基于HPLC-Q-TOF/MS 法分析马兜铃水煎剂化学成分的研究＊

尹 浩，陈烁吉，田小亭，龚祝南

（1.南京师范大学生命科学学院新药研发中心 南京 210046；2.中国科学院上海药物研究所 上海 201203）

马兜铃首载于《药性论》，《中华人民共和国药典》（2015 年版）收载其为马兜铃科植物北马兜铃Aristolochia contortaBge.或马兜铃Aristolochia debilisSieb.et Zucc.的干燥成熟果实。主要含有马兜铃酸类成分（主要为马兜铃酸I 及马兜铃酸II）和马兜铃内酰胺类成分，已被大量研究证实其具有肾毒性、致癌和致突变的毒副作用[1-3]。近年来，含马兜铃酸的中草药引起肾损害和癌症的相关文献报道较多[4-6]，其中2017年中国台湾和新加坡学者发表的“马兜铃酸及其衍生物与台湾及整个亚洲的肝癌患者广泛相关”的文章在中医药界引起了较大的影响[7]。

目前对马兜铃药材的研究主要集中在定量分析马兜铃“甲醇提取物”中马兜铃酸I-IV的含量[8-13]，却未有文献报道用质谱分析鉴定马兜铃“水煎剂”中的化学成分。因此，本研究首次采用高分辨质谱HPLC-Q-TOF/MS鉴定及半定量分析马兜铃“水煎剂”的化学成分，为后续马兜铃的毒性研究提供化学物质基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Aglient 1260 系列高效液相色谱（美国安捷伦公司）与带有双喷Jet stream 离子源的Agilent 6530 四级杆飞行时间（Q-TOF）质谱仪（美国安捷伦公司）联用；XS105DU 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Millipore Milli-Q纯水器（美国Millipore公司）；乙腈（质谱纯，Fisher公司）；甲酸（HPLC级，国药集团化学试剂有限公司）。

图1 马兜铃内酰胺I（A）和马兜铃酸I（B）的提取离子流图及多级质谱图

马兜铃药材购于上海康桥药业有限公司，经中国科学院上海药物研究所李志雄老师鉴定为马兜铃科植物马兜铃Aristolochia debilisSieb. et Zucc.的干燥成熟果实。马兜铃酸I（AAI）购于成都领航者生物技术有限公司，马兜铃内酰胺I（ALI）购于上海源叶生物科技有限公司，纯度大于等于98% 。

1.2 实验方法

1.1.1 色谱条件

色谱条件：色谱柱ACE Excel C18柱（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）；柱温40℃，流速0.35 mL/min；进样量：10 μL；流动相：0.1% 甲酸水溶液（A），0.1% 甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱条件：0-18 min（5% -95% B），18-20.5 min（95% -95% B），20.5-21 min（95% -5% B），21-25 min（5% -5% B）。

1.1.2 质谱条件

ESI离子源，质谱在正离子模式下检测，质谱参数优化结果如下：八级杆电压，65 V；毛细管电压，4 KV；毛细管出口电压，100 V；喷嘴电压，500 V；雾化气压力，35 psi；氮气流速，5 L/min；氮气温度300℃；鞘气流速，11 L/min；鞘气温度，350℃。数据采集使用auto MS/MS扫描方式，每一级质谱自动选择基峰离子作为下一级质谱的母离子进行碎裂；数据定性分析采用Agilent Technologies Masshunter Workstation Qualitative Analysis Software(Version.B.06.00)。

1.1.3 供试品溶液制备

取马兜铃药材100 g，加入2 L水，加热回流2 h，过滤得到滤液。药材中再加入1 L水，加热回流2 h，合并两次滤液，浓缩至100 mL。得1 g·mL-1马兜铃水煎剂，用95% 水（5% 乙腈）稀释100 倍，平行稀释3 份，涡旋，14000 rpm 4℃离心10 min，取上清液，即得供试品溶液。

1.1.4 对照品溶液的制备

取对照品马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I各2 mg，精密称定，置10 mL量瓶中加甲醇溶解，定容，摇匀，即得对照品溶液。

2 结果与分析

2.1 马兜铃水煎剂中化合物鉴定分析

Q-TOF-MS/MS 条件按照1.2.2 节方法进行了优化，按照上述的分析条件，马兜铃水煎剂中的化学成分可获得较好的分离与检测。首先，采用现有对照品马兜铃酸I 和马兜铃内酰胺I 对其高分辨质谱裂解规律进行解析。如图1所示，马兜铃内酰胺I的保留时间为12.86 min，马兜铃酸I 的保留时间为13.96 min。图2(A)所示，马兜铃内酰胺I 的准分子离子峰为m/z294.0753[M+H]+，在二级质谱中，该离子相继丢失CH3·和CO 形成碎片离子m/z279.0521 和m/z251.0582。图2（B）所示，马兜铃酸I的准分子离子峰为m/z359.0891[M+NH4]+，在二级质谱中，该离子先丢失NH3生成碎片离子m/z342.0571，进而碎片离子m/z342.0571 再分别丢失H2O，CO2和NO2生成碎片离子m/z324.0502，m/z298.0708和m/z296.0676。马兜铃内酰胺I和马兜铃酸I的质谱裂解途径如图2所示。

根据对照品马兜铃内酰胺I 和马兜铃酸I 的色谱保留时间和质谱信息，可以确定马兜铃水煎剂中化合物17和18分别是马兜铃内酰胺I和马兜铃酸I。由马兜铃内酰胺I 和马兜铃酸I 的质谱裂解规律推测马兜铃水煎剂中具有相同骨架结构的其它马兜铃酸和马兜内酰胺类成分，并结合各化合物的保留时间，精确分子量（误差在5 ppm 以内），二级碎片裂解信息及相关文献比对[14-17]，从而对马兜铃水煎剂中化学成分进行确认，共推测出18 个化学成分，其中6 个马兜铃酸类成分、7 个马兜铃内酰胺类成分、1 个生物碱类成分、2 个苯丙烯酸类成分，2个醌类成分（见表1）。

