黄芩对复发性流产孕鼠的安胎作用＊

冯藜枥，姜仁建，周 杰，王 根，袁 涛

（1.重庆市长寿区人民医院 重庆 401220；2.重庆市中医院 重庆 400000）

复发性流产（RSA）是指处在育龄期的女性，在未改变性伴侣的情况下，与之结合受孕后，接连出现两次以上的自然流产，并且多数发生在妊娠不超过20周时[1]。其病因至今不完全明确，主要涉及免疫、内分泌、遗传性疾病、子宫的先天发育异常、感染、凝血功能异常等，其中最主要的因素是免疫异常[2]。母-胎界面异常炎症反应，及其导致的免疫平衡被打破是引发胎儿丢失的重要原因。研究表明，巨噬细胞作为哺乳动物子宫内的主要免疫活性细胞，在调节子宫免疫微环境、介导炎性反应中发挥着重要作用[3]。巨噬细胞在不同的微环境影响下，可极化成M1型和M2型[4]。发生在任何时间、任何阶段的巨噬细胞M1/M2型极化异常，均会导致自然流产的发生[5]。

近年来，逐年增多发生的RSA，已对生育期女性的心身健康造成了严重的消极影响。然而目前西医对于治疗RSA的疗效有限。因此，探索效果优良的保胎中药及治疗方法具有十分重大的价值。黄芩作为传统的保胎药物，具有清热凉血、安胎的作用，是历代中医治疗血热型的胎动不安、滑胎的常用中药。但目前对于黄芩保胎的基础研究，报道尚少。本研究，通过观察在黄芩干预下，RSA孕鼠模型胎盘组织病理结构的变化，以及孕鼠胎盘组织中M1型巨噬细胞因子（iNOS、IL-6、TNF-α）和M2型巨噬细胞因子（Arg-1、IL-10）表达的变化；探讨黄芩是否通过调节巨噬细胞M1/M2型极化，参与塑造了胎盘局部母-胎界面的免疫耐受机制，从而起到安胎作用，为其临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物及药品制备

由北京华阜康生物科技股份有限公司提供的SPF级小鼠，包括5只BALB/C雄鼠，10只DBA/2雄鼠，30只CBA/J雌鼠，大约8周大小，平均体质量在（20 ±2）g，许可证号SCXK（京）2019-0008；本实验符合本单位的伦理学标准。黄芩从重庆市中医院中药房（重庆康美药业股份有限公司生产，批号：210201）购得，经重庆市中医院药剂科冷静教授鉴定，为唇形科植物黄芩（S.baicalensis）的干燥根。取适量的药材黄芩，蒸馏水浸泡，回流，提取2次，过滤，浓缩定容至浓度为1 kg·L-1黄芩水提液，置-20℃冰箱保存备用。生理盐水由重庆市中医院购得。

1.2 主要试剂与仪器

苏木素染液（批号：ZH202509，武汉塞维尔生物科技有限公司）；伊红染液（批号：CR2011064，武汉塞维尔生物科技有限公司）；iNOS兔多克隆抗体（浓度：1∶50，货号：A14031，ABclonal）；IL-6兔多克隆抗体（浓度：1∶100，货号：bs-0782R，北京博奥森有限公司）；TNF-α兔多克隆抗体（浓度：1∶50，货号：A0277，ABclonal）；Arg-1兔单克隆抗体（浓度：1∶50，货号：A4923，ABclonal）；IL-10兔多克隆抗体（浓度：1∶50，货号：A17501，ABclonal）；透射电子显微镜（型号JEM-1400FLASH，日本电子（JEOL））；荧光扫描显微镜（P250 FLASH，丹吉尔公司）等。

2 方法

2.1 实验动物及处理

实验分组：空白组、RSA模型组、黄芩治疗组。以国际公认的经典方法造模[6-7]，将发情的CBA/J雌鼠与BALB/C雄鼠按雌雄2∶1的比例合笼，使之自由交配，制造正常妊娠孕鼠模型（CBA/J×BALB/C），选取造模成功的正常妊娠孕鼠模型作为空白组；将发情的CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠按雌雄2∶1的比例合笼交配，制造复发性流产孕鼠模型（CBA/J×DBA/2），将造模成功的复发性流产孕鼠模型随机均分为RSA模型组和黄芩治疗组。合笼的第2天早晨检查阴栓，发现明显阴栓者为阳性，以检出阴栓记为孕第0天。空白组和RSA模型组均自孕1天开始连续给予生理盐水（2 mL·kg-1·d-1）灌胃；黄芩治疗组自孕1天开始连续给予黄芩水提液（10 g·kg-1·d-1）灌胃，实验药物剂量参考常用最佳量[8]。连续灌胃2周后脱椎取材。

