基于网络药理学的雷公藤干预IgAN潜在靶点预测及作用机制分析＊

熊 冲，方桂玉，龚彩弟，陈虹彤，赵 辉，王梓霞，陈 萍，钟 建

（1.广西中医药大学研究生学院 广西530000；2.广西中医药大学第一附属医院 广西530001；3.安徽中医药大学研究生学院 安徽230038）

免疫球蛋白A肾病（IgAN）是一种自身免疫疾病，其特征在于半乳糖缺乏的IgA1免疫复合物在肾小球系膜区沉积[1]。它是世界上最常见的原发性肾小球肾炎[2]。高达20-40%的IgAN患者在20年内进展为终末期肾病（ESRD）。其中，5-10%患者的肾功能在5年内迅速恶化。对患者的健康而言，IgAN是一个不可忽视的隐患。且昂贵的免疫抑制剂药物作为IgAN的西医常规治疗内容，长期服用对患者家庭有着较大的负担[3]。

雷公藤是一种卫矛科植物，其主要功效为杀虫、消炎、解毒。雷公藤相对于免疫抑制药物价格较为低廉，且由于中药多靶点、多途径的优势，该药具有的多种有效成分制剂在治疗IgAN中效果明显。雷公藤中的有效成分雷公藤内酯醇具有抗炎、免疫抑制等作用，在减少蛋白尿、抑制肾功能转归方面具有可靠的疗效，因此在免疫性肾损伤疾病方面有广泛应用[4-5]。虽然近年来的多篇文献表明，雷公藤中多种有效成分在干预IgAN疾病进展预后等方面有着显著作用[6-7]，但各项研究对雷公藤有效成分干预IgAN的潜在作用靶点及机制有待商榷。部分研究虽对某一或多个机制深入探讨，但是取得的关联结果较为局限，对雷公藤干预IgAN的有效靶点及机制未能清晰阐明。

为了进一步探寻雷公藤干预IgAN的作用机制，给予雷公藤制剂治疗IgAN临床应用提供证据，运用网络药理学拓扑分析技术，对中药材的活性成分及其作用的靶点基因网络、药物-疾病靶点相互作用（PPI）网络等多层次多网络的构建，探索雷公藤有效成分作用于IgAN靶点之间的关联性网络，契合中医药作用的整体性、复杂性和系统性的特点。本文借助中药系统药理学技术平台（TCMSP）结合GeneCards、OMIM疾病靶点数据库，通过构建雷公藤-活性成分-作用靶点-IgAN疾病网络相互映射来挖掘雷公藤治疗IgAN疾病的作用靶点，利用DAVID数据库进行GO生物功能富集分析和KEGG代谢通路分析，探索雷公藤干预IgAN的作用机制及代谢通路研究，为雷公藤药效物质治疗和干预IgAN发病机制的研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 雷公藤重要活性成分筛选及靶点基因的预测

使用TCMSP平台（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集雷公藤的主要活性成分，对成分药物动力学(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME)参数进行设置以筛选出在人体内生物活性较高的成分，筛选条件为：药物相似性（drug likeness，DL）>0.18，口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）>30，氢键给体（hydrogen bond donors，Hdon）≤5，氢键受体（hydrogen bond acceptors，Hacc）≤10。根据筛选的活性成分，从TCMSP平台的“Targets Infomation”中获取该成分作用的靶蛋白名（target name=protein names），剔除其中没有对应靶点蛋白的活性成分，利用UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库对TCMSP平台中采集到的靶点信息进行规范化处理，然后将每种蛋白名称输入其中，得到对应的靶点基因名称。

1.2 构建与分析活性成分-预测靶点网络

利用网络可视化软件Cytoscape 3.7.0构建雷公藤的活性成分-作用靶点网络，并通过network analyzer插件对该网络的拓扑学特征进行分析。在网络中，活性成分与靶点基因由节点（node）来表示，节点之间相连的为边（edge）。基于网络中节点拓扑结构特征值“自由度(degree)”与最大自由度筛选核心网络，筛选出雷公藤中发挥治疗作用的重要活性成分，其中自由度越大，则说明介入的生物功能越多，生物学重要性权重越大。

1.3 IgAN相关靶点基因的收集

以“IgA nephropathy”为关键词，分别检索GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（http://omim.org/）获得IgAN疾病有关的靶点基因信息，通过相关性得分（Relevance score）≥4筛选与IgAN关联性较高的靶点基因，将两个数据库获取的靶点基因进行合并。

