甘草附子汤治疗类风湿性关节炎的网络药理学分析＊

张冬雪，曲 帅，董 凯，徐 晨，阚 鸿＊＊

（1.吉林农业大学中药材学院 长春 130118；2.吉林省生物研究所药用真菌研究室 长春 130012）

类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种受多种内源性和外源性因素影响的自身免疫性疾病，表现为关节发炎、剧痛、僵硬、疲劳、畸形和身体损伤[1]，常引起免疫功能紊乱或低下[2]，其特点是软骨和骨质的破坏[3]。根据世界卫生组织数据，我国RA发病率约为0.4%，患者数量随年龄增长呈上升趋势[4]。当合并其他疾病时，患者的死亡率较高[5]。目前RA治疗主要通过控制炎症反应和减轻关节疼痛，西医治疗通常选取甾体抗炎药、非甾体抗炎药、免疫抑制药等。然而，化学药物易引发不良反应，特别是严重毒性，如肝、肾、胃肠道和恶性感染等[6]。因此中药复方在类风湿关节炎治疗中的应用呈上升趋势，RA患者更倾向于选择其作为补充药物进行治疗[7]。

中医认为寒冷、潮湿、劳累等为RA的相关致病因素，将RA归属于“历节病”的范畴，属痹症。甘草附子汤出自《伤寒论》，由甘草、附子、白术、桂枝四味药材组成，为表里阳虚、风湿在表的配方。方中君药附子温经散寒、祛除筋骨之风湿；佐药桂枝散寒解表祛湿、发汗消肿，强化附子的解湿邪作用；白术健脾去湿，兼走表里，增强附子和桂枝的功效。使药炙甘草温和、补中缓急，配以祛风除湿、强筋健骨之药，使药力更佳。临床使用历史悠久。曹江山[8]在研究关节炎中发现，运用甘草附子汤治疗RA效果良好，尤其是对风寒痹阻型RA患者，可提高患者关节活动能力，降低实验室炎症指标。任慧[9]通过选用加味甘草附子汤对57例类风湿关节炎寒湿痹阻证的患者进行治疗，发现加味甘草附子汤可有效缓解RA患者的症状体征，减少关节疼痛、关节压痛、关节肿胀个数，从而减轻患者痛苦，且临床安全性良好。冯亚兵[10]应用甘草附子汤治疗RA，结果显示总有效率达76.2%，明显高于西药对照组，且能够显著降低类风湿因子水平。而辨证论治的加减药味变化导致中药复方组合方式多样，药味含有大量复合化合物过于繁杂，无法仅通过常规实验方法检测，整体物质基础及多重作用机制难以阐明[11-12]。

中药网络药理学利用网络大数据的分析可以广泛应用于探索药物和中药的活性成分，解释整体作用机制，分析药对和组方的配伍规律[13-14]，为中医药从经验医学系统转化为循证医学系统提供了一种新的研究范式[15]。因此本研究采用网络药理学方法首先采用TCMSP、BATMAN-TCM和ETCM数据库筛选了甘草附子汤的有效成分；随后分析总结了活性成分的靶点；再利用药物-疾病靶点、基因本体（GO）和生物途径（KEGG）功能富集；最后，通过动物实验对关键靶点加以验证。为探讨甘草附子汤治疗RA的物质基础及作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 甘草附子汤中化学成分检索

借助TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）以“甘草”、“附子”、“白术”、“桂枝”为关键词检索甘草附子汤的化学成分。在TCMSP数据库中依据药代动力学ADME原则，以口服生物利用度（OB ≥3 0%），类药性指数（DL ≥ 0.18）为条件对其活性成分进行筛选。BATMAN-TCM数据库（http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/）按照Score cutoff ≥ 20检索四味药成分及相关靶点，ETCM数据库（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中截取QED得分＞0.67，对活性成分及其靶点进行补充，保证预测全面性，并通过文献验证数据库检索化学成分的准确性。

1.1.2 活性成分靶点筛选和“药物-成分-靶点”网络构建

基于Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/），查找1.1.1中筛选出活性成分对应的靶点及其相应的基因名，删除重复靶点、无对应基因名的蛋白。用Cytoscape3.7.2软件可视化分析药物、成分、靶点之间的交互作用。

