说明书进行服药[1-2]。滥用抗生素将会引起腹泻、过敏、二重感染、肝肾损伤等不良反应[3]，其中抗生素相关性腹泻（Antibiotic-associated Diarrhea，AAD）是由于抗生素滥用导致机体内肠道菌群失调从而出现以泄泻为主要病证的常见并发症[4]。AAD 不仅会损害肠道机械屏障、破坏免疫稳态，还将影响肠道微生物的结构组成[5-6]。导致患者短期内轻则腹泻、免疫力受损引发结肠炎、胃炎等炎症疾病，重则诱发胃肠癌、全身感染危及生命[7]；亦有研究表明，儿童时期滥用抗生素将在往后生活中出现过敏、哮喘、肥胖等疾病，严重影响生活质量[8-10]。因此，如何应对抗生素滥用引发的不良反应极为关键。

傣族人民在长期的生活实践中总结并创立了傣医学中最具特色的理论体系：“雅解”学说。在傣医雅解理论指导下，“雅解方”通过调节人体四塔（风、火、水、土）、五蕴（色、识、受、想、行）功能，可用以解除食物毒性、药物毒性、解除动物叮咬中毒、解除热毒等[11]。ADD 在傣医理论中未有对应病名，但其与雅解理论中失治误治引发的巴塔维他都软（土塔不足）而产生的药物不良反应具有相同的致病原理，主要是由于机体感受病邪或因体内土塔失调而导致的脏腑功能异常，排泄功能紊乱[12-13]。“补土雅解方”是课题组在傣族地区长期进行调查研究的过程中发现的傣族雅解经验方，经过临床实践验证其对解抗生素引起的药物毒有很好的临床疗效。该验方主要由民族药组成，具有调补土塔、清火解毒、收敛止泻的功效，但有关补土雅解方解抗生素药物毒的作用及机制的文献尚未报道。因此，本实验以补土雅解方为研究对象，通过复制抗生素相关性腹泻的模型，从肠道黏膜通透性、肠道菌群移位的角度评价补土雅解方对肠道黏膜完整性的保护作用，从补土雅解方改善肠道免疫屏障、调节肠道微生态失衡等方面深入研究傣族经验方“补土雅解方”对肠道菌群紊乱的调节作用。以期为民族药治疗抗生素相关性腹泻以及作用机制提供科学实验结果的支撑，促进民族医药的发展。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级健康Spraque-Dawley 雄性大鼠60 只，体质量180±20 g，购于成都达硕实验动物有限公司（CXK（川）2018-24），实验条件和方法经云南中医药大学动物实验中心伦理委员会审查合格，动物伦理审查文件编号为：R-062022G092。每笼10 只饲养于云南中医药大学医鉴甲楼动物房内，环境清洁，温度22±2℃，湿度40%-60%，自由饮食饮水。适应性饲养至体质量达到200±20 g时进行实验。

1.2 主要试剂和仪器

补土雅解方药材均由云南省傣医药与彝医药重点实验室提供；盐酸林可霉素（160304，购于成都锦华药业有限公司）；培菲康（04720151125，购于上海信谊药厂有限公司）；二胺氧化酶ELISA Kit、髓过氧化物酶ELISA Kit、脂多糖/内毒素ELISA Kit、分泌型免疫球蛋白A ELISA Kit（CSB-E12634r、CSB-E08722r、CSBE14247r、CSB-E08412r，购于武汉华美生物工程有限公司）；胰蛋白胨大豆琼脂购于北京索来宝科技有限公司。

2 方法

2.1 分组造模与给药

60只SD雄性大鼠，随机分为6组，分别是空白组，模型组，阳性药组，补土雅解方高、中、低剂量组。除空白组外，其余各组大鼠给予盐酸林可霉素（5 g·kg-1·d-1）灌胃，连续7 天。直至大鼠毛色无光泽、体质量下降、肛周泛红且大便稀软不成形，则提示造模成功。

