基于网络药理学方法探索中药治疗代谢综合征的活性成分及作用机制＊

刘艳飞，孙明月，姚贺之，柴露露，高 蕊＊＊

（1.北京中医药大学研究生院 北京100029；2.中国中医科学院西苑医院临床药理研究所 北京100091）

代谢综合征（Metabolic Syndrome，MS）是以肥胖（或超重）、高血糖、高血压、血脂代谢异常等为主要特征的一组临床综合征[1]。近年来我国MS的发病率明显增高，数据显示我国18岁以上的成人中MS的患病率约为33.9%，据此估计中国目前有4.5亿MS患者[2]。MS严重威胁着人类的健康，其心血管事件的发病及死亡危险约为非MS患者的2-3倍[3]。现代医学采取单一疾病的治疗模式对MS的各个组分进行不同方式的干预，尚缺乏整体干预方案。中医药治疗MS具有很大的优势，前期课题组采用文献计量学的研究方法，对治疗代谢综合征的中药使用频次进行统计，选取频次居于前10的高频中药行进一步的研究，十味高频中药分别为黄芪、茯苓、丹参、泽泻、山楂、半夏、大黄、白术、黄连、川芎[4]。本研究采用网络药理学的方法探索高频中药治疗MS的主要活性成分、核心靶点及其作用机制，为中医药治疗MS提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 MS相关疾病靶点、基因的查询

以"Metabolic Syndrome"为关键词检索TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）、Pharmgkb（https://www.pharmgkb.org/）、CTD（http://ctdbase.org/）等数据库，去重后获得疾病的相关靶点。通过Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库查询靶点蛋白的基因名称。

1.2 高频中药活性成分的筛选和靶点预测

本研究以治疗MS的高频中药黄芪、茯苓、丹参、泽泻、山楂、半夏、大黄、白术、黄连、川芎为关键词，分别检索TCMSP数据库（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[5]，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，对其成分及作用靶点进行筛选构建。

1.3 MS靶点-高频中药成分相关网络的构建

将MS相关疾病靶点与中药成分作用靶点用UniProt数据库中的Gene name进行标准化命名。将高频中药成分、高频中药成分作用的疾病靶点与MS的疾病靶点运用Excel表格建立数据库并进行整合，获得高频中药成分作用于MS的靶点。采用Cytoscape软件构建MS靶点-高频中药成分网络，并进行可视化分析等。采用Cytoscape软件中的CytoNCA插件导出MS靶点-高频中药活性成分网络的拓扑数据，计算数据中网络节点度（degree）和介数（betweenness）的中位数。网络节点度（degree）和介数（betweenness）是网络药理分析中的重要参数，定义大于等于degree值中位数的2倍且具有较高介数（大于等于介数值的中位数）的靶点为核心靶点[6]。得到MS核心靶点后，进一步构建中药治疗MS核心靶点-高频中药成分网络，根据核心靶点进行中药治疗MS主要活性成分的筛选。

1.4 富集通路分析

通过DAVID数据库行KEGG通路富集，Bonferroni法校正后P<0.05的通路被认为是显著富集。

2 结果

2.1 MS疾病靶点筛选

检索TTD、DrugBank、Pharmgkb、CTD数据库获得161个MS的疾病靶点，结果见表1。

2.2 高频中药的活性成分及其作用疾病靶点预测

通过TCMSP数据库检索到十味高频中药已报道的成分732个，以OB≥30%和DL≥0.18作为条件，经筛选后共得到活性成分黄芪20个、茯苓15个、丹参65个、泽泻10个、山楂6个、半夏13个、大黄16个、白术7个、黄连10个、川芎7个，同时在TCMSP数据库检索中药成分作用的疾病靶蛋白，将中药活性成分作用的疾病靶点与MS的疾病靶点进行整合，获得中药成分作用于MS靶点的608条结果。十味高频中药成分作用于MS的靶点基因的部分结果见表2。

2.3 MS靶点-高频中药成分相关网络的构建

利用Cytoscape软件建立“MS靶点—中药成分网络”，详见图1，该网络有155个节点，612种相互作用关系。通过网络分析发现高频中药成分可作用于24个MS靶点，利用cytoscape3.6.0软件分析计算MS靶点—中药成分网络的度（degree）值和介数，截取24个MS靶点的degree值中位数两倍及其以上的节点（degree≥10）且具有较高介数（介数值≥8.47）的靶点为核心网络靶点，分析获得了7个中医治疗MS的核心靶点，具体结果见表3，推测这7个靶点可能与高频中药治疗MS的作用机制相关。