1.4 治疗IgAN靶点的预测及构建与分析药物-活性成分-靶点-疾病网络

选用Rx64 3.5.3软件中的venn Diagram插件将雷公藤预测的相关靶点映射到IgAN相关靶点中，重叠的基因部分即可以预测为雷公藤成分治疗IgAN的作用靶点，通过STRING对雷公藤治疗IgAN相关靶点进行PPI网络分析。为了进一步可视化呈现雷公藤活性化合物使用Cytoscape3.7.0软件构建雷公藤-成分-靶点-疾病网络。借用network analyzer插件计算该网络拓扑参数，包括自由度、介数。例如靶点的自由度越大，表明与其相关的生物功能越多，所以生物学重要性占比更大；介数值与节点在网络中的重要性呈正相关。

1.5 相关靶点基因功能分析及通路分析

通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对“1.4”结果中的预测靶点予以基因本体（GO）生物过程分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢通路分析。使用GraphPad Prism 8.0软件对生物过程及利用OmicShare数据库（http://www.omicshare.com）对代谢通路均进行可视化。

2 结果

2.1 雷公藤的重要活性成分及对应的靶点基因

通过在TCMSP平台检索中输入雷公藤，共检索到已报导的雷公藤有效成分共144个。依据设置的筛选条件，共获得预测的活性成分42个，见表1。其中剔除没有对应靶点蛋白14个，剩余预测活性成分28个，并对各预测的活性成分进行编号（MOL ID）。通过TCMSP数据库中的靶点预测模型获得的上述活性成分的作用靶点蛋白，利用UniProt数据库得到对应的靶点基因名称，并获得靶点-成分关系对。

表1 雷公藤的预测活性成分

2.2 IgA肾病相关靶点收集

从GeneCards数据库中获取330条与IgAN相关的靶点信息、OMIM数据库中获取10条IgAN相关的靶点信息，合并2个数据库数据并且运用EXCEL剔除重复靶点基因，结果共检索出333个相关基因信息，见表2。

2.3 雷公藤重要活性成分-靶点基因网络构建与分析

雷公藤活性成分-靶点基因网络由150个节点组成，由28个雷公藤成分节点和122个靶点基因节点，图中28个绿色三角形节点表示雷公藤活性成分节点，图中红色椭圆形122节点表示靶点基因节点，节点间的边表示活性成分与靶点基因之间的相互作用关系，最大自由度值51，最小自由度值1，平均自由度4.973，结果见图1。根据最大自由度与平均自由度之间的值筛选核心成分-靶点基因网络，结果见图2，筛选出的核心成分按最大自由度由大到小筛选分别为：山奈酚（51）、雷公藤内酯醇（31）、川陈皮素（27）、豆甾醇（26）、β-谷甾醇（26）、雷藤二萜酸B（21）、雷公藤素B（18）、雷公藤萜烯（17）、胰托酚酸盐（17）、常春藤皂苷（16）、81827-74-9（16）、（2R，3R，4S）-4-（4-羟基-3-甲氧基-苯基）-7-甲氧基-2,3-二甲基-四氢萘-6-醇（14）、（1R，4AR，10AS）-5-羟基-1-（羟甲基）-7-异丙基-8-甲氧基-1,4a-二甲基-4,9,10,10a-四氢-3H-菲仑-2-酮（14）、雷公藤内酯（13）、异黄花蒿醇（12）、5,8-二羟基-7-（4-羟基-5-甲基-香豆素-3）-香豆素（12）、雷藤二萜酸（10）、浙贝素（6）、40957-99-1（6）、3,3'-双-（3,4-二氢-4-羟基-6-甲氧基）-2H-1-苯并吡喃（5）。

表2 IgAN疾病相关靶点

2.4 药物活性成分-靶点-疾病（IgAN）的PPI网络构建与分析

通过Rx64 3.5.3软件映射出药物与疾病相互作用的靶点交集，交集的靶点可能为雷公藤治疗IgAN的预测靶点，用韦恩图表示，如图3，得到共同靶点数26个。将作用的预测靶点导入String数据库，经过数据库运行获得靶点相互作用网络图（PPI），如图4，图中有26个节点，200条边，平均节点度为15.4，平均局部聚类系数为0.773。图示说明雷公藤的活性成分作用于多个靶点基因，且各个靶点之间相互作用、协同起效。

2.5 药物-活性成分-靶点-疾病网络的构建与分析

借用Cytoscape 3.7.0软件对该网络进行分析和可视化处理，利用软件中的Network Analyzer插件分析其节点的网络拓扑学特征，根据其自由度（Degree）、介数（Betweenness Centrality）等网络拓扑特征值。筛选网络中的核心靶点基因。“药物-活性成分-靶点-疾病”网络由37个节点组成，由9个雷公藤活性成分节点、26个靶点节点、1个疾病节点和1个药物节点组成，黄色椭圆形代表活性成分节点，紫色菱形代表蛋白靶点节点。这里的26个靶点节点既是雷公藤成分作用靶点，亦是IgAN疾病发生相互作用的靶点。见图5。网络分析表明，雷公藤内酯醇自由度为12，介数为0.110211，预测为雷公藤治疗IgAN中发挥的重要成分，其次为山奈酚（自由度为11、介数为0.08184897）、川陈皮素（自由度为7、介数为0.03074641）等。PPARG为活性成分中7个活性成分的共有目标靶点，因此可以认为PPARG是雷公藤治疗IgAN的最重要靶点，其余NOS2、CASP9、CASP3等亦为相对重要靶点，见表3。

