光污染对大鼠卵巢MicroRNA的影响及滋阴补阳方序贯干预作用的研究＊

马倩雯，谈 勇

（1.南京中医药大学镇江附属医院，镇江市中医院 妇科 江苏 镇江212000中国；2.南京中医药大学 第一临床医学院 江苏 南京210000中国）

近年来，人工光源的广泛使用，给人们带来便利的同时，也正在成为一种新的污染源—光污染。光污染影响到了人们的正常生活[1-3]，对人体在不同程度上有着一定的伤害，从而使一系列疾病的患病机率增加，表现在女性生殖系统方面的疾病如月经不调、排卵障碍性疾病、不孕症等[4-6]。MicroRNA（miRNA)是一类非编码RNA，能通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对引起靶mRNA的降解或遏制其翻译，在多种疾病的发生发展中起到了重要的调节作用[7-13]。研究表明，许多重要的生物学进程研究发现多种疾病中均存在microRNA的差异表达。本实验采用持续光照的方法建立大鼠光照节律紊乱模型模拟光污染的环境，通过对大鼠卵巢microRNA测序表达谱的分析，从而探讨这种环境影响因素对大鼠卵巢microRNA的影响以及滋阴补阳方序贯法的干预作用，为临床治疗和预防提供一定的实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

2 月龄SD大鼠80只，体重200±20 g，饲养于南京中医药大学动物中心，室内湿度为55%～70%，室内温度为22～24℃。

1.2 主要试剂与仪器

Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，2100），NEBNext® Multiplex Small RNA library Prep Set for Illumina®试剂盒（New England BioLabs，E7300L），Trizol（Thermo Fisher Scientific，15596018），PrimeScript RT-PCR Kit（Takara，RR014A）和Premix EX Taq（Takara，DRR041A），ABI7500荧光定量PCR仪（ABI，7500），核酸蛋白浓度分析仪（美林恒通公司，SMA4000），4只40 W白炽灯（科导公司，E27）、微量加样器（Eppendorf），滋阴补阳序贯中药（经后期方药组成如下：当归10 g、山茱萸6 g、白芍10 g、菟丝子12 g、干地黄10 g、紫河车10 g；经前期方药组成如下：巴戟天10 g、续断15 g、补骨脂10 g、淫羊藿10 g、党参15 g、淮山药15 g）（江苏省中医院），奥林巴斯CX22显微镜（OLYMPUS，CX22）、希玛AS823高精度光强测试仪（深圳市源恒通科技有限公司，AS823）。

2 方法

2.1 实验方法

将80只SD雌性大鼠随机分为对照组25只和造模组55只，对照组大鼠25只予12小时光/12小时暗的光照环境，而造模组大鼠55只予24小时持续光照的光照环境，造模时间定为50天，去除造模失败大鼠5只，剩余大鼠分为模型组25只及实验组25只。对照组和模型组给予生理盐水灌胃，而实验组予滋阴补阳方序贯中药治疗。实验组根据大鼠阴道脱落细胞涂片来辨别大鼠动情周期，并给予相应的中药灌胃，即动情期和动情前期给予滋阴方灌胃，动情间期及动情后期则给予补阳方治疗，若持续使用3天以上滋阴方后仍旧没有转为动情间期或者动情后期，则改成补阳方灌胃治疗，同样，若持续使用3天以上补阳方后仍旧没有转成动情期或者动情前期，则改成滋阴方灌胃，每天1次，共20天，给药剂量按照人与大鼠体表面积折算的比率1∶0.018算出。与此同时，模型组给予大鼠等体积的生理盐水灌胃。每10天对三组大鼠进行称重一次。20天持续治疗后随机选取三组大鼠中的5只进行糖水偏好实验以及强迫游泳实验，其它大鼠进行腹主动脉取血和卵巢的取样。依据大鼠阴道涂片找出动情前期的大鼠进行腹主动脉取血，剖腹留取卵巢组织并对卵巢组织进行称重，然后将大鼠处死。所有大鼠于14:00处死。卵巢组织放入冻存管内，置于-80℃冰箱中，冻存待检。

2.2 卵巢组织总RNA的提取以及质量鉴定

提取三组大鼠的卵巢组织RNA，接着对总RNA进行质量测定。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，然后使用核酸蛋白浓度分析仪检测三组大鼠卵巢组织的RNA的浓度，将样本稀释50倍分别测定260 nm和280 nm波长的吸光度值，计算OD260/OD280的比值，1.8-2.0之间认为RNA纯度达标。初步测定完成后，避免降解产物的污染，用Agilent 2100生物分析仪进行质检，确保总RNA的浓度及完整性达到测序要求，提取的RNA于-80℃冰箱保存备用。

