基于网络药理学的枳术丸调治血脂异常的分子机制研究＊

但文超，何庆勇＊＊，曲 艺，李安琪，郭建波，丁宇坤

（1.中国中医科学院广安门医院 北京100053；2.北京中医药大学研究生院 北京100029）

血脂异常是临床常见的代谢性疾病之一，是心血管疾病发生的高危因素[1]。中国成人总体血脂异常患病率高达40.40%[2]，但我国成人血脂异常患者的知晓率和治疗率仍处于较低水平。目前美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的7种他汀类药物虽然可以降低大多数患者低密度脂蛋白胆固醇（Low Density Lipoprotein Chesterol，LDL-C）水平，但部分患者对他汀类药物仍存在不耐受，依从性低或耐药的情况，从而导致预后不良[3]。

中药复方调治血脂异常的优势不可小觑，其调治机制具有靶点多位、层次丰富、疗效稳固、安全性高等特点，尤其是在改善症状方面拥有极大潜力。网络药理学是医学、生物学、计算机科学、生物信息学等多学科基础理论与研究手段整合的结果，能够系统综合地反映药物对疾病网络的干预机制。这与中医药论治的整体动态性原则及复方多成分、多靶点、多途径互相作用的特点有很强的趋同性。所以网络药理学可为中药复方作用机制研究提供崭新的、强有力的技术支持，这有助于揭示中药复方科学内涵、发现药物靶标、指导中药新药研发、传承和发展中医药理论[4]。

为此，本研究采用网络药理学方法，从枳术丸的物质基础出发，着眼于整体角度分析枳术丸调治血脂异常的分子机制，同时为后续研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 枳术丸相关靶点筛选

通过中医药系统药理学平台[5]寻找3味中药化学组成成分，根据口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的2个ADME属性值进行活性成分初步筛选以获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点，并根据已发表的文献报道补充未预测到的活性化合物的已知靶点。筛选结束后，为标准化蛋白质靶点信息，统一在Uniprot蛋白质数据库（https://www.uniprot.org）将化合物作用的蛋白质靶点进行规范。

1.2 血脂异常相关靶点筛选

以“hyperlipidemia”、“hypercholesterolemia”“hypertriglyceridemia”等与血脂异常相关的疾病为关键词，挖掘GeneCards数据库（https://www.genecards.org）、OMIM数据库（http://www.omim.org）、TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)中调治血脂异常的潜在靶点，进入DRUGBANK数据库（https://www.drugbank.ca）寻找调治血脂异常的临床一线西药作用靶点予以补充[6]。在Genecards数据库中，Score值越高则代表该靶点与疾病联系密切。根据经验，若靶点过多则设定Score大于中位数的目标靶点为血脂异常的潜在靶点，合并4个疾病数据库靶点后，删除重复值得到血脂异常靶点。

1.3 枳术丸成分-血脂异常靶点PPI网络构建

为明晰枳术丸药物相关靶点与血脂异常靶点间的相互作用，利用R语言将二者靶点取交集并绘制韦恩图。进而将交集靶点提交至STRING11.0数据库(https://string-db.org)构建蛋白互作（PPI）网络模型[7]，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”（>0.9），其余设置均为默认设置，得到PPI网络，并通过CytoScape3.7.1中的MCODE插件对PPI网络进一步分析，得到潜在蛋白质功能模块，并通过分析其参与的生物学进程对其功能进行描述。

1.4 枳术丸成分-血脂异常靶点功能与通路的富集分析

Metascape平台（http://metascape.org/gp/index.html）拥有全面的注释功能并且每月更新基因注释的数据资料[8-9]。将枳术丸调治血脂异常的靶点录入Metascape平台，设置P<0.01，分析其主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析，保存数据结果并采用Origin Lab 2018对数据进行可视化[10]。

1.5 枳术丸成分-血脂异常靶点-通路网络图的构建

运用CytoScape3.7.1构建枳术丸成分-血脂异常靶点-通路网络图，利用CytoScape3.7.1内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、介度（Betweenness）及紧密度（Closenesss）等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.6 分子对接验证