造模成功后，阳性药组给予培菲康（1 g·kg-1）。基于课题组前期研究，各药物组给予补土雅解方高（40.5 g·kg-1）、中（20.25 g·kg-1）、低（10.125 g·kg-1）剂量灌胃。空白组与模型组给予同体积（1 mL·100 g-1）蒸馏水灌胃。连续给药7天后取材并检测相关指标。

2.2 样本采集

取大鼠腹主动脉血4-5 mL，4℃条件下，1000 r·min-1离心15 min。取上层血清分装，-80℃冰箱保存。

大鼠解剖后，分离脾脏，剥离周围组织，用PBS 清洗干净，用吸水纸吸干液体，拍照，称重，置于真空袋中，-80℃保存。

大鼠解剖后，剥离肠周围的组织，拍照，置于真空袋中，-80℃保存。

2.3 检测指标

2.3.1 肠组织HE染色检测

解剖大鼠腹部剥离肠周围组织，于回盲部12 cm处取1.5 cm 肠组织，生理盐水清理内容物后用10%多聚甲醛溶液固定，24 h 后使用从低到高浓度乙醇及二甲苯进行脱水处理，进行石蜡包埋后切成5 μm石蜡切片。将石蜡切片使用二甲苯与从高到低浓度乙醇梯度脱蜡。室温下苏木精染色2 min，1%盐酸乙醇分化数秒，冲洗返蓝。室温下用伊红染液染色1 min，用水洗去残留染色液后。将切片用分级乙醇脱水，在二甲苯中透明，用中性树胶密封，显微镜镜检，图像采集分析。

2.3.2 血清相关指标检测

大鼠腹主动脉取血5 mL，4℃，1000 r·min-1离心15 min。取上层血清分装，使用相关ELISA 试剂盒检测二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）、脂多糖/内毒素（Lipopolysaccharide，LPS）含量。

2.3.3 肠道免疫屏障指标检测

解剖大鼠腹部剥离肠周围组织，取100 mg 加1 mL PBS 充分冰浴匀浆。将匀浆液4℃，5000 r·min-1离心5 min。取上清液，使用相关ELISA试剂盒检测检测分泌型免疫球蛋白（Secretory immunoglobulin A，sIgA）水平。

2.3.4 大鼠肠道细菌移位检测

取胰蛋白胨大豆琼脂粉40 g加入蒸馏水，121℃高压灭菌30 min，冷却至30-40℃，制成平板。解剖大鼠后取出肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏，上述脏器各取100 mg 加1 mL 巯基乙酸肉汤充分冰浴匀浆。取100 μL 匀浆液均匀涂抹于胰蛋白胨大豆琼脂平板上密封30 min，于37℃培养箱（5% CO2）中孵育48 h 后计算菌落数，每个样重复3次。

2.3.5 肠道微生态环境检测

给药最后1 天，各组随机抽取3 只大鼠，每只采集新鲜粪便1 粒，每组共3 粒。送于罗宁生物技术有限公司使用16S rDNA 的V4 高变区测序技术，利用OUT聚类与注释、α 多样性、NMDS 和样品聚类分析对肠道微生态环境进行检测。

2.4 统计方法

采用SPSS 16.0 统计软件，计量资料以均值±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 补土雅解方对AAD大鼠一般状态的影响

盐酸林可霉素灌胃7 天后，空白组大鼠精神状态良好，体质量稳定上升，饮食饮水量与粪便形态未出现异常。其余组别大鼠反应迟钝、毛发暗淡，伴随饮食量减少、饮水量增多、体质量增长缓慢，且大鼠垫料较湿，盲肠内粪便色浅且已不成形，腹泻现象较明显。经过药物治疗后，各给药组大鼠整体精神状态明显改善，饮食量饮水量逐渐恢复正常，体质量增长加快，给药结束后，盲肠内粪便已成形，稀软便基本恢复正常（见图1）。