2.3 文库的构建及测序

取RIN（RNA完整性计数）大于8的2μg总RNA进行文库构建。具体过程如下：使用3′连接酶将3′SR接头连到小RNA上，为防止接头二聚体产生，剩余的3′SR接头会与Illumina SR RT引物杂交。再使用5′连接酶将5′SR接头连到小RNA上，用ProtoScript II反转录酶合成cDNA的第一条链。然后用P5和P7引物扩增12个循环。构建好的文库经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化回收140 bp左右的片段，使用Agilent 2100生物分析仪检测文库质量，并通过Qubit 2.0 Fluorometer对文库定量。不同标记的DNA文库混合后，进行1×50 bp单端测序，并读取序列信息。

2.4 MicroRNA的差异表达分析

应用DESeq（v1.18.0）软件对三组大鼠卵巢已知microRNA表达进行差异比较，统计microRNA差异表达的上下调状况。

2.5 GO和KEGG显著性富集分析

GO是一种基因分类，可以用来阐述基因的细胞功能、分子成分以及所参与的生物学过程。GO显著性富集分析可以在差异表达microRNA的靶基因中给出显著富集的生物学功能，即microRNA靶基因与哪些生物学功能显著相关。KEGG是和信号通路相关的数据库，KEGG的显著性富集分析可以在差异表达microRNA的靶基因中找出显著富集的信号通路。

2.6 差异表达microRNA的验证

应用RT-PCR（荧光定量PCR）的实验方法对显著差异表达的microRNA进行测定，从而判断高通量测序结果是否可靠。由上海生工生物科技有限公司设计引物，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，根据试剂盒说明，配制逆转录反应液，进行反转录反应，所得cDNA于-20℃保存。所有基因荧光定量PCR按20μl反应体系进行。所有基因荧光定量PCR按20μl反应体系进行。反应结束后，荧光定量PCR仪测定出Ct值，△Ct是指目的基因Ct值与内参Ct值的差值，并计算microRNA相对表达量的2-∆∆Ct值。采用荧光定量RT-PCR对4个显著差异表达的microRNA（miR-344a、miR-466b-5p、miR-466c-3p、miR-421-5p）进行验证，以rRNA U6（上游引物为TGACACGCAAATTC⁃GTGAAGCGTTC，下游引物为CCAGTCTCAGGGTCC⁃GAGGTATTC）作为内参，上游引物序列miR-344a:GCGGCGGUCAGGCUCCUGGCUA；miR-466b-5p：GGC⁃GGUAUGUGUGUGUGUAUGUC；miR-466c-3p：GCG⁃GCGGUAUACAUGCACACAUAC；miR-421-5p:CGGC⁃GGGGCCUCAUUAAAUGUUU。下游通用引物序列为CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。

2.7 统计学方法

采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，三组之间的比较运用单因素方差分析的统计学方法，不符合正态分布或者方差不齐者，采用非参数检验的办法，其中P<0.05提示比较者之间具有统计学差异。

3 结果

3.1 高通量测序数据

原始序列经过处理后，模型组、实验组和对照组大鼠卵巢样本所获得的可用于分析的小RNA序列数量分别为16733978、16776253和13724423 reads。对所测序列长度在18-32 nt之间的序列进行分布统计分析，结果发现测序得到的序列在18-32 nt的reads，主要集中在20-24 nt，在22 nt处出现最高峰，符合microRNA的长度特征。结果表明，测序数据准确可靠，可以用于后续的生物信息学分析。

3.2 差异性表达microRNA的分析

3.2.1 对照组与模型组已知microRNA差异性表达的分析 对照组与模型组对照比较显示16个已知mi⁃croRNA呈显著差异性表达，其中5个microRNA表达上调，其中包括miR-421-5p、miR-326-5p、miR-208a-5p、miR-338-5p和miR-541-5p，11个microRNA表达下调，包括miR-132-5p、miR-146b-5p、miR-466c-3p、miR-212-5p、miR-466b-5p、miR-21-5p、miR-6329、miR-96-5p、miR-344a、miR-31a-5p、miR-877。

3.2.2 实验组与模型组已知microRNA差异性表达的分析 实验组与模型组对照比较显示4个已知mi⁃croRNA呈显著差异性表达，其中3个microRNA表达上调，其中包括miR-466b-5p、miR-466c-3p、miR-344a，1个microRNA表达下调，其中包括miR-421-5p。

三组大鼠卵巢差异性表达microRNA的上下调情况见图1。

图1 三组大鼠卵巢差异性表达microRNA的上下调情况

3.3 模型组与对照组之间的GO和KEGG功能分析

通过对模型组与对照组之间进行GO分析和KEGG通路富集分析可知，光污染引起的卵巢差异表达的microRNA及可能的靶基因在富集的分子功能上多集中于生物调节、生长过程、分子的结合等方面，受microRNA调控的靶基因参与的这些通路中多集中于神经组织受体相互作用、癌症、雌激素、MAPK等相关信号通路，见图2-3。

图2 对照组与模型组比较的GO分析图

3.4 实验组与模型组之间的GO和KEGG功能分析

通过对实验组与模型组之间进行GO分析和KEGG通路富集分析可知，滋阴补阳方序贯法可能通过癌症、雌激素、MAPK等相关信号通路作用于卵巢组织起到改善卵巢功能的作用，见图4-5。

