右归丸对激素抵抗型肾病综合征大鼠肾脏组织中JNK/p38信号通路的影响＊

时间：2024-07-28

王新斌，戴恩来，薛国忠，吕娟，陈威辛

（甘肃中医药大学中西医结合学院兰州 730000）

激素抵抗型肾病综合征（steroid- resistant nephrotic syndrome，SRNS）是指经规范化激素治疗无效的肾病综合征，属于难治性肾病综合征（refractory nephrotic syndrome，RNS）的一种类型[1]，是临床慢性肾脏病中治疗最为棘手，预后较差的病种。尽管对SRNS 从B 淋巴细胞抑制、抑制纤维化、基因突变等角度的治疗有了一定的进展，但临床疗效仍不尽如人意，且副作用堪忧，故进一步探究SRNS 发病机制，寻找新型药物治疗具有重要的临床意义。JNK、p38为丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族成员，研究显示，激活JNK/p38 信号通路后，可诱导肾组织纤维细胞增生，加重肾间质损伤，导致肾间质纤维化、肾衰竭，提示JNK/p38信号通路可能为SRNS 潜在治疗靶点[2-3]。右归丸是由炮附片、熟地黄、肉桂、酒萸肉和山药等中药组成，具有填精止遗、温补肾阳之功效，临床用于治疗慢性肾衰、肾病综合症等肾病[4]。本研究通过建立SRNS 动物模型，给予右归丸干预，旨在探究右归丸对SRNS 大鼠肾组织的保护作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级Wisar 大鼠60 只，雄性，8 周龄，体重（200±10）g，由甘肃中医药大学科研实验中心提供，动物合格证号：6200100000025，许可证号：SCXK（甘）2015-0002。动物饲养于SPF实验中心，室温22℃，辐照灭菌SPF级大鼠饲料喂养，给药前禁食12 h，自由饮水。

1.2 药物

阿霉素（AD，Solarbio，批号17C024，规格：25 mg/支）；醋酸泼尼松片（浙江仙据制药股份有限公司，批号170146，规格：5 mg/片）；右归丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号170528规格：9 g/丸），药物成分：绿原酸、莫诺苷松、脂醇二葡萄糖苷、马钱苷、阿魏酸、肉桂酸（见图1）。

1.3 主要试剂及仪器

肌酐检测试剂盒（批号:YZB/GER2659-2018）；尿素氮检测试剂盒（批号:YZB/GER0315-2018）；总蛋白检测试剂盒（批号:YZB/GER3253-2018）；白蛋白检测试剂盒（批号:YZB/GER1029-2018）；甘油三酯检测试剂盒（批号:YZB/GER5264-2018）；胆固醇检测试剂盒（批号:YZB/GER1324-2018）均购自Roche Diagnostics GmbH 公司；Masson 染色试剂盒（货号：G1340）购于美国Solarbio 公司；PAS 染色试剂盒（货号：DG0007）购自北京雷根生物技术有限公司；HE 染色试剂盒（货号：C0105）购自碧云天生物技术公司；兔抗鼠Caspase-3（ab179517）、Bcl-2（ab185002）、Bax（ab53154）、β-actin（ab179467）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β,TGF-β1)（ab92486）、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)（ab231824）单抗抗体购于英国Abcam 公司；p-JNK（AF1205）、JNK（MAB1387）、p-p38（AF8691）、p38（MAB8691）、HRP标记二抗（HAF007）购于美国R&D 公司；光学显微镜（日本Olympus 公司，型号CX41）；全自动生化仪（上海科华卓越生物工程股份有限公司，型号：450）；凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司，型号：Gel Doc XR+）。

图1 HPLC色谱图

1.4 实验分组与给药

1.4.1 模型制备

将60 只雄性SPF 级Wisar 大鼠适应性饲养1 周，随机分为正常组（10 只）和造模组（50 只）。参照文献法[5]，建立激素抵抗型肾病综合征大鼠模型，造模组大鼠一次性尾静脉注射阿霉素（6 mg·kg-1）建立激素抵抗型肾病综合征大鼠模型，大鼠尾部未发生肿胀、迂曲，表明注射成功；正常组（Control）大鼠注射等剂量生理盐水。