根据核心网络的筛选，发现有137个中药成分可以作用于7个MS核心靶点，为了进一步分析网络中主要的活性成分，针对137个成分及7个核心靶点构建“中药治疗MS核心靶点-中药成分网络”（图2），网络分析发现有26个成分可以作用于4个及以上的靶点，且具有较高的介数（介数值≥4），分析网络提示这些主要活性成分的变化可能对MS靶点-中药成分网络的稳定性会产生较大的影响，从而改变中药治疗MS的疗效，推测这26个中药成分为高频中药组治疗MS的主要活性成分，具体中药成分见表4。进一步分析26个中药活性成分中含有较多的黄酮类化合物（山奈酚、槲皮素、儿茶素、异鼠李素等）、醌类化合物（主要分为丹参酮；丹参内脂类，如四氢丹参酮、亚甲基丹参醌、二氢丹参内脂、新隐丹参酮II等）。

将24个中药成分作用于MS的基因导入DAVID数据库进行通路富集分析，排除宽泛的通路，选取Bonferroni法校正后P<0.05的通路，具体KEGG通路如表5所示。

3 讨论

代谢综合征是以肥胖（或超重）、高血糖、高血压、血脂代谢异常等为主要特征的一组临床综合征[1]，本研究运用网络药理学方法对中药治疗代谢综合征的作用机制进行了初步的探讨。研究发现高频中药的主要活性成分黄酮类和醌类化合物可能作用于AR、PTGS2、PTGS1、ESR2、ADRB2、eNOS、PPARG等7个核心靶点，通过调控上游通路胰岛素抵抗通路，下游信号通路PPAR信号通路、雌激素信号通路、TNF信号通路等达到治疗代谢综合征的作用。

表1 代谢综合征疾病靶点

7 个信号通路中最多的作用为调节脂质代谢。脂肪组织是机体内重要的储能器官，也为其他组织或器官提供能量[7],脂肪细胞的脂解过程是一个复杂的过程，由脂肪组织脂解产生的活性物质与代谢性疾病如胰岛素抵抗、糖尿病、脂肪肝、高血压、心血管疾病密切相关[8,9]。

图1 MS靶点—中药成分网络

表2 高频中药成分作用于MS的疾病靶点、基因的结果（部分）

核心靶点中PPARG、ESR能够参与脂质的代谢[10-14]。本研究中高频中药活性成分可作用于过氧化物酶γ受体（PPARG）、雌激素受体（ESR）等靶点，这一作用主要通过PPAR信号通路、雌激素信号通路、花生四烯酸信号通路实现。过氧化物酶增殖体激活受体γ的基因多态性与糖脂代谢有着一定的关系。唐新等[10]通过测定糖尿病患者与正常健康者PPARG基因的多态性发现PPARG基因可能参与糖尿病患者的糖脂代谢。研究显示PPAR与相关的配体结合激活转录因子，通过调控靶基因而调节机体的脂肪、能量的代谢[11,12]。高倩等[13]研究发现，PPAR配敲除的ob/ob小鼠肥胖和脂肪肝明显加重。Monjo等[14]研究表明雌激素受体介导，可影响脂肪分布的部位，通过上调不同受体的表达，促进脂肪的分解。雌激素信号通路通过细胞膜上的雌激素受体进行信号转导，通过调节下丘脑神经肽的水平达到调节脂质代谢、影响能量代谢，同时可促进瘦素及其脂肪酸结合蛋白的分泌，促进脂肪的分解[15]。花生四烯酸是体内分布最为广泛的多不饱和脂肪酸之一,对于维持细胞膜的结构和功能有着重要的作用[16,17]，文献表明花生四烯酸对胰岛素抵抗及肝糖原输出紊乱具有预防作用[18],可抑制前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞转化、减少脂肪生成量[19]。因此，高频中药可能通过PPAR信号通路、雌激素信号通路、花生四烯酸信号通路、脂肪细胞的脂解作用达到调节脂肪代谢，治疗代谢综合征中血脂异常这一组分。