3.5 荧光定量RT-PCR验证

通过对照组与模型组以及实验组与模型组的综合比较分析，我们得出有4个microRNA在这两个组间共同呈显著差异表达，且在对照组与模型组中呈现上调的microRNA在实验组与模型组中呈现下调，在对照组与模型组中呈现下调的microRNA在实验组与模型组中呈现上调，我们分析这共同的microRNA可能参与光污染影响卵巢发育以及滋阴补阳方序贯法干预作用的过程。因此我们对这4个microRNA进行荧光定量RT-PCR测定。

荧光定量RT-PCR结果显示4个microRNA表达的变化趋势与高通量测序的结果一致，即模型组miR-344a、miR-466b-5p、miR-466c-3p显著低于实验组及对照组，模型组miR-421-5p显著高于实验组及对照组，进一步证实了高通量测序结果的准确性，见图6-7。

4 讨论

近年来，人工光源的广泛使用为人们的生活提供了便利，但夜间照明时间延长会使人体接受光照的时间和强度延长，可导致内分泌失调、昼夜节律紊乱、生殖功能障碍。有文献报道，夜班、轮班工作者，月经不调、不孕症等疾病的发病率增高。光照时间过长或光照强度过强，会引起下丘脑-垂体-卵巢轴的异常，影响人类的生命健康[14-15]。

图3 对照组与模型组比较的KEGG图

本研究通过高通量测序技术结合生物信息学方法来探讨光污染引起的差异表达的microRNA及可能的靶基因，进一步推测microRNA在光污染环境下的作用机理，同时探讨滋阴补阳方序贯法对卵巢功能在microRNA水平上的改善作用。滋阴补阳方序贯法是根据国医大师夏桂成教授的调周理论提出的调节月经周期节律的治疗方法，即经后期以滋阴为主，而经前期以补阳为主。经后期的治疗，以当归、山茱萸、干地黄、白芍等滋阴养血药为主，而经前期的治疗以巴戟天、续断、补骨脂、淫羊藿等补肾助阳药为主。本研究获得的差异表达microRNA的靶基因在GO富集的生物学功能上多集中在生物调节、生长过程等过程，在分子功能上多集中在离子的结合上，在细胞组成上多富集于细胞部分、大分子复合物、细胞器的合成及代谢等方面。KEGG通路富集分析显示，光污染大鼠受microRNA调控的靶基因参与的这些通路中多集中于癌症、雌激素、MAPK等相关信号通路，滋阴补阳方序贯法可能通过这些相关信号通路作用于卵巢组织起到改善卵巢功能的作用。

图4 实验组与模型组比较的GO分析图

前期实验研究结果表明[16]，光污染会引起大鼠情绪障碍，内分泌激素紊乱，生殖功能减退。从大鼠卵巢超微结构上看，光污染大鼠卵巢内细胞核染色质不均匀，可见较多电子密度较高的异染色质，甚至出现边集现象，高度凝集，核膜形成皱褶，呈现细胞凋亡样改变。陈文俊等人[17-18]研究发现持续光照可以抑制褪黑素分泌，升高雌鼠雌二醇、卵泡刺激素及黄体生成素水平，促进青春期提前启动，并可通过干扰褪黑素昼低夜高的节律变化，导致性腺轴异常，内分泌紊乱，动情周期失去节律，动情期显著延长。持续光照会导致大鼠排卵障碍，多发囊肿、黄体极少。邹奕洁等人[19]研究表明持续光照会引起大鼠被膜增厚，膜间质细胞增生，卵泡发育停滞，卵泡内颗粒细胞层数减少，无排卵、卵泡原位黄素化并形成大量筛网状、微囊状黄体结构，黄体内颗粒细胞显著减少。光污染引起卵巢大鼠结构的改变是个复杂的过程，涉及到多个信号通路，对任一通路的调控都可能对治疗光污染引起的生殖功能障碍起到重要作用。本研究中显著差异表达的部分microRNA被证实参与组织细胞增殖、代谢等过程。如miR-877被认为与肿瘤的发生发展呈负相关，上调miR-877可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。光污染大鼠卵巢miR-877表达下调，推测可能与细胞增殖等过程相关[20]。尽管尚无microRNA和光污染关系的报道，但是从microRNA调控一些相关基因的研究中可间接发现其与光污染的关联性。

图5 实验组与模型组之间的KEGG图

图6 对照组与模型组之间miRNAs相对表达水平差异

图7 实验组与模型组之间miRNAs相对表达水平差异

因此，本研究中筛选到的microRNA可能通过多种信号通路影响光污染大鼠卵巢的发生发展。高通量测序技术的迅速发展，使得对一个物种的基因组和转录组进行细致的分析成为可能。本研究通过高通量测序技术成功筛选到一些与光污染相关的差异表达的microRNA，为光污染引起的卵巢发育以及滋阴补阳方序贯法干预作用的研究提供了新的思路和工作基础。