基于网络药理学试述消癌解毒方组方中君臣关系及其防治肝癌的研究＊

朱恒舟，季 漪，马艳霞，谭佳妮，2，李文婷，2，吴勉华，2＊＊

（1.南京中医药大学第一临床医学院 南京210000；2.江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心 南京210000）

1 前言介绍

恶性肿瘤是导致人类死亡的主要原因之一。《2015中国癌症统计数据》显示[1]，2015年中国预计有429.2万例新发肿瘤病例和281.4万例死亡病例，肿瘤已经成为一种常见疾病。近年来中医药以其多部位、多靶点的整体调控作用，在改善肿瘤患者的临床症状、提高生存质量、延长生存周期及减轻放化疗毒副反应方面显示出其独特的临床疗效，因而受到了广泛关注。

消癌解毒方是国医大师周仲瑛教授根据其“癌毒”病机理论及数十年临床经验所提出的治疗恶性肿瘤临床有效验方，该方由白花蛇舌草、山慈菇、僵蚕、蜈蚣、太子参、麦冬、八月札组成，方中以白花蛇舌草清热解毒为君药；山慈菇化痰软坚、太子参益气养阴为臣药；佐以麦冬、八月札理气解郁，益气养阴；僵蚕、蜈蚣消结散肿，扶正消癌。全方共奏消癌解毒、扶正祛邪之功效。韩淳淳[2]通过20例未行手术治疗或出现复发转移的肝癌带瘤生存患者进行服用消癌解毒方前后的中医临床症状、肿瘤标志物及瘤灶情况进行比较、分析，发现消癌解毒方可改善肝癌中晚期患者的临床症状，稳定病情。周红光[3]通过将198例Ⅲ-Ⅳ期肿瘤患者分为化疗+中药组（治疗组），单纯化疗组（对照组）进行研究，结果发现消癌解毒方能提高中晚期恶性肿瘤近期临床疗效，减少化疗药物的毒副反应，明显提高患者的生活质量，是一种发展前景较好的抗癌药物。通过临床观察发现，课题组前期研究验证消癌解毒方具有抗肿瘤的效果，并初步探讨了其作用机理，但是并没有从生物信息学角度对其防治肿瘤靶点有效性及组方合理性进行探讨。本文运用网络药理学理论方法，对消癌解毒方防治肿瘤靶点有效性及组方合理性进行初探，运用现代生物技术手段阐释其抗肿瘤机制，并通过网络药理学“网络标靶”[4-5]手段从现代生物技术层次论述了消癌解毒方组方君臣关系的合理性，为后续研究做铺垫。

1 材料及方法

1.1 消癌解毒方中药物有效活性成分的分析

消癌解毒方为临床应用有效的防治肿瘤的经验方，本研究依托中药药理分析平台[6]（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）分析其中药物白花蛇舌草有，太子参以及山慈菇的有效成分，同时通过设置口服生物利用度（OB）>30%，类药性（DL）>0.18的筛选标准或许药物有效化合物，通过此方法获得的化合物再利用美国国家健康研究院PubChem平台（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）验证目标所化合物的有效性。

1.2 消癌解毒方中有效活性成分靶点的预测

利用Swiss Target Prediction平台[7-8]（http://www.swisstargetprediction.ch/），结合消癌解毒方中的有效化合物，预测出白花蛇舌草、太子参、山慈菇对应的靶点，并且将种属关系选择为人类。

1.3 肝癌对应靶点网络的构建

目前对于疾病靶点基因研究较为完善的数据库有DisGeNET[9-10]（http://www.disgenet.org），人类孟德尔遗传研究平台OMIM（http://www.omim.org/），治疗靶点数据库TTD[11]（http://biddnus.edu.sg/BIDD-Database/TTS/TTS.asp），PharmGkb[12-13]数据库（http://pharmgkb.org/），本研究通过检索关键词“hepatic”“liver”“hepatocellular”“cancer”“tumor”“neoplasm”，在各个数据库中的表达数据，删除重复靶点，从而构建针对肝癌所形成的独特的靶点网络。

1.4 靶点基因互作网络的构建

靶点基因的表达最终会以蛋白的形式的细胞体内进行表达，通过STRING数据库，联合分析药物有效的靶点基因以及肝癌相关的靶点基因的之间的关系，借助Cytoscape 3.2（http://cytoscape.org），构建出药物与疾病之间密切联系的蛋白质网络互作图。

1.5 目标基因生物功能学注释及通路分析及其可视化分析

本研究采用DAVID 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对PPI网络中的蛋白进行GO功能富集分析，通过KEGG通路富集的信号通路中的相关信息对消癌解毒方中有效成分作用靶点位置进行分析，并构建相关分析图。利用R包clusterProfiler[14]进行数据分析及可视化。

