蛴螬对激光损伤兔血-视网膜屏障后视网膜TekC、NGF表达的影响＊

蒋鹏飞，杨 霞，彭 俊，彭清华＊＊

（1.湖南中医药大学中医学院 长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院 长沙410007；3.湖北航天医院 武汉432000；4.中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室 长沙410208）

随着激光在眼科检查及治疗的广泛应用，由激光所致的医源性视网膜光损伤也越来越多，视网膜光损伤会破坏视网膜屏障功能，许多眼科疾病的发生与视网膜长期光照的积累效应有关[1-2]。蛴螬在眼科应用较早，《晋书》中有此药治疗目疾的记载：“吴中书郎战冲，母王氏失明，婢取蛴螬蒸熟与食，王以为美，冲还知之，抱母恸哭，母目即开。”本研究探讨了蛴螬对激光损伤血－视网膜屏障的作用及其机理。

1 实验材料

1.1 实验动物

选用30只健康实验性兔，均为雄性，体重1.8-2.3 Kg（湖南中医药大学动物实验室提供，合格证号：医动字第20-002号）。

1.2 药品及试剂

蛴螬酸性水解液（参照谭涵宇所用制备方法[3]制取，具体为：蛴螬400 g，清洗10遍以上，浸泡一晚，后洗至无臭味。加蒸馏水5 kg，加37%HCl至pH值为2。高压蒸汽锅蒸2小时。纱布（4-5层）过滤，溶液中加40%NaOH至pH值为6.5-6.8。冷却，隔水加热，浓缩至1600 mL，装瓶，压盖，蒸汽高温灭菌，冷藏保存）、Harris苏木素（湖南中医药大学病理实验室，批号：71020784）、PV9000型二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司，批号：zb-5301）、细胞裂解液（江苏碧云天，批号：P0013）、RIPA蛋白裂解液（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G2002）、ECL发光试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G2014）、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天，批号：P0006）、转移缓冲液（武汉赛维尔生物科技有限公司，G2017）、NGF一抗（武汉博士德生物工程有限公司）、TrkC一抗（武汉博士德生物工程有限公司）、羊抗兔二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：GB23303）。

1.3 主要仪器及器械

眼科手术显微镜（苏州医疗器械有限公司）、眼底接触镜（苏州医疗器械有限公司）、YZ/3三面镜（苏州医疗器械有限公司）、YZ5F裂隙灯照相机（苏州医疗器械有限公司）、裂隙灯显微镜（苏州医疗器械有限公司）、AG204型电子天平（上海梅特勒—托利多仪器有限公司）、TD5-Ⅱ台式离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）、SSW型电热恒温水槽（上海博迅实业有限公司）、721分光光度计（上海第三仪器厂）、LKB8800超薄切片机（瑞典LKB公司）、多功能显微镜（西德OPTON公司）、Olympus光学显微镜（日本日立公司）、石蜡包埋机（日本日立公司）、LeicaMPS30照相系统（德国Leica公司）、Leica石蜡切片机（德国Leica公司）、莱特532眼底激光治疗仪（法国光太公司）。

2 实验方法

2.1 激光损伤血－视网膜屏障动物模型的建立

参照王晓英[4]、陈少军[5]等造模方法并加以改进。实验动物的准备：激光照射当日用复方托吡卡胺眼药水滴眼2次。造模方法：兔称重，固定，20%乌拉坦1 g/kg耳缘静脉注射全麻，将兔头部固定于激光机前，以激光在视盘及有髓神经纤维下视网膜处密集照射40个点，光斑紧邻，最大间隔为100μm。光斑效应为3级（中度～重度）[6]：中心白较浓或更浓，激光能量作用于内核层。

2.2 动物分组及给药方法

30只实验性兔随机抽取10只（20只眼）作为正常组，其余20只（40只眼）造成激光损伤血－视网膜屏障模型，并随机分成模型组、蛴螬组，每组10只（20只眼）。

造模后第2天开始给药，按照“人—动物体表面积等效剂量比值表”折算实验动物的给药剂量，折算公式：W*成人用量（g）/动物体重（kg），折算系数W=0.018，每组灌胃药物详情如下：正常组与模型组以0.9%生理盐水2 mL灌胃，蛴螬组以蛴螬提取液2 mL灌胃，均为每日1次，每次0.56 g/100 g。

