热敏灸对IBS模型大鼠血清及结肠组织中SP、CGRP表达的影响＊

章海凤，李小清，李琳慧，周志刚，周 旭，龚 安，颜纯钏，龚红斌，曾 婷，付 勇＊＊

（1.江西中医药大学附属医院 南昌 330006；2.江西中医药大学针灸推拿学院 南昌 330004）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome ，IBS）是一种较为常见的功能性胃肠疾病，临床上患者主要表现为腹部疼痛及排便习惯的改变[1]。目前西医治疗多采用解痉类药物、导泻剂、止泻剂、益生菌类药物、抗抑郁类药物等以针对患者不同症状进行治疗，然而因药物治疗不能全部根治、易出现便秘、头痛、恶心、神经过敏等药物毒副作用以及患者可能呈现依赖性等原因导致患者的服药依从性、自主性欠佳，整体治疗效果未达理想效果，故严重影响此类患者的正常生活、工作及生存质量。此外，因其发病机制复杂、病情反复难以治愈，对于患者的就医成本及社会的医疗成本均造成一定压力。故完善此疾病的生理病理基础、疾病产生机制，找寻有效的治疗手段对于IBS患者及现代医学来说有重要意义。

现如今虽有众多学者聚焦于IBS的相关研究，但仍对其发病机制未有清晰、完整的阐述。其中研究表明IBS与内脏高敏感性、胃肠动力紊乱有紧密联系[2]。近年来随着现代医学研究的深入，众多研究结果表明IBS患者大脑（中枢神经）与胃肠道（肠神经系统）两者之间存在异常互动。在脑-肠相互作用过程中，脑肠肽的表达异常起着重要作用，其表达水平可直接影响内脏超敏反应的程度。SP、CGRP均属于脑肠肽，两者可共同存在、相互作用以参与伤害性疼痛信息的传送，从而IBS患者出现腹痛、腹泻等症状[3]。

热敏灸作为中医疗法中的一种安全、有效的治疗手段，对于IBS的治疗颇有优势。事实上，近年来有多项临床研究表明热敏灸可有效治疗IBS且相较传统艾灸效果更甚[4-6]。但目前针对热敏灸有效治疗IBS的机制研究尚未全面，且未发现从SP、CGRP因子方向探索热敏灸发挥治疗IBS作用的研究。基于此，本次实验通过本研究通建立IBS大鼠模型，观察热敏灸干预后大鼠血清及组织中SP、CGRP的蛋白表达水平变化，研究其可能机制，以期为其临床使用提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组情况

30只SD大鼠（雄性，6-8周，190±10 g），SPF级，购自湖南斯莱克景达生物有限公司，按组别分笼饲养，动物房饲养环境满足自由进食、自由进水、温度20℃-25℃、湿度50%-70%、环境安静、昼夜交替（光照周期12 h/12 h）。许可证号：SCXK（湘）2011-0003。本次实验全程于江西中医药大学实验动物中心进行，已通过江西中医药大学实验动物伦理委员会审批（审批号：JZLLSC20220491）。

1.2 实验药物与试剂

热敏灸艾条（江西中医药大学附属医院，6 mm×120 mm，二级精艾绒）；SP（Substance P）ELISA Kit（Elabscience、E-EL-0067c、96T）；Rat CGRP1（Calcitonin Gene Related Peptide 1）ELISA Ki（tElabscience、E-ELR0135c、96T）；包埋石蜡（69019361，国药集团），无水乙醇（10009218，国药集团），二甲苯（10023418，国药集团），兔多抗 SP（DF7522，affinity）；兔多抗 CGRP（DF7386，affinity），中性树胶（10004160，国药集团）。

1.3 实验仪器

红外电子体温计（华盛昌（CEM））；高速低温离心机（上海安亭科学仪器厂TGL-16-aR）；切片机（RM2145、德国 Leica公司）、摊片机（HI1210、德国Leica公司）、烤片机（HI1220、德国Leica公司）；GNP-9080隔水式恒温孵育箱（上海精宏实验设备有限公司）；CX31生物显微镜（日本Olympus公司）；酶标仪（Thermo）。自制束缚瓶，自制艾灸器等。

1.4 造模方法

采用番泻叶煎汁灌胃结合慢性不可预见性刺激建立IBS-D模型[7]，造模周期共21天。制备番泻叶药液及灌胃方法如下：按照所需造模的大鼠体质量计算对应番泻叶药液量、番泻叶生药量，纱布包裹番泻叶并将其置于4倍药量体积的沸水中浸泡0.5 h，过滤残余药渣后煎煮药液至生药浓度为0.45 g·mL-1叶药液，4℃冰箱保存。大鼠灌胃量根据其体质量按10 mL·kg-1标准进行，1次/日。慢性不可预见性刺激共5中刺激因子，含24 h禁水、24 h禁食、昼夜颠倒、4℃冰水游泳3 min、束缚制动2 h，造模期间每日随机安排1种刺激因子，每种至少出现3次，注意同种刺激因子不能连续出现，以免动物预料刺激发生。