1.6 细胞培养

人肝癌SMMC7721细胞购自中国科学院上海细胞库细胞库，培养条件：10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，放入5%CO2，37℃培养箱中孵育。

1.7 含药血清制备

消癌解毒方由白花蛇舌草20 g，山慈菇10 g，麦冬12 g，太子参15 g，八月札12 g，僵蚕10 g，蜈蚣3 g组成（药材购自安徽省亳州市中西药有限公司，由南京中医药大学药学院教授鉴定均符合《中华人民共和国药典》2015年版要求）。药物以10倍体积水，浸泡1 h后大火煮开，再小火煮2 h，取滤液。剩余药渣加8倍体积水继续煮1.5 h，取滤液。两次滤液混合均匀后浓缩成生药量2 g/mL的药液，储存备用。

取30只SD大鼠雌雄各半，平均体重（200±10）g，许可证号：SCXK（苏）2016-0003。按照消癌解毒方低中高浓度组（10 mg/kg，20 mg/kg，40 mg/kg）给药7天后提取含药血清。

1.8 CCK8法检测人结肠癌SW480细胞增殖活力

取各组加药后对数期的细胞，制备细胞悬液，细胞浓度调整为3×105/mL，接种于96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，加入10μL CCK8溶液，置于37℃、5%CO2培养箱孵育2 h，酶标仪在490 nm波长处测定并记录各组吸广度，计算细胞增殖活力。

1.9 划痕实验

用记号笔在6孔板背后，划出均匀的5条线。每孔加入约5*105个细胞，24 h后用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，在各组中按照对应浓度加入消癌解毒方含药血清培养基200μL，刺激24 h。正常对照组只加入等量的PBS缓冲溶液，放入37℃5%CO2培养箱培养。24 h后取出，拍照。

1.10 流式细胞术检测细胞凋亡

各组细胞用PBS冲洗2遍，加入不含EDTA的胰蛋白酶将细胞消化后收集细胞，1 000 r/min离心5 min，定容至500个/mL，按照AnnexinⅤ/PI试剂盒加入工作液及染料，震荡均匀，避光静置5 min后，上机检测。

1.11 Wester n Blot分 析7721细 胞 内BAX、Bcl-2，Cleaved Caspase-3蛋白表达水平

取生长密度带到80%的细胞，加入RIPA裂解液（含PMSF），反复吹打。后置于冰上裂解30 min，低温离心（4℃，10 000 r/min）10 min后取上清液，BCA法测蛋白浓度，加上样缓冲液混匀，高温变性后分装，-80℃保存备用。查询相应蛋白分子量，制备聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至PVDF膜，5%BSA室温摇床封闭2 h，置于含有一抗稀释液的抗体孵育盒中4℃过夜，TBST摇床漂洗3次后，加入HRP标记的山羊抗兔IgG，室温摇床孵育1 h，TBST摇床漂洗3次后，加入ECL显色液避光反应2 min，显影，分析。

2 结果

2.1 消癌解毒方有效中药成分的分析。

通过分析消癌解毒方中白花蛇舌草、太子参、山慈菇的有效成分及其化合物，通过口服生物利用度（OB）>30%，类药性（DL）>0.18的筛选标准，同时去除目前研究中为具有有效报道的成分，共获得有效化合物13种，其中白花蛇舌草5种，太子参6种，山慈菇2种（表1）。

表1 消癌解毒方组成中药有效活性成分

2.2 消癌解毒方中有效成分的靶点预测

通过Swiss Target Prediction平台，在种属关系为人类的前提下，共获得白花蛇舌草对应靶点基因189个，太子参对应靶点87个，山慈菇对应靶点基因54个。

2.3 肝癌对应基因靶点的建立

通过对于肝癌相关关键词的检索，我们从DisGeNET数据库中找到相关的靶点基因603个，OMIN数据库中共搜索到132个靶点基因，治疗靶点数据库TTD中共检索到17个对应靶点。通过上述三大靶点数据库结果的整理，排除重复基因以及非人源基因的内容，我们共获得相对应靶点基因651个，与肝癌相关非编码RNA 45个。