2.3 标本采集方法

灌胃1周后，各组随机抽取5只兔进行标本的采集和指标的检测，各组剩余的兔继续同法灌胃至第2周结束，再行标本的采集和指标的检测。

2.3.1 眼球壁标本的采集

实验结束后，动物耳缘静脉注射空气处死，立即沿角膜缘作标记后摘除眼球，生理盐水冲洗干净，在冰生理盐水中于角膜缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节组织和玻璃体，在手术显微镜下找到激光斑所处视网膜，大于激光斑范围约3 mm切除该处眼球壁，用4%多聚甲醛在4℃固定。

2.3.2 视网膜组织匀浆的采集制作

将依同法摘除的眼球壁在手术显微镜下剥离激光斑部位视网膜，用滤纸吸干水分，电子天平称其湿重，再用双蒸水按照湿重：体积=1：19配制成5%的视网膜匀浆液。

2.4 观测指标及其方法

2.4.1 眼底观察及照相

造模后即刻作眼底照相；每日灌胃前用直接检眼镜查看眼底，观察眼底情况，光凝后7天、14天再次眼底照相。

2.4.2 光镜下HE染色观察

经脱水浸蜡，二甲苯溶液脱蜡2次，每次5 min，无水乙醇洗蜡1次，3 min，95%乙醇浸泡，3 min，85%乙醇浸泡，3 min，自来水洗，3 min，苏木素染色，5 min，水洗去多余染液，3 min，75%乙醇盐酸分色5 min，自来水洗蓝化，5 min，1%伊红染色，3 min，水洗去多余染液，3 min，80%乙醇Ⅰ分色脱水，1 min，85%乙醇Ⅱ分色脱水，1 min，无水乙醇Ⅰ脱水，1 min，二甲苯溶液透明，3 min，中性树胶封片等步骤，在光学显微镜下观察HE染色标本视网膜各层结构的形态学变化。

2.4.3 神经营养因子受体蛋白（TrkC、NGF）表达的免疫组化观察

采用S-P免疫组化法检测视网膜组织的TrkC、NGF表达：石蜡切片经常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后切片，3%H2O2去离子水孵育5-10分钟，阻断内源性过氧化酶，PBS根据需要对组织切片进行预处理，滴加兔来源的一抗，37℃孵育1-2小时，PBS冲洗，2分钟×3次，滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育20-30分钟，PBS冲洗，2分钟×3次，选用DAB显色，蒸馏水充分冲洗，选择适当的封片剂进行封片，高放大倍率显微镜下观察TrkC、NGF的表达。标准如下：免疫组织化后，细胞质为棕色或深棕色为阳性标记，使用高倍显微镜随机选择5个视网膜视野用于图像分析系统的分析。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 眼底照相

造模组与蛴螬组均有明显激光斑，激光斑中心颜色呈浓白色，周边见浅色一圈光晕，说明造模成功。造模后7天，蛴螬组激光斑色白，边界尚清，未见中心色素形成，可见白点，少许玻璃体混浊；模型组激光斑呈白色，边界较模糊，中心未见色素沉着，玻璃体混浊。造模后14天，蛴螬组激光斑范围明显缩小，大部分形成瘢痕组织，玻璃体少量混浊；模型组激光斑颜色变深，中心形成瘢痕组织，玻璃体仍见明显混浊，说明出血未完全吸收。（图1-6）

图1 正常兔眼底照相

图2 造模成功眼底照相

图3 蛴螬组7天后

图4 模型组7天后

图5 蛴螬组14天后

图6 模型组14天

3.2 HE染色

3.2.1 术后1周HE染色观察

正常组视网膜色素上皮层、视杆视锥层、外核层、外从状层、内核层、内从状层、神经节细胞层、神经神经纤维层等各层结构清晰正常（图7）。模型组视网膜厚度显著薄于正常组，组织结构紊乱，细胞数目减少，视细胞萎缩变性，HE染色可见视网膜色素上皮细胞不连续，视网膜的外层较薄，部分感光细胞形态欠规则，且细胞核数量减少，大部分区域无外感光器核染色，一小部分区域可见聚集成团的细胞核染色（图8）。蛴螬组视网膜厚度明显高于模型组，可以见到一部分视网膜色素上皮，感光细胞核的数量大于模型组，外从状层、外核层、视杆视锥层的结构厚于模型组，并且结构更清晰（图9）。

3.2.2 术后2周HE染色观察

正常组较前无明显变化。模型组视网膜厚度仍薄于正常组，视网膜组织细胞数目较前增多，结构较前清楚（图10）。蛴螬组视网膜厚度高于模型组，视网膜结构清晰，排列整齐（图11）。