2.2 统计胚胎丢失率

怀孕2周后，脱椎，解剖子宫，取出胚胎，记录胚胎吸收数、胚胎存活数，计算胚胎丢失率，胚胎丢失率=吸收胚胎数/（吸收胚胎数+存活胚胎数）。

2.3 HE染色检测小鼠胎盘组织

处死孕鼠后，取胎盘组织，予以固定，脱水，包埋，切片，脱蜡至水，苏木素染色，10-20 min后冲洗；1%盐酸酒精分化，5-10 s后冲洗；氨水返蓝，5-10 s、0.5%伊红溶液染色，3-5 min后冲洗；脱水，透明，封片，光镜下观察。

2.4 透射电镜观察小鼠胎盘组织

取胎盘组织，双重固定；脱水；渗透（比例分别为3∶1、1∶1、1∶3，每步 30-60 min）；纯树脂包埋，聚合，切片，染色，干燥；透射电镜下观察，图像采集。

2.5 免疫荧光法检测小鼠胎盘组织内iNOS、IL-6、TNF-α、Arg-1、IL-10表达情况

取各组孕鼠胎盘组织，石蜡切片，乙醇脱蜡至水，浸泡，加热沸腾，断电，间隔5 min）后，反复1次，冷却；PBS洗3次，每次5 min）；封闭，室温30 min）；加一抗，4℃过夜；PBS洗 3次，每次 5 min）；加二抗，37℃30 min）；滴加DAPI，室温孵育10 min）；PBS洗3次，每次5 min）；封片。摄取图片，Image J图像分析。

3 统计学分析

实验数据应用SPSS21.0 统计分析软件对采集的数据进行单因素方差分析，统计结果用均数 ± 标准差（）表示，P＜ 0.05认为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 各组胚胎丢失率比较

与空白组相比，RSA模型组胚胎丢失率明显上升，差异具统计学意义（P＜ 0.05）；与RSA模型组相比，黄芩治疗组胚胎丢失率明显降低，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）（表1）。

4.2 各组孕鼠胎盘局部的病理形态改变

HE染色，空白组胎盘组织的蜕膜带、巨细胞滋养层、海绵滋养层结构正常；与空白组对比，RSA模型组胎盘组织可见蜕膜带局部脱落，巨细胞滋养层坏死，数量减少，海绵滋养层局灶性坏死，且出现了大量炎性细胞浸润；与RSA模型组相比，黄芩治疗组胎盘组织各层次结构较清晰，仅见海绵滋养层点状坏死，伴有少量炎性细胞浸润，其他结构未发现明显病理改变（表2、图1）。

表1 各组胚胎丢失率比较（n = 5）

表2 小鼠胎盘组织HE染色结果

图1 小鼠胎盘病理形态学变化（HE，×400）

图2 透射电镜下各组小鼠胎盘组织超微结构的变化（×8000-15000）

4.3 各组孕鼠胎盘组织TEM检查结果

TEM下观察各组孕鼠胎盘组织超微结构，空白组胎盘组织的合体滋养层和细胞滋养层形态结构正常；与空白组相比，RSA模型组胎盘形态结构明显异常，合体滋养层细胞疑似发生坏死，细胞核显著皱缩，染色质聚集，电子密度增大，胞浆内线粒体出现肿胀，粗面内质网高度扩张；细胞滋养层细胞疑似坏死；与RSA模型组相比，黄芩治疗组胎盘合体滋养层和细胞滋养层未发现明显异常（图2）。

表3 小鼠胎盘组织iNOS、IL-6、TNF-α平均荧光强度统计结果（，n = 9）

表3 小鼠胎盘组织iNOS、IL-6、TNF-α平均荧光强度统计结果（，n = 9）

注：与空白组相比，*P ＜ 0.05；与RSA模型组相比，#P ＜ 0.05。

TNF-α 14.0863 ± 0.7658 18.6611 ± 0.6323*15.7321 ± 0.4751#组别空白组RSA模型组黄芩治疗组iNOS 15.5444 ± 0.7089 21.7309 ± 0.6233*16.2032 ± 1.0056#IL-6 12.2734 ± 0.3700 19.0583 ± 0.5200*12.9359 ± 0.3518#