图1 大鼠盲肠内粪便形态

3.2 补土雅解方对AAD大鼠肠组织病理形态的影响

HE 染色结果显示，空白组大鼠肠组织结构完整未见异常；而模型组大鼠肠黏膜上皮组织明显病变，水肿充血伴有细胞坏死，且结构疏松肠绒毛出现断裂；阳性药组和补土雅解方高、中、低剂量组大鼠的肠黏膜上皮组织病变均有明显改善，细胞排列趋于规则，绒毛形态修复良好分布均匀，其中高剂量组改善状况最佳（见图2）。

图2 大鼠肠HE病理切片（×40）

3.3 补土雅解方对AAD 大鼠血清中DAO、MPO、LPS含量的影响

由表1 可知，模型组相比于正常组大鼠血清中DAO、MPO、LPS 含量显著升高（P＜0.001，P＜0.01）；与模型组相比，经过各组药物治疗后大鼠血清中DAO、MPO含量明显降低（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）；各药物治疗组LPS 含量均有所下降，除补土雅解方高剂量组显著下降外（P＜0.05），其余组别差异无统计学意义。

表1 大鼠血清中DAO、MPO、LPS含量的变化（±s，n=8）

表1 大鼠血清中DAO、MPO、LPS含量的变化（±s，n=8）

注：与空白组相比，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

LPS含量（mlU·mL-1）1353.52±314.09 2089.36±678.33**1699.45±118.46 1508.56±153.40#1727.54±76.28 1765.40±129.47组别空白组模型组阳性药组补土雅解方高剂量组补土雅解方中剂量组补土雅解方低剂量组DAO含量（mlU·mL-1）1519.33±191.78 2538.23±506.18***2030.84±360.61#1691.66±190.27##1712.19±334.85##1994.83±456.80#MPO含量（mlU·mL-1）345.06±133.23 715.82±105.26***444.90±165.07#353.27±85.57###396.57±152.62##492.07±144.20#

3.4 补土雅解方对AAD大鼠肠道细菌移位的影响

由表2可知，模型组与正常组大鼠相比淋巴结、脾脏、肝脏菌落数明显上升（P＜0.001，P＜0.01），与模型组相比，经过药物治疗后各组大鼠淋巴结、脾脏菌落数均有显著下降（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）；各药物治疗组肝脏菌落数均有所降低，除补土雅解方高剂量组显著下降外（P＜0.05），其余组别差异无统计学意义。

表2 大鼠肠道细菌移位的菌落数变化（±s，n=8）

表2 大鼠肠道细菌移位的菌落数变化（±s，n=8）

注：与空白组相比，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

肝脏菌落数（CFU·mg-1）0.07±0.03 0.25±0.07**0.14±0.06 0.10±0.06#0.14±0.02 0.20±0.06组别空白组模型组阳性药组补土雅解方高剂量组补土雅解方中剂量组补土雅解方低剂量组淋巴结菌落数（CFU·mg-1）0.21±0.06 3.46±1.33***0.28±0.03###0.25±0.01###0.37±0.02###0.61±0.10##脾脏菌落数（CFU·mg-1）0.10±0.03 0.37±0.06***0.19±0.06#0.13±0.06##0.18±0.05##0.19±0.09#

3.5 补土雅解方对AAD 大鼠小肠组织中sIgA 水平的影响

由表3 可知，模型组与正常组相比大鼠小肠组织中的sIgA 水平明显下降（P＜0.001），经过药物治疗后，阳性药组和补土雅解方高、中剂量组sIgA 水平显著上升（P＜0.01，P＜0.05）；补土雅解方低剂量组sIgA 水平回升但差异无统计学意义。

表3 大鼠小肠组织中sIgA水平的变化（±s，n=8）

表3 大鼠小肠组织中sIgA水平的变化（±s，n=8）

注：与空白组相比，***P＜0.001；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别空白组模型组阳性药组补土雅解方高剂量组补土雅解方中剂量组补土雅解方低剂量组sIgA含量（μg·mL-1）810.60±98.10 369.82±59.09***506.62±99.23#588.46±124.60##517.97±132.69#468.24±74.24