1.4.2 动物给药

造模成功后采用随机数字表法分为模型组、激素治疗组（泼尼松片，Prednisone）、激素联合右归丸低、中、高组（TL、TM、TH），每组10 只大鼠。依据人与大鼠体表面积换算法计算用药量。Control 组和Model组：给予等体积生理盐水灌胃；Prednisone 组：给予泼尼松片混悬液灌胃，剂量为6.3 mg·kg-1·d-1；Prednisone联合右归丸低、中、高剂量组：给予泼尼松混合右归丸的混悬液灌胃,剂量分别为6.3/11600mg·kg-1·d-1、6.3/5600 mg·kg-1·d-1、6.3/2800 mg·kg-1·d-1，连续6周。

1.5 样本采集、处理

给药2周、4周、6周，收集大鼠24 h尿液，3000 g离心5 min 后，收集上清液，用于检测24 h 尿蛋白量。末次治疗结束后，将大鼠麻醉处死，收集血液5000 g，离心5 min，收集上清，在-80℃中保存；收集肾组织，平均分为2 部分，一部分置于4%多聚甲醛中固定，常规制备石蜡切片，用于病理观察以及免疫组化检测；一部分保存于-80℃用于蛋白检测。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 大鼠一般状态

给药期间，观察大鼠毛发、进食量、精神、大便、体重情况等。

1.6.2 血清中血脂、肾功能相关指标检测

参照试剂盒检测血清中肌酐（Serum creatinine，Scr）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、总蛋白（Total protein，TP）、白蛋白（Albumin，ALB）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、胆固醇（Total Cholesterol，TC）水平，具体参考试剂盒说明书进行操作，于自动生化检测仪进行测定。24 h 尿蛋白量采用邻苯三酚红/钼酸盐比色法检测。

1.6.3 肾组织病理形态学检测

肾组织经洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后行HE、PAS、Masson 染色，光学显微镜下观察肾脏的病理形态学变化。采用半定量积分法对肾组织损伤情况进行评定，主要从肾小球硬化程度、肾小管间质损伤程度方面进行评分，每个大鼠至少评价20 个肾小球（皮质区域），每项评分为0 ～4 分，评分越高代表损伤越严重。Masson 染色：胶原纤维染色为蓝色，肌纤维染色为暗红色，采用IPP6.0 分析Masson 染色胶原纤维面积比，胶原纤维比例=染蓝区域面积/总面积×100%。

1.6.4 TUNEL原位凋亡检测肾组织细胞凋亡情况

制备肾组织冷冻切片，50 µL 蛋白酶K，37℃孵育20 min，加入Tunel反应液，于37°C的加湿室中孵育1 h，PBS 缓冲液清洗后，添加过氧化物酶结合抗体在37°C孵育1 h，DAB 染色后用苏木精复染，脱水、封片后，在显微镜下观察细胞凋亡情况，凋亡细胞核染色呈棕色。用Image-J 软件定量分析细胞凋亡率，细胞凋亡率（%）=棕色细胞数/细胞总数×100%。

1.6.5 免疫印迹法检测肾组织中JNK/p38 信号通路、凋亡蛋白表达

取适量肾组织，添加RIPA裂解液冰上反应30 min，提取肾组织总蛋白，BCA 检测蛋白含量，取50ug 蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳，转移至PVDF 膜上，封闭后加入兔抗鼠TGF-β1、CTGF、Caspase-3、Bcl-2、Bax、βactin、p-JNK、JNK、p-p38、p38 一抗（1:500），4℃摇床孵育过夜，PBS 缓冲液清洗后，，加入HRP 标记二抗孵育膜（1:5000），清洗后，于膜上加入ECL 反应液5 min后进行曝光、显影，用凝胶成像仪采集、保存图像，以β-actin 为内参，采用Image-J 软件定量分析各蛋白相对表达量。