图1 1-a消癌解毒方中药物有效活性成分对应白蛋基因；1-b消癌解毒方中药物有效靶点基因与疾病肝癌对应靶点的交集

2.4 靶点基因互作网络的构建及其可视化

通过VENN图的方式，共取得消癌解毒方-肝癌对应靶点基因64个，同时借助Cytoscape软件可视化分析，得到消癌解毒方中各药物所对应的靶点。其中白花蛇舌草对应基因59个，太子参对应基因32个，山慈菇对应基因9个，其中3种药物共同作用的基因有BCL2、CASP8、NCOA2、PTGS2、TGFB1、BAX、CASP3等7个基因（图1a-b）。

图2-a白花蛇舌草有效活性成分对应靶点；图2-b山慈菇有效活性成分对应靶点；图2-c太子参有效活性成分对应靶点。

图2 消癌解毒方药物活性成分对应靶点

2.5 消癌解毒方中药有效成分与肝癌相关靶点基因互作关系

通过本次研究对于消癌解毒方-有效成分对应靶点，消癌解毒方-肝癌对应靶点的数据总结，得出得出白花蛇舌草有效成分2-甲氧基-3-甲基-9，13-蒽醌，豆甾醇，β-谷甾醇，槲皮素对应靶点基因73个，太子参有效成分金合欢素，β-谷甾醇，木犀草素，仙人掌甾醇对应有效靶点43个，山慈菇有效成分β-谷甾醇，豆甾醇对应靶点11个（图2）。

表2 消癌解毒方对应肝癌有效靶点KEGG富集通路

2.6 消癌解毒方靶点基因的KEGG通路分析

通过对于消癌解毒方与肝癌对应的靶点基因都富集到了与癌症相关的的通路上，根据p值的排序，前23项中与肿瘤直接相关的通路有10项，包括了肝癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤项目。同时又有3条与肿瘤细胞的的代谢凋亡直接相关的通路，包括癌症中的蛋白多糖、细胞衰老、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路（表2）。同时根据P<0.05为筛选标准，选区前10项。

图3 消癌解毒方中药物对应疾病有效靶点的GO分析及KEGG可视化分析

2.7 消癌解毒方中药物对应靶点的GO分析

通过对消癌解毒方中有效药物对应靶点的GO分析，我们发现山慈菇的生物功能富集在乳腺形态发生、对渗透压的反应、细胞对渗透压的反应、淋巴细胞稳态、B细胞稳态、T细胞稳态等相关功能上（图4ab）；太子参富集在了T细胞增殖的负调节、骨髓白细胞分化的正调节、巨噬细胞分化、B细胞稳态、T细胞稳态、细胞质模式识别受体信号通路、单核细胞分化等功能方面（图4c-d）。通过对白花蛇舌草有效靶点的功能富集，我们发现细胞功能主要分布在细胞对活性氧的反应、消化系统的发展、上皮细胞凋亡过程、平滑肌细胞增殖、调节平滑肌细胞增殖、平滑肌细胞增殖的正调节、受体代谢过程、通过RNA聚合酶Ⅱ转录pri-miRNA、通过RNA聚合酶Ⅱ调节pri-miRNA转录、细胞周期等方面（图5）。

2.8 通过计算各组间细胞的吸光度值，计算各组细胞的细胞活性，低中高剂量组与空白组对比后P<0.05存在统计学意义，同时随浓度增加，细胞活性随之降低。

2.9 通过划痕实验，空白组的细胞迁移面积明显高于高剂量组，消癌解毒方中，高剂量组对于细胞的迁移均具有一定的抑制作用。

图4a-d 太子参，山慈菇有效成分GO生物功能富集；a-b太子参有效生物成分生物功能富集分析；c-d山慈菇有效生物成分生物功能富集分析

2.10 通过流式细胞术统计各组细胞的凋亡率，空白组细胞凋亡率为15.82%，低剂量组凋亡率17.42%，中剂量组凋亡率18.34%，高剂量组凋亡率19.41%。高剂量组相较空白组具有统计学意义，P<0.05。

2.11 通过检测各组细胞中的Bax，Bcl-2，Cleavedcaspase-3表达量，我们发现加用消癌解毒方低中高剂量的细胞中Bax含量明显上升，Bcl-2的表达量减少，Cleaved-caspase-3的表达量也同时上升。同时Bax、Cleaved-caspase-3的表达量存在浓度依赖性，Bcl-2的表达量随浓度的升高而减少。

图5 白花蛇舌草有效活性成分功能富集分析

图6 消癌解毒方低中高剂量对于细胞活性的影响

3 讨论

中药复方“消癌解毒方”是临床应用实际有效的方剂，该方剂由白花蛇舌草、太子参、山慈菇为君臣主体组构成，其在临床中对于结直肠癌、肺癌，特别是肝癌的综合治疗具有独特的疗效。