1.1.3 RA治疗靶点预测

以“Rheumatoid arthritis”为关键词搜索人类基因注释的一站式搜索平台Gene cards 数据库（https://www.genecards.org/)、OMIM 数据库（https://omim.org/）、Drugbank数据库（https://go.drugbank.com/），查找疾病相关基因，利用多个公认疾病数据库保证收集靶点的全面和准确。将甘草附子汤活性成分的靶点与RA的靶点进行映射分析，得到潜在作用靶点。

1.1.4 构建蛋白互作网络（Protein-protein interaction，PPI）

将1.1.3中得到的甘草附子汤治疗RA的靶点导入String数据库（https://www.string-db.org/），选择研究物种为人类，将获取蛋白互作关系的结果以TSV格式导出，再导入Cytoscape3.7.2中进行网络拓扑属性分析，筛选核心靶点。

1.1.5 关键靶点的GO和KEGG分析

本研究通过Meta scape数据库（https://metascape.org/），利用注释基因和分析基因生物学过程的主要生物信息学工具GO，以及从高通量实验技术产生的大规模分子数据集KEGG进行富集分析。运用微生信等平台对数据进行气泡图可视化处理。

1.2 动物实验

1.2.1 实验材料与仪器

炙甘草、桂枝、白术、附子购于药店；大鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫试剂盒（TNF-α）、白细胞介素-6酶联免疫试剂盒（IL-6）购于南京建成生物工程研究所；大鼠AKT-1蛋白酶联免疫试剂盒（Akt-1）购于上海江莱生物科技有限公司。

Wistar大鼠，雄性30只，体质量（180±20）g，购于长春生物制品研究所有限责任公司（SCXK（吉）-2017-0005），实验前适应环境饲养7天。

冷冻离心机（Eppendorf，美国）；酶标仪（Tecan，澳大利亚）；足趾容积测量仪（PV-200，成都泰盟软件有限公司）。

1.2.2 甘草附子汤供试品的制备

以处方比例称取炙甘草、附子、白术、桂枝四种药材，参照文献方法[16]制备甘草附子汤供试品溶液，冷冻干燥后低温储存备用。

1.2.3 甘草附子汤对大鼠佐剂型关节炎的影响

（1）踝关节组织学检查

取大鼠的右后足踝关节，固定于福尔马林溶液中，脱钙处理后，按照文献方法[17]进行HE染色，分别从炎症细胞浸润、滑膜增生、软骨破坏和骨侵蚀程度对各组佐剂性关节炎大鼠的关节切片进行评分，评价标准为：无症状得0分，轻度症状得1分，中度症状得2分，重度症状得3分，总得分为12分[18]。

（2）甘草附子汤对AIA大鼠作用靶点的验证

将30只大鼠随机分为空白组（HG）、模型组（AIAG）、给药组（GFDG），模型组和给药组在大鼠左后足足趾处皮内注射0.1 mL含10 mg·mL-1灭活的结合分枝杆菌的完全弗氏佐剂，空白组在相同部位注射等量的生理盐水，共注射2周，建立佐剂型关节炎模型。模型建立后，给药组连续灌胃给药甘草附子汤（给药剂量按照临床计量折算，6.5 g生药·kg体质量-1），空白组和模型组给予等量的生理盐水。连续给药3周后，处死取血，4℃下离心3000 r·min-110 min获得血清，保存于-80℃待用。将大鼠的踝关节组织去掉皮肉，用匀浆器与生理盐水以1∶10的比例在冰浴中研磨，再将组织研磨液以3000 r·min-1低温离心，得到上清液作为关节组织匀浆液，保存于-80℃待用。

分别按照试剂盒的方法检测大鼠血清中的TNF-α、IL-6及踝关节组织中的 TNF-α、IL-6、Akt-1的表达。

1.2.4 统计学分析

统计分析采用SPSS 23软件进行分析，所有数据均采用均值±标准差（），组间比较用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草附子汤中活性化合物的筛选

从TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM数据库检索可得到甘草附子汤中活性物质共623种。活性成分筛选以OB＞30%，DL＞0.18或Score cutoff ≥20或QED得分＞0.67为标准，共筛选出136种，其中甘草101种，白术7种，附子21种，桂枝7种。甘草附子汤中部分有效成分的相关信息如表1所示。

2.2 “药物-化合物-靶点”网络构建与分析

采用Cytoscape3.7.2软件对甘草附子汤中各药味的成分、靶点进行网络拓扑学分析，得到的“药物-化合物-靶点”网络图，如图1所示。

2.3 甘草附子汤-RA交集靶点

将筛选后的甘草附子汤有效活性成分靶点与RA的潜在靶点取交集，运用Venny绘图，得到交集靶点127个，见图2。

表1 甘草附子汤中部分有效成分的基本信息

图1 草附子汤治疗RA“药物-化合物-靶点”网络图

图2 甘草附子汤成分靶点与RA相关靶点关系的Venn图

2.4 PPI网络构建与分析

将甘草附子汤治疗RA的127个潜在靶点基因输入到STRING平台中，进行PPI分析，通过Cytoscape对数据进行网络拓扑分析，网络中共包含127个节点，2607条边，平均度值44.1。颜色的深浅随度值增加而增加，度值越大与其他蛋白联系越密切，作为潜在治疗靶标的可能性越大（见图3），主要蛋白资料见表2。

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析

通过Metascape数据库，对甘草附子汤治疗RA的作用靶点进行富集分析，以P＜0.01为条件。GO分析结果显示：检索出748项与分子功能（Molecular，MF）相关，可体现在热休克蛋白结合、抗氧化活性等功能上；参与生物过程（Biological process，BP）的4849项，包括对生长因子、创伤的反应、RNA聚合酶Ⅱpri-miRNA转录的调控等主要过程；得到440个细胞组分（Cellular components，CC）条目，主要以神经元、髓鞘、滑面内质网为主。对MF、BP、CC中P值排名前5的条目进行可视化分析（图4）。KEGG分析得到247项，涉及癌症的途径、脂质与动脉粥样硬化、NF-κB信号通路等。将KEGG分析得到的前20条通路进行可视化处理，结果如图5所示。部分蛋白靶点与信号通路之间的联系如表3所示，进一步建立“靶点-通路”网络（图6）。

图3 甘草附子汤治疗RA的关键节点筛选图

表2 甘草附子汤治疗RA中的重要靶点

2.6 甘草附子汤对RA损伤模型的保护作用

2.6.1 各组大鼠右后足关节的组织病理学分析

如图7所示，HG大鼠右后关节切片无炎症特征（图7A），而AIA模型组大鼠出现严重的骨破坏、软骨侵蚀、滑膜增生和炎症浸润（图7B）。与AIA模型组相比，甘草附子汤组切片中组织水肿或滑膜肥大得到明显缓解，炎症细胞浸润情况也有所减轻（图7C）。AIA模型组和甘草附子汤组的病理学得分图如图7D所示，甘草附子汤组对AIA大鼠表现出明显的治疗作用。

2.6.2 甘草附子汤对AIA大鼠的影响

图8显示了各组大鼠足肿胀率，空白组大鼠的足肿胀率由于大鼠饲养5周体质量增加而略有增加，模型组的足肿胀率较高，达到了44.93±2.09%，给药组在甘草附子汤治疗3周后，与AIA模型组大鼠相比，大鼠足肿胀率显著降低（P＜0.01）。结果表明，甘草附子汤可使大鼠足肿胀得到缓解。模型组大鼠的血清中TNF-α和IL-6水平显著升高，表明了炎症的发生。经甘草附子汤治疗3周后，给药组血清中TNF-α和IL-6的浓度较炎症组明显降低（图9）。通过网络药理学预测可知，Akt-1、TNF-α和IL-6在甘草附子汤治疗RA中起到了重要的作用，因此，对大鼠关节组织中选取Akt-1、TNFα和IL-6进行分析验证。如图10所示，经甘草附子汤治疗后，AIA大鼠关节中的Akt-1、TNF-α和IL-6表达均有所降低，表明甘草附子汤可通过以上3个靶点，在TNF信号通路、脂质和动脉粥样硬化、HIF-1等信号通路中起到治疗类风湿性关节炎的作用[6,19]。

