内异方对子宫内膜异位症大鼠的治疗作用以及对异位内膜VEGF、HIF-1α、NF-κB和PTEN表达的影响＊

李 潇，刘阳阳，周艳艳，张白云，周俊英

（河南中医药大学第二附属医院妇产科 郑州 450002）

当子宫内膜腺体和间质等组织出现在子宫内膜以外的子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的其他部位时，称为子宫内膜异位症（endometriosis，EM）[1]。流行病学调查[2-3]发现在育龄妇女中的发病率高达10%-15%，在伴有盆腔疼痛的育龄妇女中可达50%，且在EM 患者中约有30%-40%发生不孕现象。另外研究[4]发现，近年来EM 呈逐年升高的趋势。再者，EM 具有转移，浸润，侵袭等恶性生物学行为，且容易发生恶变[5]。

一是多层次地推进城镇化金融支持体系建设。首先全产业全体系的金融机制需要将现有的各类金融机构、城镇基础设施及相关配套进行合理纳入。充分发挥国家层面的政策导向作用，通过引导政策性银行等金融机构创设种类更加丰富的金融业务，尤其是低息业务贷款。试点工作可以提供新的发展模式，在城镇化率较高的区域率先推广试点金融创建模式。对金融机构而言，需重视环境带来的投融资变化。其次需重视民间资本的合理引入。市场化改革表现为资本的多样化并存，民间资本的代入有利于金融市场的健康发展。但也需要通过专业的民间资本借贷机构对其行为进行合法化监管。

设P点可以接收到m个信标节点的信号,将m个信标节点以3个不共线的为一组分组,假设一共有k组。通过第1部分的数学模型可以计算出k个P点的坐标值,分别是(xP1,yP1),…,(xPk,yPk)。这k个坐标值即LOGGWO算法的部分初始值,通过算法寻优得到未知节点P的优化坐标。设改进灰狼优化算法的种群大小为N。若k≥N,则选用根据适应度值从小到大选取前N个作为初始值;若k

针对田间杂草，除杂草种类及农药安全施用外，同时应结合种植区域地理条件及种群选择施药。如来自不同地理种群条件下，节节麦呈现出不同甲基二磺隆耐药性，野芥菜对同浓度草甘膦呈现敏感型和耐受型2种不同表型[36-37]，田间杂草并不茂盛时，可选择人工摘除。

目前，临床上一般采取传统的化学药物与手术联合治疗[6]EM，但传统的化学药物副作用大，且疗效不显著，手术治疗后极易复发[7]。因此，寻找有效的药物对提高EM 患者的身心健康具有重要的意义。中医认为EM 的主要病机是痰瘀互结，常采用祛瘀散结，理气化痰的治疗方案[8]。内异方中炙鳖甲软坚散结，干漆，血竭，赤芍与香附活血祛瘀，行气止痛，牛膝，桂枝温通经脉，逐瘀，诸药合用，起到祛瘀活血，调节气机，使得气血津液正常运行。已有多篇文献[9-11]表明内异方在临床上对EM 具有疗效，但并未对其作用机制进行研究。本实验通过子宫内膜自体移植法建立EM 大鼠模型，观察内异方对EM 大鼠的异位内膜病理学结构改变、促炎因子IL-6和IL-8的分泌以及异位内膜组织VEGF、HIF-1α 和NF-κB 蛋白表达的影响。本研究不但从一个全新的角度（炎性和缺氧微环境的角度）阐明了内异方对EM 大鼠的改善作用，还为EM 进一步加快运用于临床治疗EM提供了一定的实验基础。

里帕的借鉴方式简单直接：如拟人形象“友谊”（方案D），他说“一个瞎子背着一个瘸子行路”的形象来表现“友谊”主题，是出自阿尔恰托的描述：“他在一个瞎子的背上，用声音领路。所以两人组合在一起意味着，一个提供视力一个提供脚力”。㉖