4.4 免疫荧光法检测各组孕鼠胎盘组织中iNOS、IL-6、TNF-α、Arg-1、IL-10的表达

由表3、4及图3、4结果显示，与空白组相比，RSA模型组孕鼠胎盘组织iNOS、IL-6、TNF-α表达均明显增高，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）；Arg-1、IL-10表达均明显降低，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。与RSA模型组相比，黄芩治疗组孕鼠胎盘组织iNOS、IL-6、TNF-α表达均明显降低，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）；Arg-1、IL-10表达均明显增高，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）（表3、表4、图3、图4）。

表4 小鼠胎盘组织Arg-1、IL-10平均荧光强度统计结果（，n = 9）

表4 小鼠胎盘组织Arg-1、IL-10平均荧光强度统计结果（，n = 9）

注：与空白组相比，*P ＜ 0.05；与RSA模型组相比，#P ＜ 0.05。

IL-10 26.6663 ± 0.3907 19.8832 ± 0.5709*25.7617 ± 0.4433#组别空白组RSA模型组黄芩治疗组Arg-1 25.8579 ± 0.3656 18.9046 ± 0.2731*24.9819 ± 0.4823#

图3 各组胎盘组织中iNOS、IL-6、TNF-α的免疫荧光表达（×400）

图4 各组胎盘组织中Arg-1、IL-10的免疫荧光表达（×400）

5 结论

正常妊娠依赖于母-胎界面的各类系统在免疫微环境中精准的动态稳定。任何不良因素作用于母-胎界面，诱发其免疫微环境发生异变，都有可能导致胎儿丢失[9]。简言之，母-胎界面免疫微环境的平衡稳定，在维持正常胚胎发育过程中起着决定性作用，是防治RSA的关节环节。

目前，西医方面对于RSA尚无特效治疗的药物，常规治疗方案多以外源性补充孕激素，如地屈孕酮、黄体酮，针对黄体功能不全的患者，这类药物保胎疗效显著，但对其他因素引起的反复的先兆流产疗效较差。所以，中医药在治疗此病方面，具有不可忽视的潜在价值。RSA在祖国传统医学里属“滑胎”、“胎动不安”之列，该病的病因主要在先天胎元不固与后天气血不调两个方面。肾为先天之根本，主天癸，先天肾气肾精充盛，则胎儿有所育；脾为后天之根本，脾气充实，则气血化生有源，使胎儿有所养。因此，中医理论多以补肾健脾为安胎基本疗法，目前对于安胎的中医药研究多集中在健脾益肾方面[10-11]。但在临床实践中，证候之虚、实、寒、热不同，当根据不同辨证而论治。女子怀孕之后，气血聚集冲任，以养育胎元，若素体肝气旺盛，再遇情志不遂，或素体阳气偏亢，则易郁生内热，热扰胞宫，血为热迫而不循常道，气血不调，也可致胎动不安。因此，临床辩证为“血热”者，当调节冲任之气血，清热以安胎。黄芩最开始记录于《本经》，为唇形科植物黄芩的干燥根，朱震亨将其称作“安胎圣药”[12]，其性凉味苦、寒，擅于清热、泻火、止血、安胎[13]。临床滑胎时辩证为血热者，中药汤剂中常配伍黄芩以清热安胎[14]。因此，本研究选用黄芩干预RSA孕鼠，研究其清热安胎的可能作用机制，为中医临床辨证论治以安胎提供相应的理论支持。

自1980年研究发现，雌性CBA/J小鼠（H-2K）与雄性DBA/2小鼠（H-2d）交配后，具有易患反复自然流产的特点,孕鼠流产率高达20%-45%，而在同为H-2K×H-2d交配方式的CBA/J×BALB/C中，孕鼠的流产率仅为5%-10%，这个发现为深入研究妊娠这一复杂生理现象提供了两个经典的动物模型，即CBA/J雌鼠与BALB/C雄鼠2∶1合笼，建立正常妊娠模型，将CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠2∶1合笼，建立复发性流产模型，这一造模方法是目前国际公认的经典造模方法[6-7]，被广泛用于RSA相关实验研究[15-17]。因此，本实验以目前国际公认的经典造模方法制造了正常妊娠模型和复发性流产模型。

