不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠的药效学对比研究＊

时间：2024-07-28

李嘉萌，杨容芳，余丰君，冯淬灵，王晶＊＊

（1.北京中医药大学中药学院北京100029；2.北京大学人民医院北京100044）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以持续气流受限为特征的呼吸系统疾病，其主要特征为进行性的气流受限。全球疾病负担研究（the Global Burden of Disease Study）报告指出，2016年全球有2.51亿例COPD病例。2015年，全球估计有317万人死于COPD，相当于同年全世界所有死亡人口的5%[1]。COPD患者最常见的症状是呼吸急促、慢性咳嗽和痰（粘液）多。患者可发生小气道重塑，气道黏膜上皮细胞增生，纤毛上皮异常，管壁杯状细胞增多，细胞外基质沉积，平滑肌增厚纤维化等[2]。其危险因素有吸烟、空气污染、呼吸系统感染等[3]。研究表明，吸烟是COPD的主要致病原因，且远远超过其他危险因素。因此，COPD的发病机制与香烟烟雾暴露对肺的影响密切相关[4]。COPD在发病过程中病理生理学改变是个体与其环境相互作用的结果。这些作用机制主要包括炎症反应、氧化应激[5]、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、修复异常等。慢性炎症反应进而会导致呼吸道黏液分泌过多，气道重塑以及肺泡破坏，因此近年来被认为是COPD主要的发病机制。

芪蛭益肺颗粒由益气活血化痰基本方得来，为东直门医院院内制剂，全方以黄芪、水蛭为君药，主要针对COPD稳定期气虚血瘀痰阻根本病机。此药临床应用二十余年，疗效确切，治疗稳定期COPD在本领域属于先行者，样本量及基础研究工作均有优势[6,7]。

《医学源流论》中记载道：“煎药之法，最宜深讲，药之效不效，全在乎此[8]。”中药复方全方水提工艺与传统中药的使用方式最为接近，但缺点在于在提取有效成分的同时，许多多糖、鞣质、水溶性杂质等与治疗作用不相关的成分也被提出，导致患者在用药过程中服用量较大。中药复方全方水提醇沉工艺是在全方水提工艺的基础上加入乙醇，在提取的同时起到了进一步精制的作用，为减少药物用量提供了基础。因此，中药复方全方水提醇沉工艺相比于全方水提工艺或更有优势[9]。然而，采用全方水提醇沉工艺制备的中药颗粒剂与全方水提工艺得到的颗粒剂在药效上是否一致目前还未完全明确，且因复方颗粒中所含药物的成分不同而不同。为了筛选出药效学作用更佳的制备工艺，本实验对芪蛭益肺颗粒的全方水提和全方水提醇沉工艺进行了药效学的比较研究，为其临床治疗和新药开发提供依据，使其发挥更大的生物学效应。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立与分组

SPF级Wistar大鼠126只，雌56只，雄70只，鼠龄8周，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK（京）2014-0006。适应性喂养3 d后开始实验。其中23只为空白组，其余103只大鼠用于造模。使用香烟烟雾暴露复合气道滴入LPS的方法建立COPD大鼠模型。采用自制烟熏箱烟熏大鼠，每次点燃大前门牌香烟8支，每次烟熏10只大鼠，香烟烟雾暴露28 d，每日上午1次，每次30 min；用生理盐水将LPS粉末配制成浓度为1 mg·mL-1的溶液，LPS以200μL/只的剂量分别于第1、11、21 d由气道内滴入，滴药日不熏烟。造模第21 d分别从空白对照大鼠及造模大鼠中各取7只雄性大鼠，测定肺功能各指标：MVV、FVC、FEV25-75%、FEV0.3/FVC%，进行给药前模型复制成功鉴定。将剩余模型大鼠随机分为模型组、罗红霉素组（0.03 g·kg-1）、工艺1大剂量组（临床等效剂量，9.10 g·kg-1）、工艺1小剂量组（1/2临床等效剂量，4.55 g·kg-1）、工艺2大剂量组（临床等效剂量，9.10 g·kg-1）、工艺2小剂量组（1/2临床等效剂量，4.55 g·kg-1），每组16只，雌雄各半。实验第21 d起，模型组及空白组每日以1 mL/100 g常水灌胃一次，给药组大鼠每日以1 mL/100 g灌胃给予相应药物一次，连续给药40 d。