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

成年未孕SD 大鼠共45 只，雌性，清洁级，9-10 周龄，体重190-210 g，购自河南省实验动物中心[SCXK（豫）2017-0001]，饲养于河南省中医院中心实验室动物房[SYXK（豫）2016-0009]中，温度维持在20-25 ℃，相对湿度为50%-65%，光照黑暗各12 h，自由摄取食物与水，进行适应性饲养2 周。动物实验获得河南省中医院实验动物伦理委员会的批准（伦理审查证号：2017-28），本实验完全遵循国家实验动物福利伦理的相关规定，符合动物保护、动物福利和伦理原则。

1.1.2 实验药物

内异方（组方构成：当归9 g、丹参12 g、赤芍9 g、制香附9 g、血竭3 g、川牛膝9 g、桂枝3 g、炙鳖甲9 g、皂角刺12 g、干漆4.5 g、茯苓12 g、海藻9 g）购于河南省中医院中药房，制成每毫升相当于原生药2 g 的水煎剂，并浓缩水煎剂至每2 mL相当于成人用量。达那唑胶囊（批号：20160814）购自江苏联环药业股份有限公司，除掉胶囊壳后，将粉末与生理盐水制成混悬液。

1.1.3 主要试剂与仪器

核转录因子-Kappa B（nuclear factor-Kappa B,NF-κB）单克隆抗体、第10 号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）多克隆抗体、β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记免疫球蛋白（immunoglobulin G，IgG）（H + L）抗体购自美国Cell Signaling techonology 公司；低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）单克隆抗体、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体购自美国Abcam 公司；IL-6和IL-8 ELISA 试剂盒购自购自南京森贝伽生物科技有 限 公 司 ；放 射 免 疫 沉 淀 法（Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解液购自北京普利莱公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天公司。CUT4062 型手动切片机购自德国SLEE 公司；EG1150H 型包埋机购自德国Leica 公司；BX51 型正置荧光显微镜、DPBSW 型全自动图像分析系统购自日本Olympus 公司；ELX800型酶标仪购自美国Bio-TEK公司。

1.2 实验方法

本实验采用子宫内膜自体移植法建立EM 大鼠模型，入组共45 只大鼠，其中2 只在造模过程中死亡，3只大鼠造模失败。假手术组纳入10 只大鼠，其余30只大鼠可明显观察到移植物与透明囊肿，表示造模成功，总造模成功率88.89%。

最后，中国近现代史基本问题研究还应该对中国近现代史研究中的成果进行借鉴，这两者在学科的研究上属于相通的，所以应该对这两个学科之间的关系进行协调处理，通过统筹规划，来对二者进行整体上的规划，以中共党史学科为主要的基础，来对这两个学科进行组建，并以中共党史研究队伍为基本力量，[1]48为两门学科的发展提供保障。

1.2.2 实验分组

大鼠按照1.2.1 方法进行EM 造模。同时选取10只大鼠不进行切除子宫段和自体子宫内膜移植，其他手术方式同EM 造模手术；此大鼠作为假手术组。在EM 造模3 周后，腹腔注射10%水合氯醛（2.5 mL·kg-1）麻醉大鼠，采用仰卧位方式固定并开腹观察移植物的生长情况。造模成功判定标准：移植物体积增大，出现液体积聚，积液深度≥2 mm，移植物镜检有子宫内膜上皮、间质细胞与腺体。取EM 造模成功的大鼠，逐层关腹，术后分笼常规喂养，术后腹腔注射硫酸庆大霉素，0.1 mL/天，共3 天。然后，随机将EM 造模成功的大鼠分为3个亚组，即模型组、内异方治疗组和阳性对照组，每组10 只大鼠。最后，假手术组和模型组大鼠给予生理盐水2 mL/天灌胃，内异方治疗组给予内异方水煎剂浓缩液2 mL/天灌胃，阳性对照组给予达那唑0.072 mg/kg/天（达那唑混悬液2 mL/天）灌胃，各组连续给药4周。