1.7 统计学分析

本研究数据采用SPSS 22.0软件进行分析，计量资料以平均数±标准差（±s）描述，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两对比采用SNK-q 检验，当P<0.05时，则差异具有统计学意义。

表1 各组大鼠体重变化情况比较（±s，g）

注：与Control 组比较，*P < 0.05；与Model 组比较，△P < 0.05；与Predni‑sone组比较，▲P<0.05

给药6周370.2±12.93 251.2±8.45*254.9±2.47*263.2±6.86△▲*260.9±5.37△▲*267.3±5.28△▲*组别Control组Model组Prednisone组TL组TM组TH组N 10 8 10 9 10 10给药2周290.34±11.1 230.62±7.83*233.0±.5.78 232.87±9.36 235.86±4.25 239.65±4.39给药4周320.26±12.46 245.38±7.15 252.33±4.06△*257.42±7.36△▲*259.37±5.57△▲*263.92±4.93△▲*

表2 各组24 h尿蛋白量比较(±s，mg)

注：与Control 组比较，*P < 0.05；与Model 组比较，△P < 0.05；与Predni‑sone组比较，▲P<0.05

用药后6周5.32±1.34 181.64±5.49*175.27±7.39*37.09±5.41▲△*35.23±4.14▲△*38.2±6.77▲△*组别Control组Model组Prednisone组TL组TM组TH组N 10 8 9 9 1 0 10用药后2周5.15±1.29 150.31±3.54*142.20±3.95*83.41±3.47▲△*92.10±2.13▲△*87.76±2.07▲△*用药后4周4.75±1.13 175.27±4.52*170.34±6.98*57.60±5.23▲△*61.38±5.40▲△*59.65±6.27▲△*

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

Control 组大鼠精神状态良好，反应灵敏，毛发光滑发亮，进食正常。造模后第7 d 大鼠出现尿量减少并伴有少量的腹水，精神状态日渐萎靡，进食减少，体重下降。1-2 周大鼠腹水显著增多，24 h 尿蛋白增多；大鼠出现嗜睡、反应迟钝，有弓背耸肩现象，蜷卧少动，体毛发灰发暗，大便稀溏等体征。Control 组无大鼠死亡；Model组2只大鼠因腹水、进食减少死亡，死亡率20%（2/10）。TL 组、TM 组、TH 组各有1 只因腹水、体重下降而死亡，Prednisone 组1 只死亡。与Model 组相比，TL 组、TM 组、TH 组、Prednisone 组大鼠活跃度增加，精神好转，毛发渐有光泽。随着给药时间的延长，大鼠体重逐渐增加，给药2周，与Control组相比，Model组体重降低；给药4 周、6 周，与Model 组、Prednisone 组相比，TL 组、TM 组、TH 组组体重升高，差异均有统计学意义（P<0.05）（见表1）。

2.2 各组大鼠尿蛋白定量变化

与Control组相比，Model组24 h尿蛋白量升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与Model、Prednisone 组相比，TL 组、TM 组、TH 组24 h 尿蛋白量降低，差异有统计学意义P<0.05）（见表2）。

表3 各组血清肾功能、血脂水平比较（±s）

注：与Control组比较，*P<0.05；与Model组比较，△P<0.05；与Prednisone组比较，▲P<0.05

LDH（U/L）48.65±8.91 85.82±9.68*78.36±5.03*64.42±4.22*△▲60.18±5.09*△▲57.65±6.91*△▲组别Control组Model组Prednisone组TL组TM组TH组N 10 8 9 9 1 0 10 TP/（g/L）69.75±1.85 46.33±2.12*44.55±2.97*55.47±1.78*△▲56.35±2.27*△▲57.51±3.89*△▲ALB/（g/L）47.76±1.96 20.62±3.97*23.54±2.95*37.23±2.18*△▲36.45±3.15*△▲38.62±4.71*△▲TC/(mmol/L)0.94±0.23 1.67±0.34*1.45±0.19*1.18±0.17*△▲1.32±0.16*△▲1.16±0.40*△▲TG/(mmol/L)1.07±0.34 2.74±0.47*2.96±0.46*1.65±0.17*△▲1.76±0.12*△▲1.57±0.15*△▲Scr/(mmol/L)36.10±2.55 96.5±4.55*95.10±2.13*76.10±1.62*△▲77.41±2.17*△▲75.87±2.58*△▲BUN/(mmol/L)7.90±1.36 17.47±1.23*16.90±1.37*12.37±0.90*△▲12.60±1.31*△▲11.81±0.52*△▲