1.2 主要试剂与药品

工艺1全方水提芪蛭益肺颗粒（北京中医药大学中药制剂系，出膏率36%）；工艺2全方水提醇沉芪蛭益肺颗粒（北京中医药大学中药制剂系，出膏率16%）；罗红霉素胶囊（江苏扬子江药业集团公司，批准文号H10970292）；LPS（美国Sigma公司，L2880），戊巴比妥钠（美国Sigma公司，生产批号：201603），大前门香烟（上海烟草公司，烤烟型，焦油量12 mg，烟气烟碱量0.9 mg，烟气一氧化碳量14 mg）。

表1 烟熏复合气道滴注LPS造模法对COPD模型大鼠肺功能的影响（雄；±S；n=7）

注：与空白组相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。

组别空白模型剂量/（g·kg-1）__MVV/mL 121.010±9.330 107.100±8.930#FVC/mL 19.595±5.490 13.805±2.986#FEV25-75%/（mL·s-1）13.988±2.784 10.361±2.456#FEV0.3/FVC%59.743±9.303 34.110±6.411##

1.3 实验仪器

AniRes2005动物肺功能分析仪（北京贝兰博科技有限公司），漩涡混合器QL-901型（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），GL-21M高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），JA1103N精密天平（上海民桥精密科学仪器有限公司），YP2001N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.4 标本采集

实验第21 d上午给与气道滴注LPS后，于当日下午取模型组和空白组各7只雄性大鼠进行肺功能测定以预判COPD模型大鼠是否造模成功。实验于第61 d取材，用1.5%的戊巴比妥钠以80 mg·kg-1的剂量使大鼠处于深麻状态，依次进行肺功能测定、肺组织取材、肺组织固定等操作。

1.5 检测方法

1.5.1 肺功能测定

待动物处于深麻状态，于颈部钝性剥离出气管，在气管中端剪一V字型小口，插入气管插管，用手术缝合线在气管外结扎，使动物的呼吸通路与体描箱隔离，防止呼吸气体进入体描箱。把动物放在体描箱的支撑板上，将气管插管与体描箱的气路相连，观察到气道压力曲线显示空白后，进行肺功能相关指标测定。

1.5.2 肺指数测定

取出大鼠肺脏，完整分离出气管和双肺，仔细除去周围结缔组织，经生理盐水洗涤后滤纸吸干，电子天平称量整肺湿重，计算肺指数。【肺指数=肺湿重（g）/大鼠体重（g）】

1.5.3 COPD模型大鼠肺组织病理形态学观察

（1）HE染色：

大鼠肺组织经脱水与透明、浸蜡与包埋、切片和烤片、脱蜡染色、中性树胶封片等操作处理后，用光学显微镜对肺组织气道炎症进行观察，并用Image-Pro Plus6.0图片处理软件进行拍片。

（2）AB-PAS染色：

按照AB-PAS染色试剂盒进行操作。大鼠肺组织经脱蜡、阿利新蓝染色液染色、蒸馏水洗、过碘酸溶液氧化、Schiff Reagent浸染、苏木素染色液染核、酸性分化液分化、Scott蓝化液返蓝、常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固等操作处理后，采用光学显微镜对大鼠肺组织气道纤毛上的杯状细胞进行观察，并拍照，从左至右连续选取三条完整的纤毛，用Image-Pro Plus6.0对杯状细胞数目进行统计。