图7

图8

图9

图10

图11

3.3 TrkC的表达

3.3.1 术后1周TrkC的表达

正常组视网膜组织抗TrkC标记的细胞浅染色，染色阳性主要位于外核层细胞（图12），模型组视网膜组织TrkC在Müller细胞中呈阳性表达（图13），蛴螬组视网膜组织TrkC呈强阳性表达，阳性面积大，染色较深（图14）。模型组、蛴螬组TrkC表达与正常组比较有显著性差异（P<0.01）。见表1。

图12

图13

图14

表1 各组TrkC面密度值的变化（±s×10-4）

表1 各组TrkC面密度值的变化（±s×10-4）

注：与正常组比较：*示P<0.05，**示P<0.01；与模型组比较：▲示P<0.05；▲▲示P<0.01。

组别正常组模型组蛴螬组n 5 5 5第1周3.46±2.89 44.24±22.68**118.54±27.94**▲▲第2周2.90±1.06 22.06±8.19**69.38±17.26**▲▲

3.3.2 术后2周TrkC的表达

正常组视网膜组织TrkC呈弱阳性表达，与1周前正常组无区别（图15），模型组视网膜组织TrkC呈弱阳性表达，Müller细胞中着色较正常组深（图16），蛴螬组视网膜组织TrkC呈弱阳性表达，可见少量阳性染色位于Müller细胞中（图17）。各组TrkC表达均较1周前有所下降，蛴螬组与模型组之间有显著性差异（P<0.01）。见表1。

图15

图16

图17

3.4 NGF的表达

3.4.1 术后1周NGF的表达

正常组视网膜组织NGF染色呈阴性（图18），模型组视网膜组织NGF呈阳性表达，主见于外核层Müller细胞外侧端表达（图19），蛴螬组视网膜组织NGF呈强阳性表达，但阳性部位多位于Müller细胞的外侧端（图20）。模型组与蛴螬组NGF表达均高于正常组且有显著性差异（P<0.05），蛴螬组与模型组间有显著性差异（P<0.05）。见表2。

图18

图19

图20

表2 各组NGF面密度值的变化（±s×10-4）

表2 各组NGF面密度值的变化（±s×10-4）

注：与正常组比较：*示P<0.05，**示P<0.01；与模型组比较：▲示P<0.05。

组别正常组模型组蛴螬组n 5 5 5第1周12.15±3.71 53.26±14.49**75.60±23.87**▲第2周8.63±2.55 30.13±7.25**42.39±19.33*▲

3.4.2 术后2周NGF的表达

正常组视网膜组织NGF染色呈阴性（图21），模型组视网膜组织NGF呈弱阳性表达，主要位于神经节细胞层（图22），蛴螬组视网膜组织NGF呈阳性表达，主位于Müller细胞外侧端及部分神经纤维层，染色较其它组深，阳性面积较其余对照组大（图23）。模型组、蛴螬组NGF表达均较1周前有所下降，模型组与正常组间比较有显著性差异（P<0.05），蛴螬组表达高于模型组，并且有显著性差异（P<0.05）。见表2。

图21

图22

图23

4 讨论

随着激光对血－视网膜屏障损伤机理研究的不断深入，对于损伤后的治疗，国内外已经从简单的抗炎、止痛等对症治疗转向探索更有针对性的治疗方法，目前研究的重点主要集中在激素类、神经保护剂和某些细胞因子的应用研究。激素类主要是通过抑制视网膜细胞的脂质过氧化反应，维持细胞完整性，防止细胞内物质外流[6]，在激光照射后短时间内具有神经保护作用，但是对长期损伤没有治疗作用。碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和重组人碱性成纤维细胞生长因子（Recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF）可加速视网膜损伤斑的修复愈合、维持神经元和胶质细胞的功能以及视功能的恢复[7-8]，对激光视网膜损伤斑有明显的促进修复愈合作用，可使损伤斑变浅淡，色素沉着减少，视网膜损伤斑面积明显缩小，愈合修复较快。二甲基硫脲（Dimethyl thiourea，DMTU）可以有效地抑制感光细胞的脂质过氧化，能明显减少损伤区域视网膜神经元的凋亡数目，保护视网膜组织的结构和形态[9]。目前神经细胞保护剂尚处于研究、实验阶段，其作用和不良反应正在探索之中。尽管新的视网膜光损伤治疗方法不断问世，但很多都处于起始阶段，其使用方法和疗效有待进一步的研究和证明，在临床上尚缺乏有针对性的有确切疗效的西药。目前的主要治疗原则是：撤离照射环境，及时对症处理，营养支持治疗，促进组织修复，缩短致伤病程，恢复功能状态。如加强全身营养，补充富含多种维生素的食物，增强机体抵抗力等，有利于调节眼内的正常代谢，增强局部抗损伤能力。