图2 HE染色观察肾组织病理形态学变化（200×）

2.3 各组血清血脂、肾功能有关指标变化情况

与Control 组相比，Model 组TP、ALB 水平降低，TC、TG、Scr、BUN、LDH 水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与Model、Prednisone 组相比，TL 组、TM组、TH组血清TP、ALB水平升高，TC、TG、Scr、BUN、LDH水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）（见表3）。

2.4 HE染色检测大鼠肾脏病理形态学

Control 组肾小球、肾小管基本正常，球内毛细血管结构清晰；Model 组肾小球囊粘连，细胞增生明显，周围间质内较多炎细胞浸润，毛细血管内呈均质状透明样变，肾小管上皮细胞变性，管腔内均有透明管型。经激素及与右归丸联合治疗后肾小球、肾小管损伤得到一定的改善，病理损伤程度减轻。与Control 组相比，Model 组肾小球硬化评分、肾小管间质损伤评分、胶原纤维比例升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与Model、Prednisone 组相比，TL 组、TM 组、TH 组肾小球硬化评分、肾小管间质损伤评分、胶原纤维比例降低，差异有统计学意义（P < 0.05）（见图2、图3、图4和表4）。

2.5 肾组织细胞凋亡情况

与Control 组相比，Model 组肾组织细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与Model、Prednisone组相比，TL 组、TM 组、TH 组肾组织凋亡率降低，差异有统计学意义（P<0.05）（见图5、表5）。

2.6 肾脏组织中纤维化蛋白表达情况

与Control 组相比，Model 组TGF-β1、CTGF 蛋白表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与Model、Prednisone 组相比，TL 组、TM 组、TH 组TGF-β1、CTGF蛋白表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05）（见图6、表6）。

2.7 肾脏组织中JNK/p38信号通路蛋白表达情况

与Control 组相比，Model 组JNK、p38 蛋白磷酸化水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与Model、Prednisone 组相比，TL 组、TM 组、TH 组JNK、p38 蛋白磷酸化水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）（见图7、表7）。

2.8 肾脏组织中凋亡蛋白表达情况

图3 Masson染色观察肾组织病理形态学变化（200×）

图4 PAS染色观察肾组织病理形态学变化（200×）

图5 Tunel联合免疫组化检测肾组织凋亡情况（100×）

表4 各组肾组织损伤评分比较（±s）

注：与Control 组比较，*P < 0.05；与Model 组比较，△P < 0.05；与Predni‑sone组比较，▲P<0.05

胶原纤维比例/%2.16±0.53 58.33±6.49*52.98±7.32*41.87±6.13*△▲38.63±5.41*△▲36.48±4.22*△▲组别Control组Model组Prednisone组TL组TM组TH组N 10 8 9 9 1 0 10肾小球硬化评分0.24±0.03 2.79±0.53*2.58±0.75*1.43±0.42*△▲1.52±0.34*△▲1.59±0.46*△▲肾小管间质损伤评分/分0.41±0.05 3.26±0.54*3.14±0.59*1.76±0.35*△▲1.68±0.34*△▲1.55±0.26*△▲

表5 各组肾组织凋亡率比较（±s，%）

注：与Control 组比较，*P < 0.05；与Model 组比较，△P < 0.05；与Predni‑sone组比较，▲P<0.05

凋亡率3.61±0.88 37.66±4.39*34.42±4.83*25.76±2.36*△▲24.44±2.93*△▲22.13±2.85*△▲组别Control组Model组Prednisone组TL组TM组TH组N 10 8 9 9 1 0 10