1.6 统计学方法

2 实验结果

2.1 烟熏复合气道滴注LPS造模法对COPD模型大鼠肺功能的影响

实验结果见表1。与空白组相比较，模型组MVV、FVC、FEF25-75%、FEV0.3/FVC%均具有显著性差异（P<0.05），证明COPD模型大鼠造模成功。

2.2 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠肺功能的影响

实验结果见表2-1及表2-2。与空白组相比较，型组FEV0.3、FEV0.3/FVC%、FEF25-75%、PEF、MVV、Cdyn均显著降低（P<0.01或P<0.05），RL显著升高（P<0.05），表明模型组肺功能出现严重损伤；与模型组相比较，罗红霉素组FVC、FEV0.3/FVC%、PEF、MVV、Cdyn均显著升高（P<0.01或P<0.05），RL、Re显著降低（P<0.01或P<0.05）；与模型组相比较，工艺1大剂量组FEV0.3/FVC%、MVV显著升高（P<0.01），RL显著降低（P<0.01）；与模型组相比较，工艺1小剂量组FEV0.3/FVC%、MVV显著升高（P<0.01），RL显著降低（P<0.01）；与模型组相比较，工艺2大剂量组FEV0.3/FVC%、MVV均显著升高（P<0.01），RL显著降低（P<0.01）；与模型组相比较，工艺2小剂量组FEV0.3/FVC%、MVV、Cdyn均显著升高（P<0.01），RL、Re显著降低（P<0.01或P<0.05），表明给与芪蛭益肺颗粒治疗之后，COPD模型大鼠肺功能出现好转。

表2-1 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠肺功能的影响（±S；n=16）

注：与空白组相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。与模型组相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

组别空白模型罗红霉素工艺1大剂量工艺1小剂量工艺2大剂量工艺2小剂量剂量/（g·kg-1）__0.030 9.100 4.550 9.100 4.550 FVC/mL 13.814±1.033 12.976±1.411 14.190±0.814*13.698±0.984 13.412±1.010 13.329±1.094 13.870±1.419 FEV0.3/mL 8.753±0.954 7.630±0.317##7.959±0.638 7.858±0.492 7.640±0.564 7.647±0.573 7.687±0.451 FEV0.3/FVC%/%66.326±6.684 56.508±1.342##59.347±2.933**59.333±3.107**59.544±1.835**60.488±2.705**60.496±2.766**FEV25-75%/（mL·s-1）28.655±3.594 24.752±0.880##25.631±2.726 24.803±2.017 24.654±1.882 24.612±1.823 24.978±1.537 PEF/（mL·s-1）36.408±2.318 33.403±1.709##34.820±2.014*33.479±2.473 33.541±2.178 33.491±1.759 33.830±1.196

表2-2 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠肺功能的影响（±S；n=16）

注：与空白组相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。与模型组相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

组别空白模型罗红霉素工艺1大剂量工艺1小剂量工艺2大剂量工艺2小剂量剂量/（g·kg-1）__0.030 9.100 4.550 9.100 4.550 MVV/mL 240.400±7.601 227.438±8.458##238.800±8.995**239.400±8.569**239.067±10.557**243.309±7.009**241.011±9.608**RL/（cmH2O·s-1·mL-1）0.239±0.036 0.275±0.040#0.211±0.029**0.212±0.022**0.214±0.032**0.212±0.026**0.211±0.042**Re/（cmH2O·s-1·mL-1）0.342±0.044 0.349±0.027 0.331±0.027*0.343±0.038 0.341±0.029 0.340±0.035 0.333±0.031*Cdyn/（mL·cmH2O-1）0.325±0.027 0.305±0.034#0.336±0.023**0.321±0.026 0.321±0.032 0.324±0.025 0.336±0.017**

表3 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠肺指数的影响（±S；n=16）

注：与空白组相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。与模型组相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