本研究发现，黄芩治疗组胚胎丢失率明显低于RSA模型组，表明黄芩有利于降低RSA孕鼠自然流产风险。本实验选用光镜观察了RSA孕鼠胎盘组织在细胞层面的结构，可见造模成功的RSA孕鼠胎盘组织出现了蜕膜带的部分脱落，巨细胞滋养层和海绵滋养层也出现了不同程度的坏死，可见坏死细胞胞核固缩、崩解，胞浆渗出，以及大量的炎性细胞浸润，这些细胞层面结构的病理改变促使了流产的发生。而经过黄芩干预治疗后，可见脱落的蜕膜恢复正常，出现坏死的巨细胞滋养层和海绵滋养层被修复至仅存在点状坏死，炎性细胞大大减少，说明黄芩具有明显改善RSA孕鼠胎盘组织显微结构的作用。且本实验进一步运用了放大倍数大于光镜1000倍的透射电镜观察各组孕鼠胎盘的绒毛超微结构，包括其表面的合体滋养层和轴心的细胞滋养层，可见RSA模型孕鼠的合体滋养层细胞和细胞滋养层细胞疑似发生坏死，其胞内结构发生了明显异常改变，出现了细胞核显著皱缩，染色质聚集，电子密度增大，胞浆内线粒体大量肿胀，粗面内质网高度扩张；而经黄芩干预后的RSA胎盘绒毛超微结构几乎与正常孕鼠相同，说明黄芩可有效改善RSA孕鼠模型胎盘局部的超微结构病变。综上所述，黄芩可明显修复RSA孕鼠胎盘局部母-胎界面的异常病理改变。

本实验层层推进，从免疫层面入手，进一步探索了黄芩改善RSA孕鼠胎盘局部母-胎界面病理结构的可能作用机制。妊娠期间，巨噬细胞、T淋巴细胞、及自然杀伤细胞是调控子宫局部胎盘组织免疫功能的主要免疫细胞[3]。目前，对母-胎界面免疫耐受的研究，多集中在辅助T淋巴细胞Thl/Th2型细胞因子[18-19]，而对巨噬细胞相关研究较少。但在母-胎界面的免疫耐受形成过程中，巨噬细胞同样扮演着不可忽视的角色[20]。巨噬细胞可极化为M1型和M2型，M1型巨噬细胞高表达iNOS及大量的促炎细胞因子如IL-6、TNF-α等表面特异性标记物，M2型巨噬细胞高表达Arg-1及大量的抗炎细胞因子如IL-10等表面特异性标记物[21]。有研究表示，正常妊娠蜕膜中的巨噬细胞，M2型明显多于M1型；而RSA患者蜕膜中的巨噬细胞则以M1型占优势[22]。徐春芳等[23]发现复发性流产病理妊娠状态下，母-胎界面存在不同程度的M1/M2型巨噬细胞极化失衡。由此可见，M1/M2型巨噬细胞极化是否正常，直接影响母-胎界面促炎因子及抑炎因子的含量，关乎妊娠的成败。抑制巨噬细胞M1型极化或促进M2型极化是调节-胎界面异常炎症反应的重要方法，可有效抑制流产的发生。因此，本实验选择M1型巨噬细胞因子（iNOS、IL-6、TNF-α）和M2型巨噬细胞因子（Arg-1、IL-10）为检测指标，以M1/M2型巨噬细胞极化平衡作为研究切入点，探究黄芩对RSA孕鼠胎盘组织局部母-胎界面M1/M2型巨噬细胞极化平衡的影响。

多项研究表明，黄芩苷作为黄芩的主要活性成分，可在多种疾病中发挥抗炎作用，如在心肌炎和口腔炎中，黄芩苷通过抑制IL-6和TNF-α的表达，以达到明显的消炎目的[24-25]。在脊髓损伤中，黄芩苷可通过抑制脊髓损伤大鼠脊髓组织中M1型巨噬细胞标记蛋白iNOS和M1型巨噬细胞炎症因子（IL-12和TNF-α）的表达，促进M2型巨噬细胞标记蛋白Arg1和M2型巨噬细胞炎症因子（IL-4和IL-10）的表达，参与抑制脊髓损伤大鼠炎症反应过程[26]。

本研究可见，RSA模型组过表达iNOS、IL-6、TNF-α，低表达Arg-1、IL-10，提示RSA孕鼠胎盘局部出现了巨噬细胞向M1型倾斜，为炎症的发生发展创造了条件，而经黄芩干预后的RSA孕鼠胎盘局部可见过量表达的iNOS、IL-6、TNF-α明显降低，Arg-1、IL-10表达明显增高，说明黄芩可明显抑制M1型巨噬细胞极化，促进M2型巨噬细胞极化，抑制胎盘局部母-胎界面异常的炎症反应。

黄芩是中医临床常用清热安胎药物，功效显著、毒副作用小、价格低廉，广泛应用于保胎治疗。本研究结果显示，黄芩可通过调控M1/M2型巨噬细胞极化平衡，调节RSA胎盘局部母-胎界面异常炎症反应，明显优化RSA胎盘组织免疫微环境，改善其母-胎界面微观结构病变，对维持妊娠起到积极作用。