3.6 补土雅解方对AAD大鼠肠道微生态的影响

3.6.1 补土雅解方对AAD 大鼠肠道菌群α 多样性指数的影响

由图3 可知，与正常组相比，模型组大鼠PD、Chao1 指数下降表示大鼠肠道微生物群落丰度降低（P＜0.001），Shannon、Simpson 指数下降表示大鼠肠道微生物群落多样性降低（P＜0.001）。经过药物治疗后，各组大鼠肠道微生物群落的α 多样性指数均有改善，其中补土雅解方高剂量组效果最佳（P＜0.001），中剂量组改善Chao1效果最为显著（P＜0.001）。阳性药组可有效改善Chao1、Simpson指数（P＜0.001，P＜0.01）。

图3 PD（a）、Chao1（b）、Shannon（c）及Simpson（d）指数（±s，n=3）

3.6.2 补土雅解方对AAD大鼠肠道菌群结构的影响

根据图4 中NMDS 与样品聚类分析可知，正常组与模型组不属于同一区域在坐标轴上距离较远，且不属于同一分支，提示两组间菌群结构差异较大。补土雅解方高、中剂量组在坐标轴上与空白组距离相近，且属于同一分支，提示两个治疗组与空白组间菌群结构较为接近。

图4 NMDS分析（a）和样品聚类分析图（b）

3.6.3 补土雅解方对AAD大鼠肠道菌群组成的影响

通过OUT 聚类与注释分析，重抽样后单个样本含9653条序列，共2034个OTU。各个组别菌群分类在门水平上的优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）。与正常组相比，模型组Bacteroidetes 和Proteobacteria 菌群占比上升，Firmicutes/Bacteroidetes 比例有所下降。其中Firmicutes 菌群占比显著下降（P＜0.01）。经过药物治疗后，各组大鼠门水平上的优势菌群占比和Firmicutes/Bacteroidetes 比例均有明显改善，补土雅解方高、中剂量组Firmicutes 菌群比例明显升高（P＜0.05）。详见表4，图5。

表4 大鼠粪便在门水平分类的优势菌群（±s，n=3）

表4 大鼠粪便在门水平分类的优势菌群（±s，n=3）

注：与空白相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05。

Firmicutes/Bacteroidetes 9.43±2.36 2.90±1.85 5.59±4.05 8.22±6.28 7.95±3.83 11.68±9.73组别空白组模型组阳性药组补土雅解方高剂量组补土雅解方中剂量组补土雅解方低剂量组Firmicutes（%）81.82±4.02 51.10±13.77**67.29±15.80 77.90±7.93#74.51±5.06#60.74±2.48 Bacteroidetes（%）8.96±1.77 21.32±8.86 15.52±8.72 13.86±9.42 11.03±5.24 13.02±15.73 Proteobacteria（%）7.34±2.77 24.94±12.28 14.71±13.95 6.40±2.45 12.62±9.29 24.28±15.94

图5 门水平物种相对丰度柱形图（a）及属水平物种相对丰度柱形图（b）

各个组别菌群分类在属水平上的优势菌群主要为厚壁菌门的乳酸菌属（Lactobacillus），变形菌门的鞘氨醇单胞菌属、绿脓杆菌属、肠杆菌属(Sphingomonas、Pseudomonas、Enterobacter）。与正常组相比，模型组中Lactobacillus占比明显下降（P＜0.01），Sphingomonas、Pseudomonas、Enterobacter占比升高。经过药物治疗后，各组大鼠属水平上的优势菌群占比均有明显改善，其中补土雅解方高、中剂量组Lactobacillus占比显著上升（P＜0.01、P＜0.05）。详见表5，图5。