图1 雷公藤活性成分-靶点基因网络图

图2 雷公藤活性成分-靶点基因核心网络图紫色代表活性成分蓝色代表靶点

图3 韦恩图Disease:IgAN相关靶点Drug:雷公藤作用靶点

2.6 相关作用靶点基因功能分析及通路分析

通过David数据库对活性成分-疾病相互作用的26个关键靶点分别从生物过程（Bioprocess）、分子功能（Molecular Function）、细胞成分（Cell Component）3个水平进行分析，设置P<0.05，筛选出具有统计学意义的生物学过程，进行生物学过程分析，使用GraphPad Prism 8.0.1软件将这些条目做成可视化条形图，如图6。对GO富集的生物学过程进行分析，预测靶点在生物过程（BP）中一共获得20个条目，在分子功能（MF）中一共获得12个条目，细胞成分（CC）中一共获得13个条目。

对雷公藤作用于IgAN的26个关键靶点进行KEGG代谢通路分析，设置P<0.05，筛选出具有统计学意义的代谢通路，得到通路共50条，借用OmicShare软件进行可视化分析（通路条目过多，取靠前的30条通路，其中6条通路与IgAN发生及发展相关，如图7。

图4 药物-疾病靶点相互作用网络图（PPI）

图5 药物（雷公藤）-活性成分-靶点-疾病（IgAN）的网络

表3 雷公藤作用IgAN重要活性成分及相关作用靶点自由度和介数

3 讨论

目前IgAN的发病机制尚不明确，有研究[8]表明IgAN发病过程主要与自身免疫失调、机体感染（特别是上呼吸道感染）或遗传易感性等方面密切相关，并且IgA1分子异常糖基化[9]和免疫复合物系膜沉积导致的补体激活，激发免疫炎症[10]反应加剧了IgAN的临床表现。近年来，多项研究证实了雷公藤的多种成分具有抗氧化、抗炎、免疫抑制及抗增殖等作用[11]，但雷公藤成分改善IgAN理化指标的潜在机制研究较少或不足以系统阐述生物过程及代谢通路。本研究通过“药物-活性成分-作用靶点-疾病”网络的构建、拓扑学参数分析以及基因功能和通路的信息开发对雷公藤治疗IgAN的活性成分、潜在靶点、生物功能以及分子机制进行了剖析。

本研究结果表明雷公藤中环氧二萜内酯（雷公藤内酯醇）、黄酮类（山奈酚、川陈皮素、异蛇麻素）、甾醇类（β-谷甾醇、谷甾醇）、香豆素衍生物（（5,8-二羟基-7-（4-羟基-5-甲基-香豆素-3）-香豆素）等化合物显示了治疗IgAN的潜在活性。同时研究中剖析出的122个预测靶标中，26个是多个活性化合物的共同靶标，其中自由度最高的靶标为PPARG、NOS2、CASP3、CASP9、AKR1B，同时表明它们可能是雷公藤干预IgAN的关键靶点。通过String软件可视化显示IgAN靶点蛋白与化合物有着直接或间接作用的关系，并且大部分成分均能直接作用于PPARG这个靶点上而发挥关键治疗作用，同时也与其他主要靶点相互作用共同干预IgAN进展。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARG）是一种已被证明是配体激活且同时可调节自噬信号的受体，而自噬本身就是一种抗炎机制，而晚期糖基化终末产物AGEs可以通过增加炎症介质水平从而下调PPARG[12]，研究[13]显示AGEs受体（RAGE）的表达引发IL-1，IL-6，TNF-α和MMP-13的表达,炎症细胞因子似乎突出下调PPARG。