图4 甘草附子汤治疗RA的GO富集条目气泡图

图5 甘草附子汤治疗RA的KEGG通路富集气泡图

表3 甘草附子汤治疗RA部分蛋白靶点与信号通路信息

图6 甘草附子汤治疗RA靶点-通路网络图

图7 各组大鼠关节组织学检查（放大100倍）（）

图8 给药3周后大鼠足肿胀率（）

3 讨论

RA是一种慢性疾病，早期常见症状是晨起之后关节僵硬，足关节等四肢小关节的对称性疼痛、红肿热痛，并伴随有低热、免疫功能下降等，严重可致关节畸形[20]。该疾病因其高致残率严重威胁人类健康，但其发病机制尚未完全阐明。中药复方具有多成分、多靶点的特点，构成了一个可以协同发挥作用的整体，具有疗效明确、安全性高、副作用少的优点，对于这种需长期服药的疾病治疗效果较好[21-22]。甘草附子汤是其中最有效的方剂之一[23]，在RA的防治中引起了越来越多的关注。

本研究运用网络药理学方法共检索出甘草附子汤中623个化合物，结合当前对甘草附子汤化学成分进行探索的文章[24]，采用TCMSP、BATMAN-TCM和ETCM等数据库尽可能全面的囊括甘草附子汤中的化学成分，弥补目前检测方法对中药复方复杂体系分析的局限性。根据目前实验报道[16]，甘草附子汤在合煎与分煎过程中，并未产生化学成分种类的变化，数据库信息具有代表性，本论文采用ADME原则作为筛选条件，对“甘草附子汤”进行网络药理学的分析。通过筛选可得甘草附子汤有效成分共136个，其中以甘草和附子成分为主，白术和桂枝较少，与文献中报道成分分布一致[25-26]，将136个有效成分的靶点进一步通过与RA疾病的221个作用靶点进行比对，进一步得到甘草附子汤治疗RA的潜在作用靶点127个。活性成分-靶点网络分析预测显示，甘草附子汤可通过槲皮素（Quercetin）、β 谷 甾 醇（Beta-sitosterol）、紫 杉 醇（Taxifolin）、甘草素（Glycyrrhizin）和乌头碱（Aconitine）等活性成分发挥作用。黄酮类化合物槲皮素可通过两种途径减轻炎症：①可使IL-6、IL-1β、IL-10等炎症因子的表达水平降低；②通过减少炎症细胞向关节部位的募集来缓解局部的炎症[27]。β-谷甾醇可通过抑制表皮细胞中炎症小体的激活，减少细胞中TNF-α、IL-8的生成发挥抗炎作用；还可以调节巨噬细胞的功能，减轻小鼠的类风湿炎症[28-29]。紫杉醇通过靶向MAPK和AKT/mTOR信号通路抑制RA的滑膜细胞的迁移和炎症介质（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8）的产生[30]。甘草素能降低促炎细胞因子TNF-α表达水平，抑制小鼠骨关节炎软骨破坏[31-32]。现代药理学研究表明，制附子主要活性成分乌头碱可能通过降低血清NO、IL-1β水平、从而调控相关细胞因子的表达从而起到抗炎和消除关节肿胀的作用[33]。