采用ELISA 试剂盒分别检测子宫内膜异位组织或假手术组同位置的内膜组织中IL-6 和IL-8 水平。收集子宫内膜异位组织或假手术组同位置的内膜组织样品，按照试剂盒说明书步骤对样品蛋白进行萃取、定量后，将每样品按100µl/孔加入已包被IL-6 和IL-8 抗体96 孔的酶标板中，室温孵育60 min；之后分别加入100µl/孔生物素标记的二抗稀释液，室温孵育60 min；洗板后，加入100µL/孔亲和素-过氧化物复合物稀释液，室温孵育45 min；洗板后，加入100µL/孔显色液，37℃避光反应15 min；最后加入100 µL/孔终止液。在酶标仪450 nm波长下测定OD值。然后根据预制的浓度曲线计算组织中IL-6和IL-8的水平。

1.2.4 ELISA检测炎性因子分泌

采用Western blot法检测模型组、内异方治疗组和阳性对照组的异位内膜组织或假手术组同位置的内膜组织中VEGF 和HIF-1α的蛋白表达水平，结果如图2 所示：与假手术组相比，模型组大鼠异位内膜组织中VEGF 和HIF-1α 蛋白表达水平均显著增高，差异均有统计学意义（均P<0.05）；与模型组相比，内异方治疗组与阳性对照组大鼠异位内膜组织中VEGF 和HIF-1α 蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；与阳性对照组相比，内异方治疗组大鼠异位内膜组织中VEGF 和HIF-1α蛋白表达均稍低，但差异不具有统计学意义（均P > 0.05）。以上结果说明，内异方能抑制EM 大鼠的异位内膜组织中VEGF 和HIF-1α的蛋白表达。

1.2.3 HE染色

当然，我提这个建议主要是让自己脱颖而出，写诗虽然不会，背诗总会吧。纳兰性德、仓央嘉措，“一生一世一双人”、“你来或者不来，爱就在那里，不离不弃”哇哈哈，随便拿几首出来就能镇住她们。我在心里乐颠颠地打着如意小算盘。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达

称取50 mg异位内膜组织或假手术组同位置内膜组织，并在冰上剪碎，加入预冷RIPA 裂解液，冰浴上匀浆。在4℃条件下，10000 r·min-1离心20 min，收集总蛋白上清液。总蛋白经BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量后，调整蛋白终浓度为4.0 mg·mL-1，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。恒压电泳80 min后，蛋白经电转移至PVDF膜。将PVDF膜完全浸入封闭液，轻摇60 min 后，在4℃条件下孵育一抗[（稀释比例为1∶1000）VEGF、HIF-1α、PTEN、NF-κB 和β-actin 抗体]过夜。TBST 洗膜3 次后，孵育二抗[（稀释比例为1∶1000）HRP 标记IgG（H + L)抗体]，室温孵育30 min，TSBT 洗膜3 次，将ECL 超敏发光液倾入膜上，曝光，显影，自来水冲洗晾干。扫描胶片，并用Image J 1.41 软件计算条带灰度值。目标蛋白的相对表达量=目标蛋白灰度值/内参β-actin灰度值。

2 统计学分析

使用SPSS17.0 对实验数据进行统计学分析，所有计量资料均采用平均值±标准差（±s）表示，多组间计量资料俩俩比较采用单因素方差分析的post-hoc test Bonferroni-t检验，以P<0.05为差异有显著性。

3 结果

3.1 EM造模情况

1.2.1 EM大鼠模型建立

实验过程依据实验动物使用的3R 原则对实验动物给予人道主义关怀。根据文献[12]描述的方法：选择已经经过连续2 个正常动情周期的大鼠，在第3 个动情期开始时，依据子宫内膜自体移植法建立EM 大鼠模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（2.5 mL·kg-1）麻醉后，采用仰卧位方式固定，于尿道口上约1 cm 处垂直正中纵切开，分离左侧子宫，近端离子宫角1 cm 处结扎，远端离卵巢2 cm 处结扎，并结扎中间的子宫系膜血管，切除约1.5 cm 的子宫段，放入灭菌生理盐水玻璃皿中，纵切开子宫腔，分离子宫内膜组织，修剪为5 mm×5 mm的小块，并将修剪的内膜组织用可吸收线固定四角缝合种植于腹壁血管丰富处，腹腔内放置庆大霉素0.4 mL，逐层关腹，术后分笼常规喂养，术后腹腔注射硫酸庆大霉素，0.1 mL/天，共3天。