分析得到枳术丸成分-血脂异常靶点网络图中度值排名前4的靶点，查找其PDB ID，登入Systems Dock Web Site（http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）将4个靶点与枳术丸活性成分进行对接[11]，根据Docking Score值评价靶点与活性化合物的结合强度与活性。

2 结果

2.1 枳术丸活性成分靶点的获取

初步提取白术化学成分55种、枳实化学成分65种、荷叶化学成分93种，经ADME筛选后共获得白术4种、荷叶14种、枳实17种活性成分，包括山柰酚、槲皮素、柚皮素、木犀草素等，见表1。白术成分作用靶点19个、荷叶成分作用靶点103个、枳实成分63个，合并后删除重复值共得到靶点116个。

2.2 血脂异常相关靶点的获取

从Genecards数据库获得高胆固醇血症靶点1087个、高甘油三酯血症靶点1021个、高血脂症靶点1130个。根据经验设定Score大于中位数的目标靶点为血脂异常的潜在靶点，如通过GeneCards所得高血脂症靶点Score最大值为203.52，最小值为0.02，中位数为2.58，故设定Score>2.58的靶点为高血脂症的潜在靶点。结合OMIM、TTD、DRUGBANK数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到1219个血脂异常相关靶点。

表1 枳术丸主要成分

2.3 枳术丸成分-血脂异常靶点PPI网络的构建

将筛选的枳术丸活性成分靶点与血脂异常疾病靶点取交集，并通过R语言绘制韦恩图，得到枳术丸成分-血脂异常共同靶点60个，见图1。进而将靶点提交至STRING11.0平台，得到枳术丸靶点PPI网络，见图2。

由于PPI网络中蛋白的作用的是相互的，所以通常归为无向图。PPI复杂网络中存在部分密度较高的区域称为community或module。module内部的网络是PPI网络的潜在子网，子网连线密度较高，区域部分连线少，因此module被认为是具有生物学意义的集合，该集合有2种含义，一为蛋白质复合体（protein complex），即多个蛋白质共同组成复合体而后发挥生物学作用；一为功能模块（functional module），如位于同一通路的蛋白质，其相互作用更加密切[12]。故为更精确地分析枳术丸治疗血脂异常的作用机制，在得到枳术丸PPI网络后，有必要进一步识别其内在module。

得到PPI网络后，运用CytoScape3.7.1中的MCODE插件，通过分子复合物检测算法对相互作用关系进行分析，得到module，见图3。根据P值,分别保留PPI网络与Module中3个最佳评分的生物学进程对其进行功能描述，见表2。

图1 枳术丸成分-血脂异常靶点韦恩图

图2 枳术丸-血脂异常靶点PPI网络

表2 枳术丸-血脂异常靶点PPI网络功能描述

2.4 靶点功能与通路的富集分析

应用Metascape数据平台对枳术丸调治血脂异常相关靶点进行信号通路分析，借助Origin Lab 2018对结果可视化。由结果可见多个靶点的功能与血脂异常的产生密不可分。枳术丸主要参与的生物学过程包括生物对营养元素的应答过程（response to nutrient levels）、类固醇代谢进程（steroid metabolic process）、生长调控（regulation of growth）、肌细胞增殖（muscle cellproliferation）、对脂多糖的应答（response tolipopolysaccharide）、细胞对脂质的应答（cellular response to lipid），见图4（A），参与的通路主要有AGERAGE信号通路、HIF-1信号通路以及脂肪细胞中脂肪分解的通路等，见图4（D），靶点通路富集结果见表3。

相关靶点调节血脂的功能主要富集于类固醇激素受体活动（steroid hormone receptor activity）、辅因子结合（cofactor binding）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸结合（NADP binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding）、丝氨酸水解酶活动（serine hydrolase activity），生长因子的结合（growth factor receptor binding）等，见图4（B）。