组别空白模型罗红霉素工艺1大剂量工艺1小剂量工艺2大剂量工艺2小剂量剂量（g·kg-1）__0.030 9.100 4.550 9.100 4.550肺指数0.004±0.001 0.005±0.001#0.004±0.000*0.005±0.001 0.005±0.001 0.005±0.000 0.004±0.001*

表4 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠肺组织中杯状细胞数目的影响（±S；n=16）

注：与空白组相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。与模型组相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

组别空白模型罗红霉素工艺1大剂量工艺1小剂量工艺2大剂量工艺2小剂量剂量/（g·kg-1）__0.030 9.100 4.550 9.100 4.550杯状细胞数目/个53.100±7.249 62.500±9.265#53.200±8.817*52.100±12.233*54.700±5.208*45.300±12.676**52.800±10.369*

2.3 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠肺指数的影响

实验结果见表3。与空白组相比较，模型组肺指数显著升高（P<0.05），表明模型组肺组织出现损伤；与模型组相比较，罗红霉素组、工艺2小剂量组肺指数显著降低（P<0.05）；与模型组相比较，工艺1大剂量组、工艺1小剂量、工艺2大剂量组肺指数不具有统计学差异（P>0.05）；表明给与芪蛭益肺颗粒干预之后，工艺2小剂量组COPD模型大鼠肺组织出现好转。

2.4 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠肺组织病理形态学的影响

实验结果见图1。HE染色可见，与空白组相比，模型组大鼠气管可见大量炎症细胞浸润，气管纤毛脱落，呈现COPD病理状态。与模型组相比较，罗红霉素组、工艺1和工艺2大、小剂量组大鼠气管周围炎性细胞减少，肺间隔变小，COPD病理过程得到有效缓解。

实验结果见表4、图2。AB-PAS染色可见，与空白组相比较，模型组杯状细胞数目显著升高（P<0.05）；与模型组相比较，罗红霉素组、工艺1大、小剂量组、工艺2大、小剂量组杯状细胞数目显著减少（P<0.01或P<0.05），说明给予芪蛭益肺颗粒能够有效抑制COPD模型组气道杯状细胞化生。

2.5 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠的药效对比

实验结果见表5。与工艺1大剂量相比，工艺2大剂量在杯状细胞数目上表现的更加优效；与工艺1小剂量相比，工艺2小剂量在Re、Cdyn以及肺指数这三个指标上表现更为优效。

图1 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠肺组织的影响（气道；×100；HE染色）

图2 不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠杯状细胞数目的影响（×400；AB-PAS染色）

表5 不同工艺的芪蛭益肺颗粒药效对比表（±S；n=16）

注：与空白组相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。与模型组相比*表示P<0.05，**表示P<0.01。

组别空白模型工艺1大剂量工艺1小剂量工艺2大剂量工艺2小剂量剂量/（g·kg-1）__9.10 4.55 9.10 4.55肺指数0.004±0.001 0.005±0.001#0.005±0.001 0.005±0.001 0.005±0.000 Cdyn/（mL·cmH2O-1）0.325±0.027 0.305±0.034#0.321±0.026 0.321±0.032 0.324±0.025 Re/（cmH2O·s-1·mL-1）0.342±0.044 0.349±0.027 0.343±0.038 0.341±0.029 0.340±0.035杯状细胞数目/个53.100±7.249 62.500±9.265#52.100±12.233*54.700±5.208*0.333±0.031*0.004±0.001*0.336±0.017**RL/（cmH2O·s-1·mL-1）0.239±0.036 0.275±0.040#0.212±0.022**0.214±0.032**0.212±0.026**0.211±0.042**45.300±12.676**52.800±10.369*