中药复方是化学体系与病证系统的复杂结合。借助网络药理学“网络靶标”这一概念与方法[15]，本研究通过分析消癌解毒方中各药物的有效成分，借助中药药理分析平台（TCMSP）筛选有效成分并按照口服生物利用度（OB）>30%，类药性（DL）>0.18的筛选标准，并通过PubChem验证有效成分的活性，同时通过Swiss Target Prediction平台进行活性成分靶点预测，发现中药白花蛇舌草中对应靶点基因73个，太子参对应有效靶点43个，山慈菇对应靶点11个（图1）。同样，针对目前临床对于消癌解毒方应用效果较好的肝癌，本实验组通过是对肝癌相关的基因进行了统计分析，借助DisGeNET、人类孟德尔遗传研究平台OMIN、PharmGkb三大临床疾病数据库的靶点分析，与肝癌相关的共有651个。同时通过映射的关系，我们发现了中药复方消癌解毒方可能作用于相关的64个靶点基因来实现对于肝癌的影响。同时通过对于互作靶点的GO分析以及KEGG分析，我们发现消癌解毒方可能通过氧化还原通路、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路等多途径、多通路作用于肝癌细胞，最终实现对于肝癌细胞的杀伤以及促进其凋亡的作用达到临床治疗的效果（图3）。与此同时，本实验组同时对于消癌解毒方有效活性成分的生物学功能进行了富集分析，发现这些功能同时会作用于膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、小细胞肺癌、肝细胞癌、胃癌等多种临床常见肿瘤，这从分析学角度解释了临床消癌解毒方应用于多种肿瘤都能起到一定疗效的原因。

图7 细胞划痕实验a:空白组；b:低剂量组；c：中剂量组；d：高剂量组

图8 流式细胞术检测细胞凋亡a:空白组；b:低剂量组；c：中剂量组；d：高剂量组

图9

同时中药复方“消癌解毒方”在临床联合化疗治疗肿瘤时，患者的的化疗副作用如恶心呕吐、咳嗽、失眠等症状都明显优于单纯化疗组[16]。本研究通过对复方中对应活性成分的靶点分析，发现消癌解毒方中君药白花蛇舌草的活性成分功能富集多与细胞对活性氧的反应、消化系统的发展、上皮细胞凋亡过程、平滑肌细胞增殖、调节平滑肌细胞增殖、平滑肌细胞增殖的正调节、受体代谢过程、通过RNA聚合酶Ⅱ转录pri-miRNA、再生、细胞周期停滞、对dsRNA的反应、成纤维细胞增殖的正调节、有丝分裂细胞周期检查点、细胞周期G1/S相变的调节、调节有丝分裂细胞周期的G1/S转换等细胞增殖凋亡相关的功能上（图5），焦凯贺[17]等通过使用白花蛇舌草提取液能够在一定程度上诱导胃癌SGC-7091细胞的凋亡；郭洪梅[18]等通过研究白花蛇舌草（BHSSC）水提物对肺癌细胞增殖、凋亡的影响以及体内抑制肿瘤活性,同时发现其对凋亡关键通路MAPK信号通路的影响，从这个角度说明了白花蛇舌草防治肿瘤的作用以及其在复方中君药的地位。

通过对臣药太子参的活性成分功能分析发现，太子参中有效成分能够在T细胞增殖的负调节、骨髓白细胞分化的正调节、巨噬细胞分化、B细胞稳态、T细胞稳态、细胞质模式识别受体信号通路、含有核苷酸结合寡聚化结构域的信号通路、单核细胞分化、单核细胞分化等免疫应激等方面产生作用，我们有理由相信复方中的太子参可能通过增强免疫通路中的T细胞、B细胞等免疫相关细胞及细胞因子从而实现对于人体正气的扶助作用，降低了人体对于治疗过程中不良反应的程度（图4a-b）。褚书豪[19]等通过归纳太子参主要药理成分发现，太子参具有心肌保护、增加免疫、抗氧化、降血糖、抗应激、抗疲劳等功效；檀新珠[20]等通过实验发现，太子参茎叶多糖能够不同程度的调节小鼠体内IgA、IgM、C3含量，从而促进小鼠免疫器官的发育，增强免疫力。本次研究通过靶点功能层面，证实太子参在复方中确实起到了辅助治疗的作用。