2.5 枳术丸成分-血脂异常靶点-通路网络图的构建

运用CytoScape3.7.1构建枳术丸成分-血脂异常靶点-通路网络，见图5。通过CytoScape3.7.1内置的NetworkAnalyzer分析枳术丸治疗血脂异常网络拓扑学参数，得到核心成分及核心作用靶点。

图3 枳术丸-血脂异常靶点PPI网络中的module

图4 枳术丸主要成分潜在靶点的富集分析

Cytoscape网络分析表明，槲皮素连接度（Degree）为46，介度（BetweennessCentrality）为0.4343，紧密度（ClosenessCentrality）为0.5879，预测槲皮素为枳术丸治疗血脂异常的主要成分，其次为山柰酚（连接度为21，介度为0.0690，紧密度为0.4512）、木犀草素（连接度为20，介度为0.0792，紧密度为0.4470）柚皮素（连接度为16，介度为0.1040，紧密度为0.4311），见表4。

ESR1在网络中的连接度为35，介度为0.1688，紧密度为0.6101，预测ESR1为枳术丸调治血脂异常的最主要靶点。PPARG、NOS2、ESR2、PTGS2、PTGS1、MAPK14、ACHE、ADRB2、F7亦为相对重要的靶点，见表3。

2.6 分子对接验证

分子对接网站SystemsDock可在复杂网络基础上，通过对接模拟和分子通路图分析配体选择性和配体动作，进而根据其综合特征以评估蛋白质−配体结合潜能。分子对接所得结果示Docking Score≥7的有12种（8.6%），介于5-7的有77种（55%），介于4.25-5的有30种（21.4%），小于4.25的有21种（15%），其中枳术丸调治血脂异常的主要活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素等与4个靶点的结合活性均较强。Docking Score大于4.25时表示活性成分与靶点间存在结合能力，大于5.0时表示结合活性较佳，大于7.0时表示结合活性极佳[13]，结果表示评分大于4.25者占总数85%，大于5的占63.6%即大部分靶点与成分的结合活性较好，分子对接结果见图6。

表3 枳术丸调治血脂异常靶点通路富集结果

图5 枳术丸成分-血脂异常靶点-通路网络图

表4 枳术丸主要活性成分网络节点特征参数

表5 枳术丸主要活性成分靶点网络节点特征参数

3 讨论

血脂异常是较为常见的代谢性疾病，亦是目前公认的动脉粥样硬化的高危因素。中药复方调治血脂异常的疗效不劣于甚至优于临床一线西药对照，尤其是在改善症状方面拥有极大潜力。吴立华[14]等通过临床试验证明对于原发性高血脂症患者，服用氟伐他汀加枳实胶囊比单纯服用氟伐他汀疗效显著，万勇等[15]通过随机双盲对照研究证实荷叶降脂颗粒可降低甘油三脂水平，尤其在改善临床症状方面效果较佳。乔羽等[16]通过对中药荷叶制剂干预脂代谢的有效性进行Meta分析和对安全性进行评价，结果显示在血脂干预常规治疗基础上，联合使用中药荷叶相关制剂可有一定的调脂减肥效应，且安全性良好。动物试验亦表明枳实[17]可降低高血脂模型SD大鼠血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量。白术精提物能有效调节高脂大鼠血脂紊乱，尤其对升高HDL-C有显著疗效[18]，中、高剂量荷叶水提物均可使脂肪细胞leptin蛋白表达下调和leptin的mRNA水平下降[19]。

在血脂异常的临床研究中，吴海芳等通过多中心收集1019例血脂异常患者病例资料，认为血脂异常的核心脏腑病位在脾，病性实则以血瘀、痰浊为主,虚则以气虚、脾虚为主[20]。尹湘君等通过分析1975年至2015年CNKI发表的文献,发现近10年血脂异常证候要素靶位以脾为多，病因以气虚为主[21]。根据对中医经典理论的探讨并结合临床经验，本课题组认为血脂异常的主要病机为“脾失运化，浊滞血脉”，病位在脾[22]，采用运脾化浊法治疗血脂异常，可以使患者“脾主运化，主转枢”功能恢复，血脉中浊邪消除，从而取得良好的临床疗效。枳术丸出自李东垣所著《脾胃论》，为健脾消积之经典名方。方中白术补脾家之元气，枳实行气消积、化痰除痞，荷叶升发清阳，三药相伍，健运脾气，消补兼施，祛浊升清，契合运脾化浊之法。