在祖国医学文献中并无“激光损伤血－视网膜屏障”病名的记载，但早在《备急千金药方·卷六·七窍门上》中就记载了“…数看日月、夜视灯火…，并是丧明之本”；《外台秘要》进一步提到“数向日月轮看”、“雪山巨睛视日”皆是“丧目之由”，明确提出光损伤对视力的损害。现代中医眼科在继承传统医学的基础上，将激光损伤归为:“为物所伤之病”范畴，认为激光致血－视网膜屏障损伤主要是由于热灼阴津、热灼血络，气津相关，气能生津、化津、摄津，津能载气，若阴津亏耗，无以载气，则气失依附而气散气耗而致气虚；气生于精，精化为气，阴精亏耗必致气虚；阴损耗气而致气阴两虚，气为血帅，气行血行，若气虚运血无力，可致气虚血瘀。

蛴螬是金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子或其他近缘昆虫的干燥幼虫，属虫类药，味咸微温，有毒。有破血、行瘀、散结、通乳之功效，《神农本草经》中最早有记载：“主恶血血瘀痹气，破折血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤、青翳白膜。”《别录》称蛴螬可以“疗吐血在胸腹不去及破骨踒折血结，金疮内塞，产后中寒，下乳汁。”《本草拾遗》中记载蛴螬“主赤白游疹，疹擦破，碎蛴螬取汁涂之。”现代研究认为蛴螬含有多种对人体健康有益的元素：蛴螬中Ca、Mg、Cr、Fe、Zn的含量高是其重要的营养特征，Cu、Mn含量也非常丰富，蛴螬中K/Na的高比值对于防治心脑血管疾病有重要意义。从蛴螬中维生素含量测定结果看，B族维生素含量较高，维生素A和维生素E的含量也较丰富。维生素B1和烟酸能促进血液循环，维生素B2能缓解眼睛疲劳、预防白内障，维生素A有增强机体免疫功能的作用,维生素E是抗氧化维生素。对蛴螬滴眼液中氨基酸成分的测定结果显示，其含有大量天门冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸等氨基酸，与Zn、Fe、维生素E等作用，可以缓解组织缺氧缺血，可能对血-视网膜损伤后组织的修复产生保护作用。

有研究发现视网膜组织光损伤可导致感光细胞的存活率下降[10-11]，这与神经营养因子（Neurot rophic factors，NTFs）有很大关系，NTFs在神经系统发育过程中的生长、生存以及成熟都是必不可少的[12]。神经生长因子（Nervegrowthfactor，NGF）是NTFs蛋白家族的一员，在视皮质中的NGF能稳定丘脑传入的突触接触[13]，成熟NGF和NGF原蛋白（proNGF）的免疫反应性出现在大鼠视网膜神经节细胞（RGC）、视网膜色素上皮细胞(RPE)以及与内界膜相邻的视网膜区域，有研究推测NGF可能在正常视网膜功能执行中发挥作用[14]，在视网膜神经节细胞、RPE细胞中均具有NGF受体[15]。NTFs作用主要是通过高亲和型酪氨酸蛋白激酶类受体（High-affinity tvrosine kinase receptors，Trks）和p75神经营养素受体（The low-affinity neurotrophin receptor，p75NTR）完成的。当NGF与Trks结合后，胞外区构象变化导致受体的寡聚化活化，使胞内区的酪氨酸激酶活性增高，然后通过Ras通路激活Raf21蛋白，随后在细胞质中促分裂因子激活蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）等一系列激酶被活化后的信号转移到细胞核内，并作用于一系列的靶蛋白（包括转录因子），从而影响基因的转录和翻译，表现为对细胞生长的调控，这样NGF通过TrkC就可以转变为细胞生长分化信号，从而使NGF表现出多种生物功能[16]。

本实验发现激光损伤视网膜血-视网膜屏障时NGF与Trks同时表达，而蛴螬能有效上调NGF与TrkC的表达，从而抑制视网膜细胞的凋亡，保护细胞正常功能。提示蛴螬对激光所致视网膜血-视网膜屏障损伤有保护作用，能促进损伤后视网膜组织结构的恢复，维护正常视功能。