图6 基因功能（GO）分析BP：生物过程MF：分子功能CC：细胞成分

本研究通过KEGG通路分析及靶点基因GO功能分析以进一步探讨雷公藤治疗IgAN的潜在通路及作用机制，结果显示这些靶点涉及的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞成分（CC）相关信息。如图6所示，P值（PValue）<0.05的20个生物过程中，排名靠前如凋亡过程的负调节、对脂多糖的反应、炎症反应、对缺氧的反应、蛋白磷酸化的正调控、免疫反应的调节、免疫应答等过程，可通过减少氧化应激反应、炎症反应及调控免疫反应的产生与进展等方式，最终影响IgAN疾病的发生与转归；在P值（PValue）<0.05的12个分子功能中，其中IgAN发病相关的功能有细胞因子活性、半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程、死亡受体结合、转录调控区DNA结合等，干预方式主要涉及IgAN病程中的炎症反应、细胞免疫调节等因素；在P值（PValue）<0.05的13个细胞成分中，与IgAN病程密切相关的细胞成分有细胞外空间、质膜外侧、膜筏、细胞表面、细胞外外泌体、细胞质的核周区域、死亡诱导信号复合体、细胞质、细胞内膜结合细胞器、RNA聚合酶II转录因子复合物，这些细胞成分可能参与了炎症反应，氧化应激及体液免疫等过程，同时表明雷公藤可能是通过作用在这些生物过程从而干预IgAN以达到治疗的目的；同时对雷公藤干预IgAN相关的26个靶点进行KEGG代谢通路分析，结果如图7所示。在可视化的30条通路中，与IgAN的病程密切相关的可能是TNF信号通路、HIT-1信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路及NF-κB信号通路这6条，其中雷公藤作用于TNF信号通路干预IgAN病程的显著性最大，可能是因为该通路是雷公藤干预IgAN疾病过程中的重要通路，该通路可介入各种信号的传导，主要是通过调节细胞凋亡或控制炎症反应以释放IL-4、IL-2等促炎因子和NO等炎症介质，造成炎症反应与激活更多的炎症基因，造成IgAN的补体系统的激活，最后通过旁路途径和凝集素途径导致对IgAN的肾损伤[14-17]。

图7 KEGG代谢通路富集分析高级气泡图（取排名前30）

同时本研究显示HIF-1信号通路的表达与IgAN发生及发展密切相关，其很有可能就是雷公藤通过干预HIF-1信号通路的表达实现抗氧化作用。Tanaka T等人的研究[18]表明肾小管间质缺血或缺氧被认为是肾纤维化发生的关键微环境因子。介导应答的分子机制ES对缺氧的作用是复杂的，其中缺氧诱导因子(HIF)起着关键作用，HIF表达与细胞外基质增多呈正相关，从而加快了肾间质纤维化的进程[19]。JAK-STAT通路是细胞间信号传导的主要通道之一，也是代表细胞因子信息内传导的重要通路之一[20]。蔡婷等人[21]通过构建IgAN模型肾组织，发现JAK2、STAT3的表达显著上调，尤以肾小管间质中为甚，在使用雷公藤后，二者的表达明显下降，因此猜测JAK-STAT信号通路极大概率参与IgAN肾组织损伤，以肾小管间质损伤为主，雷公藤通过干预JAK-STAT信号通路对IgAN的肾小管间质进行保护。陈明喆[22]通过降低JAK-STAT信号通路中IgAN大鼠模型肾脏组织的蛋白STAT3表达，发现IgAN大鼠肾功能具有显著的改善作用，可能是由于降低蛋白STAT3表达，使机体抗氧化能力得以提高。Hye-Ju Han等[23]构建TCRδ-/-小鼠实验发现T细胞可以控制体液免疫反应，T细胞具有重要的调节功能，尤其是对维持正常黏膜和全身IgA反应有重要作用。Toll样受体是直接参与与炎症反应相关的慢性肾病的单个跨膜非催化性蛋白质，在人类中，Toll样受体在多种细胞类型上表达，包括肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，TLR4已被证实与系膜细胞损伤和肾纤维化有关[24-26]。哺乳动物核因子NF-κB信号通路是细胞内的基本转录因子系统，是针对各种诱导的细胞外刺激来源[27]。NF-κB的指标激活是二聚体Rel蛋白8的核转位，它调节许多涉及NF-κB依赖性基因，包括炎症，免疫，细胞凋亡，细胞增殖和分化。有研究[28]显示mi R-21的低表达可能会使p65磷酸化达到激活NF-κB通路以此增强IgAN病理的炎性反应。综上所述，雷公藤可能通过干预诱导炎症发生的关键靶点基因的转录和表达、阻断促肾间质损伤信号的传导、减少氧化应激反应的产生及调控免疫反应等方面实现改善IgAN发生发展过程的作用。

本研究通过网络拓扑学分析和大数据挖掘的联合使用，建立了“雷公藤-活性成分-靶点-IgAN”关系网络，紧接着使用DAVID数据库进行基因功能（GO）富集分析及KEGG代谢通路富集分析，最后预测了雷公藤干预IgAN的关键靶点及其相关作用机制，这将为雷公藤治疗IgAN的药效活性成分、探讨相关谱效、作用机制原理及生物评价相应指标的筛选等探索提供理论依据，为雷公藤治疗IgAN的机制研究提供了科学依据与实用方法，为接下来进一步的机制探讨提供了理论基础。