表5 大鼠粪便在属水平分类上的优势菌群（±s，n=3）

表5 大鼠粪便在属水平分类上的优势菌群（±s，n=3）

注：与空白相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

Enterobacter（%）0.63±0.14 2.08±1.74 1.03±0.68 0.55±0.01 0.84±0.42 1.31±0.68组别空白组模型组阳性药组补土雅解方高剂量组补土雅解方中剂量组补土雅解方低剂量组Lactobacillus（%）77.50±4.46 42.67±8.45**60.92±17.83 74.81±8.10##69.16±3.52#56.30±1.61 Sphingomonas（%）1.32±1.03 4.69±5.39 3.84±4.45 1.41±1.52 1.62±1.25 4.31±3.30 Pseudomonas（%）1.00±0.14 2.13±0.83 1.32±0.75 0.89±0.23 1.13±0.32 1.86±0.83

4 讨论

ADD 是由于抗生素滥用使得肠道内菌群结构紊乱、屏障破坏，所引起的以腹泻为主要症状的临床常见并发症[14]。傣医由于先民聚居地域的特殊性，对“毒”有着深刻的认识，且逐渐形成其特有的“雅解”理论[15]。傣医认为ADD 归属于“药物毒”范畴，是由于药物使用不当致使四塔中土塔不足从而引发的药物毒性相关疾病，服用雅解（解药）可排除毒素，改善四塔五蕴之平衡。土塔作为傣医四塔中最重要的一塔，具有消化饮食物，化生气血，滋养躯体，排泄糟粕的功能，其病变将协调体内脏腑组织器官的功能障碍，进而引起人体内“四塔、五蕴”的失衡[16]。西双版纳傣医院制剂“雅解沙把”作为雅解方的代表药方，已有大量实验证实其可有效改善肠道菌群，用于治疗解食物毒、过敏等等[17-21]。而补土雅解方在雅解沙巴的基础上进行药味加减，由大黄藤、竹叶兰、姜味草、马蹄香等组成，具有调补土塔，收敛止泻的功效。补土雅解方是傣医临床诊疗疾病过程的记载和临床经验的总结，在治疗ADD 引起的肠道屏障受损上有很好的临床应用基础。AAD 的发病机制较复杂，其可能与肠道黏膜损伤引起的机械屏障破坏、肠壁内的免疫细胞及肠腔中的免疫球蛋白形成的免疫屏障破坏、肠道内正常的菌群结构破坏引起的肠道菌群失调等有关[22]。因此，本研究通过盐酸林可霉素灌胃复制AAD损伤大鼠模型，基于肠道微生物从机械屏障、免疫屏障以及微生物屏障3 个方面，明确补土雅解方对药物的解毒作用，探讨其初步作用机制。

抗生素的滥用不仅抑制肠道内生理性细菌活性，其导致的毒副作用和变态反应也将直接损伤肠道黏膜屏障，使肠道上皮细胞功能紊乱、通透性增加，诱发腹泻等症状[23-24]。当肠道内粪便含水量增加时，将进一步刺激肠道黏膜，加重肠道屏障受损[25]。本实验研究发现，ADD 大鼠腹泻症状明显，如饮水量增加、粪便颜色变浅且稀软不成型。补土雅解方干预后大鼠饮水量明显减少、粪便逐渐成形，给药结束后已无明显腹泻症状。

机械屏障、免疫屏障、微生物屏障共同构成的肠道屏障在防止病原体入侵机体中起到关键作用，可有效防止有害物质进入机体内循环造成损害[26]。通过灌胃盐酸林可霉素复制模型，造模时间短、模型稳定，其诱导的ADD 严重破坏了肠道机械屏障、免疫屏障、微生物屏障[27]。