1.5 干预方法

空白组不予任何刺激，正常条件下饲养；造模组大鼠随机分为模型组（6只）及艾灸组（18只）。模型组于造模成功后不予任何刺激，艾灸组采用热敏灸艾条艾灸“命门”穴，每天每次40 min，共14天。期间观察大鼠尾温变化，其中尾温波动＞1℃为热敏灸组，尾温波动≤1℃为非热敏灸组，尾温于1℃反复波动的大鼠不纳入此次实验观察。最后热敏灸组、非热敏灸组各纳入6只符合要求大鼠

1.6 样本采集

实验期间，观察大鼠一般状况如精神状态、体质量、粪便等。实验结束后禁食24 h，选用浓度为1%戊巴比妥钠、通过腹腔注射的方式麻醉大鼠（当天称取大鼠体质量并记录，按45 mg·kg-1比例行腹腔注射），待大鼠进入深度麻醉状态后后行腹主动脉取血法采集大鼠血液，每只3 mL左右。低温离心后标记好组别置于-80℃冰箱中保存，同时快速剪取大鼠结肠组织固定于4%多聚甲醛溶液内保存。

1.7 检测方法

1.7.1 一般情况及造模情况

实验期间内注意观察各组大鼠一般状况，如精神状况、毛发、粪便、自由活动情况等，观察造模情况。

1.7.2 ELISA检测大鼠血清中SP、CGRP表达

取1份血清标本，于冰上融化后低温离心取其上清液。室温下打开ELISA试剂盒，严格按照说明书上步骤进行操作。

1.7.3 免疫组化法检测大鼠结肠组织中SP、CGRP表达

将结肠组织进行脱水、包埋后切片，切片常规脱蜡、修复抗原后封闭30 min，PBS清洗3次后滴加相应抗体，最后进行染色处理；显微镜下观察各组大鼠结肠组织不同染色反应，其中正常组织呈现蓝紫色，阳性反应呈现为不同程度的棕黄色或棕褐色。镜下不同倍数随机采集3个视野，测定其光密度（OD）值。光密度积分（IOD）=阳性面积×OD/总面积，IOD平均值即为其阳性表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS 22.0统计所得数据；计量资料以均数±标准差（）表示。统计在满足正态检验的前提下，采用单因素方差分析比较多组数据，采用LSD-t检验比较两两组间数据，以P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及造模情况

在正常条件下饲养期间，所有大鼠精神活跃，精力旺盛，毛发光泽不易掉，粪便软硬适中，多呈椭圆形；造模期间大鼠精神活跃度降低，自主活动明显减少，毛发枯槁易抓落，粪便时干时稀；经干预后，相比模型组，艾灸组情况有所改善，其中热敏灸组大鼠情况好转更为明显。

模型组大鼠除了精神、自主活动、粪便性质的改变外，病理形态学结果提示，相比空白组，该组的组织结构出现一定程度的紊乱，呈现轻度的炎性细胞浸润状态，但无水肿、增生等情况，符合IBS病理形态学变化（见图1）。

图1 结肠黏膜造模前后组织形态

2.2 大鼠血清中SP、CGRP表达

与空白组相比，模型组及其他治疗组中SP、CGRP的表达水平明显增高（P＜0.01）；经干预后，与模型组相比，热敏灸组、非热敏灸组中SP、CGRP蛋白表达降低，其中热敏灸组降低最为明显（P＜0.01）（见表1，图2）。

2.3 大鼠结肠组织中SP、CGRP表达

与空白组相比，其他各组中SP、CGRP的表达水平明显增高（P＜0.01）；经干预后，与模型组相比，热敏灸组、非热敏灸组中SP、CGRP蛋白表达降低，其中热敏灸组降低幅度最明显（P＜0.01）（见表2，图3，图4）。