表1 马兜铃水煎剂中的主要化学成分

2.2 马兜铃酸和马兜铃内酰胺类成分的半定量分析

采用高分辨质谱积分峰面积对马兜铃水煎剂中6个马兜铃酸类成分和7个马兜铃内酰胺类成分进行半定量分析（图3）。质谱峰面积最高的的马兜铃酸类成分是马兜铃酸I，其余马兜铃酸类成分16,14,12,8,13的峰面积依次约为马兜铃酸I 的53.2% ，50.7% ，25.9% ，9.9% 和7.7% ；峰面积仅次于马兜铃酸I 的是马兜铃内酰胺III，其余6 个马兜铃内酰胺类成分10,15,17,7,9,4的峰面积依次为马兜铃内酰胺III 的77.4% ，61.8% ，57.9% ，23.6% ，17.6% ，16.6% 。其中，马兜铃酸类物质的总峰面积是马兜铃内酰胺类成分的1.23 倍，这表明马兜铃内酰胺类成分的含量在马兜铃药材中可能不容忽略。

图2 马兜铃内酰胺I（A）和马兜铃酸I（B）的质谱裂解途径

图3 HPLC-Q-TOF/MS检测马兜铃水煎剂（0.01 g•mL-1）中马兜铃内酰胺（A）和马兜铃酸（B）类成分峰面积及其化学结构

3 讨论

目前文献主要针对马兜铃甲醇提取液中马兜铃酸I 的定量检测[18]，而马兜铃药材的传统用法是水煎，但至今尚未有文献用质谱分析鉴定马兜铃水煎剂中化学成分，这导致无法全面认识马兜铃水煎剂的毒效物质基础。本实验在分析鉴定马兜铃水煎剂中马兜铃酸类和马兜铃内酰胺类化学成分时，马兜铃酸I 和马兜铃内酰胺I是通过对比标准品的色谱保留时间和质谱信息确定其化学结构。鉴于马兜铃酸类成分与马兜铃酸I，马兜铃内酰胺类成分与马兜铃内酰胺I 具有同样的化学结构骨架，这表示这些化合物会有类似的质谱裂解规律。因此，通过高分辨质谱HPLC-Q-TOF/MS 提供的马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I的二级碎片离子，可以推测出马兜铃酸类和马兜铃内酰胺类化学结构的质谱裂解规律，并在此基础上，结合文献中报道的马兜铃科药材植化分离的化学成分，通过高分辨质谱提供的质谱信息，推测出马兜铃水煎剂中含有6 个马兜铃酸类成分和7个马兜铃内酰胺类成分。

由于除了马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I，其他成分无法获得对照品，因此我们通过质谱峰面积法对这13个化合物进行了半定量分析，以便于初步了解马兜铃水煎剂中化学成分的含量。在接下来的工作中，我们将会根据本次实验中这些成分的半定量结果，有针对性的分离马兜铃水煎剂中马兜铃酸和马兜铃内酰胺类成分，并通过质谱、核磁等波谱技术明确其化学结构，并将分离纯化得到的化合物作为标准品，对不同批次的马兜铃水煎剂中这些成分进行绝对含量测定，并且对这些成分进行体内外毒性筛选，明确阐明马兜铃水煎剂的毒性物质基础。

4 总结

本实验运用HPLC-Q-TOF/MS 技术对马兜铃水煎剂的化学成分进行了研究，通过高分辨质谱提供的准确分子量及碎片裂解信息，分析了马兜铃酸和马兜铃内酰胺类成分代表化合物马兜铃酸I 和马兜铃内酰I的质谱裂解规律，并且在马兜铃水煎剂中分析鉴定出18个化学成分，其中主要为马兜铃酸类和马兜铃内酰胺类成分（共13 个）。目前从天然植物中至少分离得到178 种马兜铃酸类物质，其中77种有体内毒性的相关报道[5]。马兜铃酸I和马兜铃酸II被认为是马兜铃属植物致癌和肾脏毒性的主要化学成分[19-21]，其产生毒性的原因是可以在体内代谢生成毒性代谢产物马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺II[22]。

鉴于本实验在马兜铃水煎剂中不仅检测到了马兜铃酸I和II，而且在马兜铃水煎剂中直接检测到了马兜铃内酰胺I 和II。说明马兜铃属植物致癌和肾脏毒性的化学成分可能并不只是文献中报道的马兜铃酸I和II及其代谢生成的马兜铃内酰胺I和II，还有可能是由马兜铃水煎剂中马兜铃内酰胺I和II直接吸收进入体内导致造成的。同时，除了上述4个成分，我们还在马兜铃水煎剂中检测到了其它4 个马兜铃酸类成分及5个马兜铃内酰胺类成分，这些成分非常可能在动物口服马兜铃水煎剂后直接吸收或者代谢成有毒性的马兜铃内酰胺类成分。这提示我们在今后马兜铃属药材的毒性研究中，不应只关注马兜铃酸I 和II，还应关注马兜铃中其它马兜铃酸和马兜铃内酰胺类成分与其肝肾毒性的关系。

因此，本实验首次用高分辨质谱分析鉴定了马兜铃水煎剂中的马兜铃酸类和马兜铃内酰胺类成分，可为下一步马兜铃水煎剂成分的植化分离和毒性筛选提供借鉴。