3.2 各组大鼠内膜组织病理形态

HE 染色结果如图1显示，假手术组大鼠子宫内膜上皮结构完整呈柱状、大小均一且排列紧密，微绒毛密集，间质细胞排列整齐，同时腺体丰富，细胞核形状呈现类椭圆形；模型组异位内膜上皮可见立方体增生且排列稀疏，间质细胞增多、增厚，微绒毛脱落，腺体也几乎消失，内膜极薄；内异方治疗组子宫内膜上皮细胞排列紧密，细胞大小均一，但部分微绒毛脱落，腺体较丰富；阳性对照组异位内膜细胞大小均一呈柱状，且排列紧密，腺体较丰富。以上结果说明，内异方能改善EM大鼠的异位内膜病理学结构改变。

今年“龙抬头”，中华龙舟大赛来到海南万宁，在和乐镇港北港拉开全年比赛的大幕。万宁与龙舟的相遇并非偶然，万宁地处大海之南，自古以来，这里便延续了与中原大陆一脉相承的龙文化，除了每年的赛龙舟外，这里普遍会把食品名称加上“龙”字，比如水饺称作“龙耳”，烙饼称作“龙鳞”，米饭称作“龙子”以求吉祥福瑞，万家平安。

3.3 各组大鼠内膜组织IL-6和IL-8的水平

采用ELISA 法检测模型组、内异方治疗组和阳性对照组的异位内膜组织或假手术组同位置的内膜组织中IL-6 和IL-8 的水平，结果如表1 所示：与假手术组相比，模型组大鼠异位内膜组织中IL-6和IL-8水平均显著增高，差异均有统计学意义（均P<0.05）；与模型组相比，内异方治疗组与阳性对照组大鼠异位内膜组织中IL-6和IL-8水平明显降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）；与阳性对照组相比，内异方治疗组大鼠异位内膜组织中IL-6和IL-8水平均稍高，但差异不具有统计学意义（均P>0.05）。

图1 HE染色检测模型组、内异方治疗组和阳性对照组的异位内膜组织或假手术组同位置的内膜组织病理形态（×200）

表1 各组大鼠异位内膜组织IL-8和IL-6的水平比较（n=10，±s）

表1 各组大鼠异位内膜组织IL-8和IL-6的水平比较（n=10，±s）

注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

Group假手术组模型组内异方治疗组阳性对照组F值IL-8/(pg/g)129.45±19.39 354.22±41.04*172.57±23.45*#159.45±25.43#75.312 IL-6/(pg/g)216.06 ±28.44 421.37±36.52*286.38±35.43*#262.54±29.42#178.368

3.4 VEGF与HIF-1α的蛋白表达水平

末次给药24 h 后，腹腔注射10%水合氯醛（2.5 mL·kg-1）麻醉大鼠，采用仰卧位方式固定并开腹大鼠分离异位内膜组织或假手术组同位置内膜组织。组织分为两部分，一部分直接冻存在-80℃冰箱，用于后续ELISA 和Western blot 检测；另一部分组织以4%多聚甲醛固定12 h，固定后生理盐水冲洗固定液，然后采用常规梯度酒精脱水，二甲苯透明和石蜡包埋。取石蜡包埋的异位内膜组织或假手术组同位置内膜组织，利用CUT4062 型手动切片机切成5µm 厚度的组织切片。石蜡切片脱腊后，苏木素染色5 min，蒸馏水冲洗2 min，1%盐酸乙醇分化15 s，蒸馏水冲洗2 min，1%Na2HPO4·12H2O 溶液返蓝5 s，蒸馏水冲洗1 min，伊红染色5 min，蒸馏水冲洗2 min，依次运用不用浓度的50%-70%-80%-95%-无水乙醇梯度脱水，每次5 min，二甲苯透明3 min；中性树胶封片后BX51 型显微镜下进行观察内膜组织病理学改变并随机选择10 个视野进行拍照。