3 讨论

IBS在传统中医学中可归属于“泄泻”、“腹痛”等范畴，临床症状主要以腹痛、腹泻、腹胀等腹部不适为主，或伴有排便习惯的改变。现西医治疗多使用镇静、解痉、止泻等药物治疗改善患者症状，然此种单一药物治疗效果一般，未达患者理想疗效。因此寻找有效、便捷、安全的治疗IBS的方式是临床医学亟需解决的问题及难点。中医在此类疾病治疗上具有颇多经验，疗法多元，疗效显著。针灸作为中医外治法中的一种特色治疗手段，在IBS的治疗中有着特别优势。有研究证明针灸的治疗效果优于西药，且症状改善程度更高、复发率更低[8]。热敏灸作为一种有效、安全的新型艾灸疗法，可通过艾灸敏化腧穴、最大程度激发人体经气感传以达到气至而有效。有临床研究表明，相比于传统艾灸，热敏灸治疗效果更佳[4,9]。此外，可在IBS患者体表发现热敏高发穴区，命门穴即为其中一个，在该穴位进行热敏灸疗法操作，可极大程度提高疗效[10]。本课题组前期亦有相关实验研究表明命门穴可有效用于IBS大鼠的治疗[11]，如通过复制IBS模型大鼠，艾灸组（热敏灸组、非热敏灸组）于大鼠“命门穴”处行热敏灸疗法，RU-486组予以米非司酮灌胃，采用PCR方法观察下丘脑组织CRF及肾上腺组织GR的mRNA水平、Western blot检测下丘脑组织CRH的蛋白表达情况，结果发现相比模型组，艾灸组（热敏灸、非热敏灸组）IBS大鼠下丘脑组织CRF、CRH的mRNA水平及蛋白表达均降低、RU-486组表达水平升高；肾上腺组织GR的mRNA水平升高，RU-486组表达减少；且两种组织中热敏灸组变化最为明显；该结果说明热敏灸“命门穴”可通过调节CRH、CRH及GR的表达以控制HPA轴，从而有效改善IBS症状。付勇等[12]建立IBS大鼠模型，干预组包括热敏灸组及非热敏灸组，对照组包括假手术组及NMDA组，实验过程中观察大鼠的行为学，实验结束后测定大鼠内脏敏感性、ELISA法检测血清CORT表达、PCR法检测海马组织中GR表达水平；结果表明热敏灸干预可下调CORT、上调GR的表达，改善IBS大鼠内脏高敏感性。

表1 ELISA法检测大鼠血清中SP、CGRP表达（n=6）

图2 大鼠血清SP、CGRP表达柱状图

图3 大鼠结肠组织中SP、CGRP表达

图4 大鼠结肠组织中SP、CGRP表达柱状图

表2 免疫组化法检测大鼠结肠组织中SP、CGRP表达

目前，对于IBS的发病机制研究尚未明确，现代医学研究结果表明该疾病发生与胃肠动力及内脏敏感性等因素密切相关[13]。P物质（Substance P，SP）存在于十二指肠和结肠，可刺激消化道平滑肌收缩，舒张肠黏膜血管，调节胃肠动力和肠道中水、电解质的分泌等[14]。此外，SP可传递感觉信息，参与内脏痛觉感受[15]。因此当患者肠道中的SP分泌异常增加时，消化道平滑肌产生强烈收缩，胃肠道增强运动，从而产生腹痛、腹泻等症状。李榕娇等[16]根据患者的疾病分型将80例IBS患者分为腹泻组（40例）、便秘组（40例），另选择对照组（40例结肠或胃息肉切除术后患者），观察各组肠道菌群数量、检测各组SP、NPY等血清指标，结果发现IBS组内的SP、NPY含量均升高，提示SP的异常升高与IBS的关联性。此外杨梅等[17]的研究表明，温胃调肠颗粒可通过降低SP等相关的表达水平从而调控脑肠轴的平衡，改善IBS腹痛、腹泻等症状。

降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）分布于中枢、外周神经系统及消化道中，具有介导痛觉的产生及传递、调节胃肠道的分泌及运动等功能[18-19]。CGRP可改变内脏感觉信号传导，将疼痛等感觉传入中枢，导致患者胃肠动力异常及腹部疼痛等症状发生[19-20]。邓多喜等[21]以合募配穴为原则对IBS大鼠行针刺治疗，药物组灌胃匹维溴胺溶液，发现针刺组可显著下调IBS结肠组织中SP、CGRP等因子的表达以降低肠道高敏感性，减轻腹痛等症状；杨敏等[22]发现针灸联合药物治疗可降低5-HT、CGRP等蛋白含量从而调节大鼠脑肠肽含量，减轻IBS相关临床症状。

SP和CGRP两者之间相互作用，可直接产生伤害性作用，抑制SP的降解，激发大量炎症介质释放以发生炎症反应、参与内脏超敏反应[23-24]。

综上所述，IBS患者出现腹痛、腹泻的症状，可能与其胃肠动力异常及内脏高敏感性有紧密联系，而SP、CGRP作为参与此类反应中的神经递质，在该过程中有着重要调节作用。因此，想要有效治疗IBS，可通过调控SP、CGRP以改善胃肠动力、降低内脏高敏感性以达到治疗目的。基于此，本次实验通过建立IBS大鼠模型，从大鼠的精神状况、自主活动、毛发、粪便等方面观察各组大鼠的一般情况，过程中模型组大鼠精神活跃度降低，自主活动明显减少，毛发枯槁易抓落，粪便时干时稀，而经热敏灸干预后IBS大鼠一般情况有所好转，且相比非热敏灸组，热敏灸组大鼠情况好转更为明显。除此之外，本次实验采集大鼠血清、结肠组织，分别通过ELISA、免疫组化法检测其血清、结肠组织中SP、CGRP的表达变化。实验结果表明，与模型组相比，热敏灸组及非热敏灸组血清、结肠组织中SP、CGRP的表达均降低；与非热敏灸组相比，热敏灸组降低幅度更为明显。该结果再次证明相比传统艾灸，热敏灸治疗IBS效果更佳，且可能是通过调控SP、CGRP的表达以发挥治疗作用。