图6 免疫印迹法检测肾脏组织中TGF-β1、CTGF信号通路蛋白表达

表6 各组肾组织中TGF-β1、CTGF信号通路蛋白表达比较（±s）

注：与Control 组比较，*P < 0.05；与Model 组比较，△P < 0.05；与Predni‑sone组比较，▲P<0.05

CTGF/β-actin 0.24±0.05 0.91±0.12*0.86±0.09*0.52±0.06*△▲0.34±0.04*△▲0.31±0.03*△▲组别Control组Model组Prednisone组TL组TM组TH组N 10 8 9 9 1 0 10 TGF-β1/β-actin 0.12±2.39 1.82±0.41*1.64±0.39*0.73±0.08*△▲0.35±0.04*△▲0.33±0.03*△▲

与Control 组相比，Model 组Caspase-3、Bax 蛋白表达升高，Bcl-2 蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与Model、Prednisone 组相比，TL 组、TM 组、TH组Caspase-3、Bax 蛋白表达降低，Bcl-2 蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）（见图8、表8）。

图7 免疫印迹法检测肾脏组织中JNK/p38信号通路蛋白表达

表7 各组肾组织中JNK/p38信号通路蛋白表达比较（±s）

注：与Control 组比较，*P < 0.05；与Model 组比较，△P < 0.05；与Predni‑sone组比较，▲P<0.05

N 10 p-p38/p38 0.38±0.05 1.14±0.23*1.06±0.18*0.76±0.14*△▲0.69±0.03*△▲0.65±0.05*△▲组别Control组Model组Prednisone组TL组TM组TH组8 9 9 1 0 10 p-JNK/JNK 0.31±0.03 1.05±0.16*0.97±0.12*0.48±0.06*△▲0.41±0.04*△▲0.45±0.06*△▲

图8 免疫印迹法检测肾脏组织中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达情况

表8 各组肾组织凋亡蛋白表达比较（±s）

注：与Control 组比较，*P < 0.05；与Model 组比较，△P < 0.05；与Predni‑sone组比较，▲P<0.05

10组别Control组Model组Prednisone组TL组TM组TH组N Bcl-2/β-actin 1.38±0.14 0.21±0.06*0.43±0.08*0.61±0.07*△▲0.43±0.08*△▲0.32±0.03*△▲10 8 9 9 1 0 Caspase-3/β-actin 0.32±0.04 1.34±0.19*1.18±0.14*0.76±0.09*△▲0.73±0.07*△▲0.74±0.08*△▲Bax/β-actin 0.86±0.11 1.17±0.13*0.75±0.07*0.51±0.08*△▲0.38±0.05*△▲0.25±0.02*△▲

3 讨论

阿霉素为癌症化疗药物，能够从DNA 水平干预足突细胞DNA 生成，导致足突细胞变异，引发肾细胞损伤；此外，阿霉素还能够诱发肾小球上皮细胞发生脂质过氧化反应，破坏肾小球滤膜结构，形成蛋白尿，是目前肾病综合征动物模型常用的化学药物[6]。既往学者采用阿霉素制备肾病综合征大鼠发现大鼠出现大量蛋白尿，肾水肿、高血脂等肾病综合征典型特征[7]，与临床人肾病综合征临床表现相似。本研究采用一次性尾静脉注射阿霉素后，经HE 染色发现与Control组相比，Model 组大鼠肾小球、肾小管发生明显病理损伤，肾组织损伤评分升高，胶原纤维比例升高，24 h 尿蛋白含量明显升高，血清学检测发现大鼠血清TP、ALB 水平降低，TC、TG、Scr、BUN、LDH 水平升高，纤维化蛋白TGF-β1、CTGF 表达升高，进一步表明大鼠蛋白代谢、脂代谢异常、肾功能发生障碍，与肾综合征大鼠模型制备结果相似[8]，提示SRNS 大鼠模型复制成功。

