基于多元统计方法和顶空-气相色谱-质谱联用技术对瓜馥木不同部位挥发性成分的比较研究＊

胡海波，李耀利，程庚金生，邓婧怡，李加林，程齐来，黄 浩

（1. 赣南医学院药学院 赣州 341000；2. 北京大学药学院 北京 100191；3. 国家中药现代化工程技术研究中心客家中医药资源研究分中心 赣州 341000；4. 鲁汶大学动物研究所 鲁汶 3000）

番荔枝科植物瓜馥木Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.主要分布于我国长江以南多省[1]，首载于《植物名实图考》，谓之广香藤，曰：“产南安（今江西省赣州市大庾岭附近的南安），绿叶毛涩，黄背赭纹，极似各树寄生，惟褐茎长劲为异。俚医用以解毒、养血、清热[2]。”《中华本草》亦收载为广香藤，以干燥根入药，性平、味微辛，具祛风除湿、活血止痛等功效，可用于治疗风湿痹痛、腰痛、胃痛、跌打损伤等症[3]。实地调查表明客家地区多使用瓜馥木地上部分，用于治疗和预防妇科和产科炎症等，称为“香藤”，与记载的广香藤用根存在差异[4]。瓜馥木主要含有生物碱、黄酮、类黄酮-倍半萜杂合结构、呋喃酮类、环戊烯酮类、苷类、有机酸、挥发油等成分，其中生物碱、黄酮和有机酸类成分具有较高的生物活性[5,6]。药理学研究证明其中的有机酸具抗关节炎作用，生物碱具镇痛作用和心血管生物活性，可用于治疗心律不齐与慢性心肌供血不足，生物碱亦有抗肿瘤活性，对W256、S37、S180等瘤株有抑制作用等[7-11]。

目前对于瓜馥木挥发性成分的研究中，均是基于气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析超临界CO2流体和水蒸气蒸馏提取的挥发油，仅采用标准质谱库定性[12,13]。为此，本文首次采用顶空气相质谱联用技术（HS-GC-MS）直接对瓜馥木药材的粉末进行挥发性成分分析，并结合程序升温保留指数（RI 值）进行定性，并基于XCMS-online软件对不同样品的质谱数据进行提取和对齐，以提高定性准确性；同时针对药用部位的药用差异问题，运用偏最小二乘法判别分析法（PLS-DA）、及正交校正的偏最小二乘分析法（OPLSDA）两种多元统计分析方法进行数据的分析和比较不同部位挥发性成分，首次探讨瓜馥木挥发性成分的分布差异性。研究结果将为该药材的质量标准科学制定和民间使用提供依据和借鉴，并为进一步的药效评价、资源开发利用奠定基础。

1 仪器与材料

Shimadzu QP2010 PLUS型GC-MS联用仪（日本岛津公司）；CP9205型气相色谱柱（Agilent，VF-WAXms，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；2.5 mL 顶空针（德国Hamilton 公司）；18-09-1307-TF 型顶空气相小瓶（日本岛津公司，配备有硅酮/PTFE 隔垫和磁性瓶盖）；101型电热鼓风干燥箱（北京市光明医疗仪器有限公司）；BO-500Y型多功能粉碎机（永康铂欧五金厂）；2号和3号药典筛（思科仪器纱筛厂）；AB135-S 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团）。正构烷烃（C7-C30）标准溶液（SIGMA-ALDRIC 批号：XA17133V）。实验用瓜馥木药材由赣南医学院药学院胡海波老师于2016 年11 月采于江西省崇义县阳岭国家森林公园，并鉴定为番荔枝科瓜馥木属瓜馥木Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.的干燥植株（编号XT-CY1601），凭证标本保存于赣南医学院中药标本馆。

2 方法

2.1 瓜馥木药材粉末样品的制备

将采集的新鲜瓜馥木根、茎、叶、虫瘿（多见，茎上）4 个部位分离，置于烘箱中在40℃条件下干燥。粉碎机粉碎，过药典筛2-3 号筛（24-50 目），取中间粉末混匀。各部位样品重复取样6次，分别命名为G1-G6、J1-J6、Y1-Y6、CY1-CY6。

2.2 HS-GC-MS条件

精密称取0.1 g 瓜馥木各部位粉末，置于10 mL 顶空瓶中。在100℃下加热30 min，振荡器转速250 rpm，顶空进样体积1 mL，进样针温度120℃，针清洗时间10 min。