表3 高频中药成分治疗MS的核心靶点

图2 中药治疗MS核心靶点-中药成分网络

已知eNOS、ADRB2是调节血管舒缩功能的介质[20-25]，PTGS1、PTGS2具有抗血管收缩介质的作用[28,29]。内皮一氧化氮合酶（eNOS）可参与血压的调节，有研究表明内皮一氧化氮合酶位点基因突变与高血压的发生有一定的关系[20]，内皮一氧化氮合酶的含量与血清脂联素、一氧化氮联合作用影响着高血压、糖尿病患者的血压、血糖水平[21-23]。研究发现当阻断大鼠脑内eNOS的活性时，大鼠的平均动脉压会升高，在高血压发病前期，大鼠脑内的eNOS的活性降低，参与了高血压的生成，在形成稳定性高血压时，eNOS的活性会出现升高以代偿性地降低血压，因此，eNOS在血压变化的过程中起着重要的作用[24]。β2肾上腺素能受体是交感神经的重要组成之一，若其功能障碍，可导致高血压（主要为原发性高血压）的发生，当β2上肾上腺素能受体功能的基因表型（如Arg16Gly、Thr164Ile、Gln27Glu等）发生改变时，患者的血压会发生明显的变化[25-27]。前列腺素G/H合酶（PTGS）内皮源性血管舒张因子可以前列环素受体G蛋白耦联受体结合，激活G蛋白，引起细胞内cAMP水平升高，cAMP激活蛋白激酶A，引起血小板聚集性抑制，血管平滑肌松弛因此前列环素及其类似物可产生对抗血管收缩介质的作用，引起血压的降低[28,29]。因此，高频中药可能作用于eNOS、ADRB2、PTGS1、PTGS2参与调节代谢综合征患者的血压水平。

表4 高频中药治疗MS的主要活性成分

表5 KEGG通路富集结果

此外，肥胖、糖尿病、高脂血症、高血压等与代谢相关的疾病逐年增多，而胰岛素抵抗是上述疾病共同的危险因素及病理基础，胰岛素信号通路任何一位点的异常都可导致胰岛素抵抗[30]。肥胖是发生在脂肪组织中的炎症状态，肥胖引起的胰岛素抵抗可能与炎性细胞因子（如TNF-α）的表达增加有关[31]，研究发现TNF-α处理脂肪细胞表现出胰岛素信号和糖摄取降低，TNF-α-/-小鼠高脂饮食诱导肥胖后与对照组相比，血糖和胰岛素水平明显降低，葡萄糖和胰岛素敏感性得到改善[32]。雄激素受体介导雄激素发挥作用，雄激素的水平与肥胖、糖脂代谢相关。雄激素受体介导雄激素发挥作用，雄激素水平过高的女性，如多囊卵巢综合征患者，可出现肥胖、糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗以及糖尿病等肥胖相关疾病[33,34]。本研究发现高频中药可以作用于雄激素及胰岛素抵抗信号通路达到减轻代谢综合征患者肥胖及胰岛素抵抗的问题。

26 个中药活性成分中含有较多的黄酮类化合物（山奈酚、槲皮素、儿茶素等）、醌类化合物（丹参酮、丹参内脂类等）。文献研究显示，黄酮类化合物如儿茶素、槲皮素等均对动物实验性脂质代谢异常、动脉粥样硬化具有较好的防治作用[35-37]。于春刚等[38]建立鹌鹑高脂食饵性动脉粥样硬化模型后，将其随机分为空白对照组、洛伐他汀组（79.5 mg·kg-1）及儿茶素低剂量组（20 mg·kg-1）、中剂量组（40 mg·kg-1）、高剂量组（80 mg·kg-1），结果显示与模型组相比,儿茶素中剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇含量明显升高，各剂量组肝脏脂肪变分级明显低于模型组，研究表明儿茶素具有调节血脂和预防动脉粥样硬化的作用。吕丽等[39]将动脉粥样硬化模型大鼠分为空白对照组、辛伐他汀组（4 mg/kg/d）、槲皮素高剂量组（50 mg/kg/d）及低剂量组（25 mg/kg/d），实验结果表明槲皮素可降低动脉粥样硬化大鼠血脂甘油三酯及总胆固醇水平，实现其抗动脉粥样硬化的作用，其作用机制可能与激活PI3K/Akt/NF-κb通路有关。醌类化合物如丹参酮联合西药可明显降低高血压患者的血压和血脂水平[40,41]。杨文聪等[40]将80例原发性高血压患者随机分为卡托普利对照组，丹参酮ⅡA联合卡托普利的治疗组，予以药物治疗8周后结果显示两组的血压均有下降；与对照组相比，治疗组患者的血压水平明显降低，血管内皮一氧化氮含量明显增加、内皮素-1含量明显降低，结果提示丹参酮ⅡA联合卡托普利可以显著降低原发性高血压患者的血压水平，其作用机制可能与调控血管内皮功能有关。以上提示黄酮类化合物和醌类化合物具有抗代谢综合征危险组分的作用，其可能是治疗MS的重要成分群组，在后续药效物质基础及分子机制的研究中可加以关注。

高频中药治疗代谢综合征呈现出多成分、多靶点、多通路的作用特点，其主要活性成分可通过调节脂质代谢（如PPARG、ESR等）、调节血压水平（如eNOS、ADRB2、PTGS1、PTGS2等）、减轻胰岛素抵抗等作用参与对代谢综合征不同危险因素的调控，进而影响代谢综合征的发展。本研究为后续系统开展中药治疗代谢综合征的药效物质基础及分子作用机制提供了一定的理论依据。