在肾病发生过程中，会发生“溺毒”“肾劳”“肾风”等情况，患者主要表现为正虚邪实，因此中医认为，脾肾阳虚是肾综合征疾病的治疗目的。右归丸出自《景岳全书》，属于补肾代表方，临床药理学研究显示其能够缓解哮喘、增强机体免疫力，改善大鼠边缘系统等[9]。熊霞等[10]研究发现，右归丸能够降低肾衰竭患者血清中BUN 肾功能指标水平，改善肾功能并提高免疫力，降低炎症反应，进而缓解病情进展。于化新等[11]研究发现，右归丸可降低肾衰大鼠血清中Scr、BUN 水平，改善肾损伤，延缓肾衰的发生。上述研究说明，右归丸对肾病具有一定的缓解作用。本研究显示，经Prednisone 治疗后大鼠肾组织损伤、血清蛋白、脂代谢指标变化并不显著，而经Prednisone 联合右归丸治疗后，病理学检测发现肾小球、肾间质损伤得到一定的改善，血清TP、ALB 水平升高，TC、TG、Scr、BUN、LDH水平、纤维化蛋白TGF-β1、CTGF 表达降低，提示右归丸能够缓解SRNS 大鼠肾功能损伤，改善脂代谢、蛋白代谢。

MAPK 信号通路在细胞增殖、分化、应激、炎症等生理病理过程调控中发挥重要作用，JNK、p38 为通路主要成员，研究发现，在肾纤维化进展中，受到炎症刺激等可激活p38，使其发生磷酸化，且p38 磷酸化水平与氧化应激程度、纤维化程度密切相关[12-13]。Huang等[14]研究发现，激活Hk-2细胞中JNK信号通路后能够加速LPS 诱发的急性肾损伤。Yoon 等[15]研究发现，外源性cgrp 通过调控肾近端小管细胞中的cgrp 受体/pkc/jnk 信号通路，进而加速肾小管纤维化的方发生。Wang 等[16]研究发现，抑制JNK/p38 MAPK 信号通路和干扰氧化应激反应减轻大鼠肾缺血再灌注损伤，保护肾功能。本研究发现，与Control组相比，Model组大鼠肾组织中p38、JNK 蛋白磷酸化水平明显升高，推测JNK/p38 信号通路可能与SRNS 的发生有关。陈叶香等[17]研究发现右归丸通过抑制TGF-β1 诱导的EMT 过程进而缓解肾间质纤维化。本研究发现，经Prednisone联合右归丸治疗后，大鼠肾组织中p38、JNK蛋白磷酸化水平明显降低，提示右归丸对SRNS 大鼠肾功能的恢复可能是通过对JNK/p38信号通路的抑制来实现的。

肾组织细胞凋亡伴随着肾病发生发展，存在肾病的损伤及修复过程中。本研究通过采用Tunel 染色检测SRNS肾组织细胞凋亡情况，结果发现，与Control组相比，Model 组、Prednisone 组大鼠肾组织细胞凋亡率明显增加，经右归丸干预后，细胞凋亡率明显降低，推测右归丸具有抗肾组织细胞凋亡的作用。Bax、Bcl-2蛋白是研究较多的凋亡蛋白，研究证实Bax/Bcl-2 通路参与肾组织细胞凋亡[18]，而Caspase-3是细胞凋亡的最终执行者[19]。本研究发现，与control 组相比，Model组肾组织中Caspase-3、Bax 蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达降低，经右归丸干预后，肾组织中Caspase-3、Bax 蛋白表达显著降低，Bcl-2 蛋白表达降低升高，推测右归丸可通过降低肾细胞凋亡进而发挥对肾脏的保护作用。

综上所述，右归丸能够缓解SRNS 大鼠肾组织损伤，保护肾功能，其可能是通过抑制Jnk/p38 信号通路，降低肾细胞凋亡实现的，然而，SRNS 发病机制较复杂，右归丸是否还可能通过其他途径发挥作用，还有待后续深入研究。