色 谱 柱Agilent VF-WAXms（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm）；载气为高纯氦气（＞99.999%），流量为1.2 mL·min-1。进样口温度230 ℃，分流比20:1，柱温35℃，柱流量1 mL·min-1，升温程序：35℃保持3 min，以5℃·min-1升到220℃，保持5 min，以20℃·min-1升到240℃，保持2 min。

离子源为EI 源，离子源温度：200℃；接口温度：230℃。溶剂切割时间：1.00 min。扫描方式：Scan 模式，分子量扫描范围：35-600 amu，扫描速率0.30 s/scan。离子化能量70 eV。

图1 瓜馥木不同部位挥发性成分总流离子图

2.3 定性和半定量分析

使用岛津气质工作站（GCMS solution Version 2.70）对以上条件得到的GC-MS 数据进行解析：所得瓜馥木中成分的质谱裂解图与NIST11、NIST11s 质谱裂解库及文献中的质谱数据进行比对；通过正构烷烃混标（C7-C30）方法计算各化合物的保留指数（RI）[14-17]，并与美国国家标准局建立的NIST Chemistry WebBook 在线查询系统中的文献值和其它文献值进行对照。

利用XCMS-online[18,19]在线质谱数据分析系统辅助定性：将GC-MS 数据转换成cdf 格式后上传到XCMS-online 在线分析系统，基于荷质比和保留时间对离子碎片进行数据对齐分析，并转换数据为Excel格式后进行人工的筛零处理，排除平行进样中的单次进样误差和辅助找出特异性成分。

利用SMICA-P 软件进行多元统计方法进行半定量分析：将上述对齐和排零后得的数据，进行PLS-DA分析和OPLS-DA 分析。获得VIP 大于1 的数据，即组间显著差异的主要成分信息，并以其碎片离子的强度作为半定量指标，完成差异成分的相对含量比较[20，21]。

3 结果与讨论

3.1 GC-MS定性分析

依照上述条件对瓜馥木不同部位共24 份样品的挥发性成分进行分析，得出的总离子流图（图1）。经质谱解析共鉴定出41 个挥发性成分（表1），它们的峰面积之和占总峰面积的90%以上（根、茎、叶和虫瘿分别为94.52%、91.48%、90.79%、90.96%），可以反映瓜馥木样品中挥发性成分的总体特征。从图中可看出，24 份样品中的大量成分已被表征出，且主要色谱峰均得到较好的分离；通过XCMS online 表征出不同颜色的样品质谱数据对比，挥发性成分在不同部位中存在显著差异，叶的成分强度明显高于其他部分，可能是由于叶具有较多的油细胞[4]而分泌出的成分。

表1 瓜馥木不同部位挥发性成分

从瓜馥木不同部位中共鉴定出19种共有成分，分别为莰烯、2-已烯醛、β-罗勒烯、p 伞花烃、顺-3-己烯醇、(-)α-荜澄茄油烯、α-可巴烯、β-波旁烯、苯甲醛、芳樟醇、β-石竹烯、α-石竹烯、γ-衣兰油烯、α-松油醇、巴伦西亚橘烯、(+)-双环大根香叶烯、橙花叔醇、雪松醇、桉油烯醇。

其次，不同部位间存在22 种差异性成分，这些成分仅在瓜馥木的某个部位或某几个部位被检测到。如白菖烯、2-甲基四氢呋喃-3 酮仅在瓜馥木虫瘿、茎的挥发性成分中；β-罗勒烯仅在茎、叶的挥发性成分中；正己醛和长叶烯则仅在根中未被检测到（表1）。

图2 瓜馥木不同部位的24份样品PLS-DA（a上图）和OPLS-DA得分图（b下图）

3.2 不同部位的多元统计分析比较

由上述可见，瓜馥木不同部位间的成分差异明显。为更好比较分析部位间差异，对获取的GC-MS数据进行多元统计分析，包括最小二乘法判别分析方法（PLS-DA）和正交校正的偏最小二乘分析方法（OPLSDA）。基本思想是根据已知样品集特征，选定适合的判别准则，建立成分表达量和样品之间的关系模型来实现对样品类别的预测和判断分析。将XCMS online导出的excel 数据进行除零处理后，导入SIMCA-P 软件上建模，利用PLS-DA 分析方法筛选不同模型后的自动拟合求解，预测后创建PAR 模型，R2X= 0.922,R2Y= 0.908,Q2= 0.899。其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2标示模型的预测能力，理论上R2、Q2数值越接近1 说明模型越好[20-22]。PLS-DA模型建立成功，24份瓜馥木样品明显聚集成4类，即4个药用部位，结果表明部位间的挥发性成分差异明显，但茎的聚类效果欠佳（图2-a）。