本研究通过网络药理学方法初步筛选出枳术丸调治血脂异常的活性成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素等。血脂调节机制的相关基础研究表明，槲皮素能以浓度依赖的方式显著增强巨噬细胞中胆固醇外流与ABCA1 mRNA及其蛋白质的表达[23]，并且可能通过SCAP-SREBP2-LDLr信号通路改善脂质代谢[24]。山柰酚可增强脂肪分解并对抗高脂肪酸及受损葡萄糖的摄取、糖原合成、AMPK活性以及葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的表达[25]，木犀草素能借助AMP活化蛋白激酶（AMPK）-Sirtuin（SIRT）1信号传导降低THP-1细胞衍生的巨噬细胞中总胆固醇水平，同时抑制巨噬细胞趋化因子和炎性细胞因子表达[26]，柚皮素可抑制脂肪生成并降低脂肪细胞中胰岛素敏感性和脂联素的表达[27]。分子对接验证结果亦表明，槲皮素、山柰酚、木犀草素及柚皮素与主要靶点（ESR1，ESR2，NOS2，PPARG）的结合活性较强，因此枳术丸可能主要通过槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素等调治血脂异常。

图6 分子对接结果

本研究结果表明，枳术丸调治血脂异常的靶点主要集中在ESR1，而PPARG亦为重要靶点之一。血管内皮生长因子A（VEGFA）是调节脂肪组织中血管生成的关键因子，而ESR1基因敲除的雌性小鼠腹股沟和性腺白色脂肪组织中VEGFA表达较低[28]，这是ESR1在调节脂肪组织VEGFA中的重要作用的证据之一，而核激素受体PPARγ（PPARG）促进脂肪生成和巨噬细胞分化，是脂肪形成的关键调节因子，是主调节器[29]。枳术丸调治血脂异常的通路主要有AGERAGE信号通路（hsa04933）、HIF-1信号通路（hsa04066）以及脂肪细胞中脂肪分解的通路（hsa04923）。高脂肪、高糖饮食以及食用油炸、烤制食物会增强AGEs的产生和积累[30]。apo-脂蛋白B（apo-B）是LDL大分子的表面蛋白，apo-B的糖化反应可影响脂肪的生成。糖化应激通过AGEs与RAGE的结合诱导炎症和氧化应激。有学者发现AGE-RAGE可介导高胆固醇血症引起的动脉粥样硬化等多种病变，并且sRAGE水平与HDL呈正相关[31]，而HIF-1信号通路可通过抑制长链酰基辅酶A脱氢酶与中链酰基辅酶A脱氢酶抑制脂肪酸的分解代谢，从而导致活性氧的减少和脂肪积累[32]。故推测枳术丸可能通过抑制HIF-1信号通路从而降低脂肪的产生。

研究结果表明枳术丸的同一化合物可调控不同靶点，而同一靶点可干预不同的生物学过程及信号通路，体现了枳术丸多通路、多靶点联合作用的特点。这提示通过调控网络中的单个或多个重要靶点即可对整个网络进行调节，为临床运用枳术丸治疗血脂异常提供了科学依据，为后续审定枳术丸临床疗效评价指标提示了标的，也为发掘枳术丸的潜在作用机制提供了新的方向。但限于网络药理学方法论的局限性以及中药组分在煎煮时发生化学反应的复杂性，本研究未将枳术丸煎煮后的化学成分以及枳术丸活性成分在体内的代谢物纳入分析。本研究主要是以生物信息学与海量数据计算的结果为基础，后续将在此基础进一步筛选与动物或细胞实验验证，进而明晰枳术丸的主要调控靶点。