对于复方中例外一味中药山慈菇的研究分析发现，其活性成分功能在于乳腺形态发生、对渗透压的反应、细胞对渗透压的反应、淋巴细胞稳态、B细胞稳态、T细胞稳态、蛋白质插入膜中、蛋白质插入线粒体膜、线粒体外膜透化、细胞凋亡过程中线粒体膜通透性的正调节、调节线粒体外膜透化参与凋亡信号通路、线粒体外膜通透的正调节涉及凋亡信号通路、蛋白质插入线粒体膜参与凋亡信号通路（图4c-d）。杨雪威[21]等通过山慈菇提取液作用于乳腺癌大鼠肿瘤组织后肿瘤组织中VEGF和MMP-9表达水平发生了改变，从而对肿瘤产生了抑制作用。牛晓雨[22]等通过使用山慈菇水煎剂作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞，发现细胞增殖、细胞周期、凋亡和迁移均发生了显著变化。修朋程[23]等使用山慈菇提取液作用于H22实体瘤肝癌模型，发现小鼠血清中的白细胞介素-2（IL-2）和γ-干扰素（IFN-γ）含量显著增加，同时与提取液成计量依赖性，证明了山慈菇可能增强小鼠免疫因子达到抗肿瘤的效果。因此我们发现山慈菇在免疫调节方面有着调节作用，同时还与细胞凋亡有着密切的关系。由此山慈菇同样符合臣药辅助君药加强治疗主病或主证或是针对兼病或兼证起治疗作用的特性。

通过本次研究，我们发现消癌解毒方作用于肝癌细胞系SMMC-7721后，细胞的活性及迁移能力被抑制，同时增加的了肿瘤细胞的凋亡情况，结合本次研究的网络药理学结果，我们检测了消癌解毒方可能作用的BAX、BCL2、CASP3靶点的蛋白表达情况。通过WB技术，我们发现，肝癌细胞系SMMC-7721在被消癌解毒方含药血清作用后，BAX、Cleaved-caspase-3的表达水平明显上升，Bcl-2的表达水平下降，说明消癌解毒方可能通过促进细胞凋亡的手段从而实现了对于肿瘤的抑制作用，其作用途径可能是通过影响BAX、BCL2、CASP3的表达来实现抑制肿瘤的效果，但是其具体的作用效果，还需要我们进一步的实验研究来证明。

本实验组在前期对于消癌解毒方的研究过程中得出以下结果：季漪[24]等发现消癌解毒方通过抑制AKT/mTOR信号通路激活的自噬，诱导LC3-Ⅱ蛋白表达，降低p62、p-AKT及p-mTOR蛋白表达，可能是其抑制移植瘤生长、促进肿瘤细胞凋亡的机制之一。饶希午[25]等通过蛋白组学的方式发现消癌解毒方高剂量组差异表达蛋白主要参与了代谢、炎症反应、免疫调控、热休克、氧化应激、细胞周期与凋亡、细胞生长与分化、血管生成、癌相关、肝再生修复等信号通路等。马艳霞[26]等发现消癌解毒方能够抑制H22荷瘤小鼠移植瘤生长，可通过抑制MMPs相关蛋白的表达，降低肿瘤的转移和复发可能是其抗癌机制之一。张玉[27]等发现消癌解毒方对肿瘤抑制作用可能与其诱导肿瘤细胞凋亡，抑制MMP-2活性有关。李文婷[28]等发现消癌解毒方对Walker256大鼠胸腺指数、脾指数及骨髓、胸腺细胞周期有一定的调节作用，对淋巴细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值及NK细胞活性有一定的调节作用，消癌解毒方具有免疫保护作用。姚志华[29]等发现消癌解毒方可以降低瘤重，具有较好的抑癌效应。消癌解毒方能够下调肝脏组织、胸腺和脾脏中Foxp3的表达，抑制调节性T细胞的发育分化及功能的发挥，从而抑制肿瘤的发生发展。

在本次研究中，借助网络药理学手段，发现中药复方“消癌解毒方”可能通过NCOA2、BAX、BCL2、PTGS2、CASP3、RELA、TP53等64个靶点基因，作用于细胞增殖、凋亡相关的信号通路，从而实现抑制多种肿瘤的效果。通过分析消癌解毒方的药物成分及其功能可知，白花蛇舌草主细胞凋亡，太子参增强免疫系统，山慈菇同时具有促进凋亡及调节免疫的功能。通过WB等实验手段发现消癌解毒方确实通过作用BAX、BCL2、CASP3等靶点实现抑制肿瘤生长的目的。结合本实验组的研究成果，消癌解毒方确实在抑制肿瘤生长，提高患者的免疫功能上具有一定的作用。这于本次的网络药理学预测结果形成相互呼应。

综合上述研究，通过网络药理学手段，我们首次从现代生物学的角度解释了消癌解毒方中君药，臣药组成的合理性，科学性。为中医药复方抗肿瘤提供理论支持，为后续研究做铺垫。