因此，为去除自变量X中与分类变量Y无关的数据变异，使分类信息主要集中在主成分中，模型变得简单和易于解释[23]，同时也为了获得和验证导致组间显著差异的相关成分信息，进一步开展OPLS-DA 分析，创建PAR 模型后自动拟合获得R2X= 0.957,R2Y=0.993,Q2= 0.98，说明模型建立良好。24 份瓜馥木样品在OPLS-DA 分析方法中4 个部位各聚集成一类，在创建模型下部位间的差异较PLS-DA 方法中更为显著（图2-b）。

在图2 中可以清楚地看到瓜馥木4 个部位挥发性成分的离散度。除了茎的数据分散程度比较大，叶、根和虫瘿的6组数据都聚为一类，结果显示瓜馥木根、叶和虫瘿的挥发性成分存在明显差异。

3.3 共有成分的半定量分析

基于上述结果，我们采用判别结果更优的OPLSDA 方法计算各部位间差异。即通过计算变量投射重要度[20,21（]Variable Importance for the Projection，VIP）衡量各成分的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，从而辅助差异性标志物的筛选（即VIP值＞1.0）。

运用OPLS-DA 分析除零后的数据，自动拟合生成散点载荷图（图3），距离子簇较远的碎片离子具更高的VIP值，预示着标记物的存在。筛选出VIP值大于1 的离子碎片。根据这些离子的保留时间和质荷比在GC-MS数据中靶向查找，整理出与之对应的共有成分（表2）。并计算各离子碎片在不同部位（每个部位6组平行数据）的强度平均值，作为相对含量（%）的比较基准。

图3 瓜馥木不同部位的24份样品OPLS-DA散点荷载图

表2 瓜馥木不同部位挥发性成分相对含量的比较

4 结论

本文首次采用顶空气相质谱联用方法对24 份瓜馥木不同部位的药材粉末进行挥发性成分分析，并结合正构烷烃混标方法计算各成分RI值辅助定性，较先前报道仅数据库比对更为准确。其次，利用XCMS online 软件对多次进样的数据进行数据对齐处理，排除了单次进样误差和多次手动比对误差。同时采用SMICA-P 软件对GC-MS 表征的不同样品成分进行PLS-DA、OPLS-DA 方法的数据统计和比较分析，获得了准确的不同部位间差异成分结果。分析表明，瓜馥木不同营养器官（根、茎、叶、虫瘿）间的挥发性化学成分存在明显差异。

结果显示瓜馥木挥发性成分主要是烯烃类和脂肪烃衍生物类，因采用进样和数据分析方法与先前研究不同，结果与文献报道存在不少差异[10,12,13]。共定性出41种挥发性成分，根、茎、叶和虫瘿分别含有24、38、35 和25 种，其中共有组分19 种。值得注意的是，共有组分在瓜馥木不同部位含量差异显著。如：莰烯在根中含量最高；β-石竹烯几乎只存在于叶子中，相对含量超过90%，且β-石竹烯属于单萜类化合物，是一种植物通讯信号分子，与植物防御启动密切相关[24]，但茎在受虫感染后形成的虫瘿中却相对含量极低，可能是因为叶中的分泌组织更为丰富的缘故[4]，具体原因值

得关注研究；α-蒎烯可以异构化并脱氢形成对伞花烃（具有祛痰和抗炎作用），同时α-蒎烯还可通过催化加氢生成蒎烷，再经生物转化反应生成芳樟醇[25,26]，瓜馥木挥发油中同时含有α-蒎烯、对伞花烃和芳樟醇，因此猜测在瓜馥木中可能含有某生物酶能将这几种化合物进行转化，值得进一步研究的价值。本研究属于代谢组学方法在中药质量研究方面的应用[27-29]，研究结果将为瓜馥木药材质量标准的科学制定和民间使用提供依据和借鉴，并为深入比较瓜馥木不同药用部位的药理作用及资源开发利用奠定基础。

致谢衷心感谢北京大学药学院生药学研究室刘广学老师在实验过程中所提供的指导和帮助。