3 讨论

在中药复方颗粒的制备过程中，提取是最为重要的环节，有效成分提取是否完全与其治疗效果密切相关。由于中药复方成分的复杂性，如何最大程度地提取其有效成分且尽可能地除去杂质及与治疗作用无关的成分是筛选提取工艺的研究核心。同时，优良的制备工艺也是减小使用剂量、提高临床疗效的基础。中药复方中的无效成分和杂质的分子量较大，在水中多以胶体的形式存在，不仅会影响中药提取液的澄清度，也会增大药物的服用量。水提醇沉法是中药提取液制备中传统的除杂方法，使有效成分提出的同时能达到精制的目的[11]。然而，采用全方水提醇沉工艺制备的中药颗粒剂与全方水提工艺得到的颗粒剂在药效上是否一致甚至治疗效果是否更优目前还未完全明确。因此，为探究不同工艺的芪蛭益肺颗粒对大鼠COPD的治疗作用，本实验采用烟熏复合气道滴注LPS的方法复制大鼠COPD模型，比较不同工艺的芪蛭益肺颗粒对COPD模型大鼠的影响，为该药物的临床应用及新药开发提供依据。

COPD患者的气道疾病表现根据诊断和症状的不同分为慢性支气管炎和支气管扩张[12]，其主要特征是进行性的气流受限[13]。判断气流受限的重复性较好的重要指标之一是肺功能检查，其对COPD发病的早期明确诊断、病况严重程度综合评价、疾病的治疗效果等有着重要意义[1,14]。本实验于第21 d上午给予气道滴注LPS后，下午随机取模型组和空白组各7只雄性大鼠进行了肺功能测定，结果表明，与空白组相比较，模型组大鼠MVV、FVC、FEV25-75%、FEV0.3/FVC%均显著降低（P<0.05），表明其肺功能出现严重降低，证明COPD大鼠模型复制成功。

COPD患者的炎症反应主要发生在气道、肺及肺内血管中。参与炎症反应的不仅有中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞，也有IL-8、IL-6、IL-17、TNF-α、可溶性细胞间黏附分子-1等细胞因子[15]。慢性炎症反应是COPD的重要发生机制之一，可进一步导致气道重塑，是COPD中气流受限的重要因素之一[16]。本实验中，分析HE染色结果可知，不同工艺的芪蛭益肺颗粒给药干预后，COPD模型大鼠肺组织炎性细胞浸润情况得到有效改善，表明芪蛭益肺颗粒能减轻COPD模型大鼠的慢性炎症反应对气道的反复刺激，抑制气道重塑。杯状细胞增生是COPD的重要临床症状。在炎症介质、颗粒刺激物等刺激因素作用下，杯状细胞发生增生并可进一步分化为黏液分泌细胞，以维持气道内平衡及气道上皮的数量[17]。本实验中通过AB-PAS染色结果可见，与模型组相比较，芪蛭益肺颗粒工艺1大、小剂量组、工艺2大、小剂量组可使COPD模型大鼠杯状细胞数目显著减少，说明给予芪蛭益肺颗粒具有抑制COPD模型组气道杯状细胞化生的作用。

本实验通过药效学对比研究发现，在给药干预后，芪蛭益肺颗粒不同工艺大、小剂量组与模型组相比肺功能均出现很大程度改善，体现出芪蛭益肺颗粒对肺功能具有一定保护作用。但分析肺功能、肺指数及杯状细胞数目数据结果不难发现，芪蛭益肺颗粒工艺2小剂量组在Cdyn、Re及肺指数方面与工艺1小剂量组相比改善效果更为显著，且工艺2大剂量组气道纤毛上杯状细胞数目与工艺1大剂量相比减少得更为显著，说明与工艺1相比，工艺2不但有治疗作用且治疗效果更优。

综上所述，芪蛭益肺颗粒全方水提及全方水提醇沉工艺对COPD模型大鼠均有一定的治疗作用，但全方水提醇沉工艺得到的药物在提取的同时起到了进一步精制的作用，且疗效更佳，可使患者提高疗效的同时服用更少药量。因此，全方水提醇沉工艺得到的芪蛭益肺颗粒在新药开发中更具优势。