图9 给药35天后大鼠血清中TNF-α（A）和IL-6（B）的水平（）

图10 给药35天后大鼠关节组织中TNF-α（A）、IL-6（B）和Akt-1（C）的表达水平（）

经网络拓扑分析发现甘草附子汤治疗RA发挥作用的主要靶点集中在炎症和肿瘤相关的基因，由于炎症与肿瘤存在错综复杂的关系[34]，因此交叉的通路中可能存在假阳性的可能。根据目前文献报道进一步筛选，认为甘草附子汤治疗RA的关键靶点为Akt1、TNF-α、IL-6、VEGFA、JUN、IL-1β、PTGS2、STAT3。Akt1是PI3K/AKT信号通路中重要的下游靶激酶，可通过多种途径控制凋亡[35-36]。Akt1表达水平下调，造成促炎因子IL-1β、TNF-α的表达减少，抗炎因子IL-10表达增加，从而减少炎症反应[37]。TNF-α在诱导类风湿性滑膜细胞中起主导作用，在RA患者的关节液和滑膜中表达，一方面可以介导白细胞在关节处聚集，刺激破骨细胞的形成和软骨的降解，有效地诱导其他促炎介质的释放[38]，另一方面直接通过刺激关节软骨细胞中胶原酶的合成，促进滑膜炎症[39]。目前抗风湿类药物中，单克隆抗体英夫利昔单抗和阿达木单抗为阻断TNF-α的免疫药物，但此类药物存在免疫抑制副作用，同时易于使患者出现针对药物的抗体而影响药物的活性[40]。在先天免疫方面，多效促炎细胞因子IL-6促进中性粒细胞迁移和单核细胞浸润是RA发病的重要机制[41]。在RA患者受累关节的血清和滑液中，发现IL-6和TNF-α的水平升高[42]。研究发现IL-6、TNF-α、Akt的主要功能是刺激B细胞增殖以产生免疫球蛋白，并刺激滑膜以产生类风湿因子。因此，降低其表达水平可有效治疗RA[43]。血管内皮生长因子A（VEGFA）可促进血管生成，在类风湿关节的缺氧状态和抗炎细胞因子中表达水平上调[44]。JUN是JAKSTAT信号通路上的快速反应基因，可促进成骨细胞增殖、分化和骨细胞特异基因的表达[45]。关节中IL-1β的增加会加剧滑膜炎症细胞浸润，促进血管痉挛的形成，最终导致软骨和骨骼的破坏[19,46]。前列腺素内环氧化合物合成酶2（PTGS2）是前列腺素合成的限速酶，可通过NF-κB通路激活并诱导软骨细胞产生IL-6，造成软骨损伤，抑制PTGS2的表达可减轻炎症[47]。STATs是一类信号转导与转录激活因子，STAT家族中STAT3活性最强，可调节炎症因子表达，对RA发挥正反馈促进作用[48]。Oike等[49]通过构建可行的STAT3条件性敲除成年小鼠（Stat3 cKO），解决了Stat3 global KO小鼠显示的早期胚胎致死性，并发现这种敲除小鼠能够显著抵抗胶原蛋白诱导的关节炎，与降低血清中IL-6和IL-17水平在体内拮抗关节炎症有关。在KEGG通路富集分析中治疗靶标主要富集在HIF-1、NF-κB、JAK-STAT等多条信号通路中。PI3K/Akt磷酸化[50]、NF-κB通路活化[51]可激活IL-1β诱导促炎因子TNF-α、IL-6的表达，介导大鼠关节炎症的发生。研究发现下调JAK1/STAT3信号可使促炎细胞因子减少、MMPs抑制、炎性标记物减弱和炎性细胞凋亡，从而减轻RA临床症状[52]。HIF-1在炎症/先天免疫反应中发挥作用[53]，HIF-1通路激活引起NF-κB、促炎性细胞因子表达下调，起到炎症保护作用[54]。因此甘草附子汤治疗RA的机制与上述炎症相关通路相关，与临床或实验研究相吻合[55]。本实验根据以上分析结果，将度值＞90的关键靶点以佐剂型关节炎大鼠为模型进行验证，结果表明甘草附子汤通过下调大鼠体内各通路中的Akt-1、TNF-α、IL-6表达发挥对RA的治疗作用。

综上所述，本文参考《网络药理学评价方法指南》，运用网络药理学研究药物与靶蛋白或基因与疾病之间的代谢途径，从信息学的角度描述生物系统、药物和疾病之间的复杂性[56]，适用于类风湿性疾病等发病机制尚不清晰的疾病，与多成分多靶点交互作用的中药复方。通过动物实验对甘草附子汤治疗RA的作用效果和潜在的信号通路进行验证，为甘草附子汤的广泛应用提供了理论支撑。但一方面由于有效成分为预测值，缺乏药代动力学的相关体内参数，另一方面，中药复方存在多组分、多途径、多靶点的特点，预测的关键靶点并不能完全代表中药的整体观，需要进一步完善甘草附子汤在体内药效成分的探究，运用强大的信息化技术科学、系统地阐释传统中医药。