然而，肠黏膜是否完好是评价肠道机械屏障受损的重要指标。本实验中，通过HE 染色结果可知在造模成功后肠黏膜组织严重受损，而经过补土雅解方治疗病理改变明显改善。同时DAO、MPO、LPS等肠黏膜受损的血浆标志物将因为屏障受损而大量释放进入血液[28]。DAO 是一种高活性的胺类细胞内酶，常存在于肠黏膜绒毛上皮细胞中。当黏膜屏障受损时，DAO被肠黏膜细胞间隙内血管和淋巴管所吸收，导致血液中其含量急剧上升[29]。MPO 作为炎症浸润的重要标志，黏膜完整性破坏后激发肠道内炎症造成其高表达，同时由于肠壁通透性增加使得大量MPO 进入血液[30]。LPS 是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖成分，其通过损伤的肠道屏障进入血液，不仅将诱导肠壁炎症，还可能造成内毒素血症[31]。同时，检测LPS 不仅可以反映肠道黏膜屏障破坏程度，还能提示厌氧菌对肠道细菌移位的抑制作用减弱。肠道机械屏障完整性的破坏将使得肠腔内的细菌越过肠黏膜屏障，进入肠系膜淋巴结、门静脉系统，继而进入体循环以及肝、脾、肺等远隔器官，这一过程称为菌群移位[32]。肠道细菌移位是肠道黏膜功能障碍的突出表现，检测肠道细菌移位可以反映肠黏膜的整体屏障功能。实验结果表明，模型组血液中的DAO、MPO、LPS含量明显上升，肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏的菌落数量均显著增多，提示ADD 造成肠道机械屏障严重受损。经过补土雅解方治疗后，其完整性明显改善黏膜组织病变。

肠道免疫屏障是以肠道内浆细胞sIgA 为主导的体液免疫，不仅能与病原体结合通过肠胃蠕动等方式排出，还可中和肠内毒素，双重阻碍肠道黏膜与病原体的直接接触[33]。sIgA 是维持肠黏膜表面内环境稳态的重要免疫防御因子[34]。作为防御致病菌在肠黏膜表面粘附定植的第一道防线，实验结果表明，补土雅解方治疗后可以升高sIgA 的含量，修复肠道黏膜损伤，保护肠道免疫屏障。

肠道微生物群由数百种细菌组成，是决定宿主健康状况的重要因素。滥用或不当使用抗生素可能会改变肠道微生物群的结构，破坏微生物平衡，从而导致宿主潜在的临床并发症[35]。健康的肠道菌群有助于保护肠黏膜、预防病原体和调节宿主免疫力[36]。相反，肠道菌群失调直接或间接损害人体的生理和免疫功能，导致腹泻等副作用[37]。Firmicutes是产生乳糖酶的主要门类，AAD 将使得乳糖酶活性显著降低[38-39]。而Bacteroidetes和Proteobacteria中包含的细菌是常见的肠道相关微生物，具有相对较高的引起腹泻疾病的风险，并且与炎性细胞因子呈负相关[40]。 Firmicutes/Bacteroidetes的比率通常用于评估患者的各种肠病，如肠易激综合征、炎症性肠病和代谢性疾病[41-42]。Lactobacillus被公认为益生菌，可产生乳酸改善肠道环境，防止有害细菌的粘附和分泌乳糖酶分解乳糖[43]。有研究证实在抗生素腹泻小鼠模型中Pseudomonas、Enterobacter乳糖酶基因表达显著增加，是引起ADD 的重要病原体[44]。实验结果表明，补土雅解方治疗后在门水平上主要通过升高Firmicutes 丰度和Firmicutes/Bacteroidetes 比 值，同 时 降 低 Bacteroidetes 和Proteobacteria 丰度来调节ADD 大鼠的肠道菌群结构。在属水平上，ADD大鼠Lactobacillus菌群比例明显降低，Sphingomonas、Pseudomonas、Enterobacter菌群比例显著升高，补土雅解方可有效纠正上述菌群比例失调现象。

综上所述，补土雅解方对肠道三大屏障具有显著保护作用，主要通过保护肠道黏膜屏障的完整性来调节肠道菌群失调，其具体机制与降低肠道黏膜通透性、减少肠道菌群移位、保护肠道免疫屏障、调节肠道菌群结构的多样性、改善肠道微生态紊乱有关。本实验以“雅解”理论为指导，进一步明确其科学内涵，丰富了傣医的基础理论，为民族药新药研究开发和临床运用提供科学依据。