图2 Western blot检测模型组、内异方治疗组和阳性对照组的异位内膜组织或假手术组同位置的内膜组织中VEGF与HIF-1α的蛋白表达水平

3.5 PTEN和NF-κB蛋白表达水平

图3 各Western blot检测模型组、内异方治疗组和阳性对照组的异位内膜组织或假手术组同位置的内膜组织中PTEN和NF-κB的蛋白表达水平

给药4 周后，采用Western blot 法检测模型组、内异方治疗组和阳性对照组的异位内膜组织或假手术组同位置的内膜组织中PTEN 与NF-κB的蛋白表达水平，结果如图3 所示：与假手术组相比，模型组大鼠异位内膜组织中PTEN 蛋白表达水平显著降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05），NF-κB 的蛋白表达水平显著增高，差异均有统计学意义（均P<0.05）；与模型组相比，内异方治疗组和阳性对照组大鼠异位内膜的PTEN 蛋白表达水平均明显增高，差异均有统计学意义（均P<0.05），NF-κB 的蛋白表达水平均明显降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；与阳性对照组相比，内异方治疗组大鼠异位内膜组织中PTEN 蛋白表达均稍高，但差异不具有统计学意义（均P>0.05），而NF-κB 的蛋白表达水平明显增高，差异均有统计学意义（P<0.05）。以上结果说明，内异方能抑制EM 大鼠的异位内膜组织中PTEN和NF-κB的蛋白表达。

4 讨论

目前，西医认为EM 是一种雌激素依赖性疾病[13]。于是，对EM 的治疗，其主要手段是维持一种低雌激素的状态，但是这种疗法也同时引发了一系列的副作用，其中以骨密度的降低最为显著[14]。中医药理论认为，EM 辩证病位当属下焦，是由于气郁血淤导致的经血逆流所致[15]，因此，可采用化疲益气、活血化瘀之内异方对EM 给予治疗。本研究发现，内异方能改善大鼠EM。

异位内膜组织种植于腹腔并得以生长依赖于丰富的营养物质供应[16]，而营养物质的供应需要大量微血管的生成[17]，因此，微血管生成是EM 发生的关键步骤。而VEGF是至今以来发现的特异性最高的促血管生成因子[18]。VEGF 具有促进血管内皮细胞通透性增强，加速血管内皮细胞增殖、迁移、粘附的作用，并能最终诱导微血管生成[18-19]。且已有文献[20]报道，在EM患者的腹水和异位内膜组织中VEGF 的表达明显增加。提示，VEGF高表达是EM 患者异位内膜赖以生长的重要因素。本研究同样发现在EM 大鼠的异位内膜组织中VEGF 表达增加；而内异方给药后，能够抑制EM大鼠的异位内膜组织中VEGF的表达。

EM 的发病与发展与腹腔内微环境的变化密不可分。EM 患者常常伴随有腹腔缺氧状态，而EM 的造成腹腔缺氧微环境的形成正是EM 发生与发展的重要因素[21]。在缺氧微环境形成后，缺氧诱导因子HIF-1α的表达增强，而缺氧诱导因子HIF-1α 表达被认为与EM的散播与种植密切相关[22]。另外有研究表明[23]，缺氧也是促进内皮细胞分泌VEGF 的重要因素，人子宫内膜细胞在缺氧环境下培养12 h 后，VEGF 表达显著增加。而VEGF表达增加正是异位内膜中微血管生成的重要条件。本研究同样发现EM 大鼠的异位内膜组织中HIF-1α 表达增加；而内异方给药后，能够抑制异位内膜组织中HIF-1α 的表达，从而改善了大鼠子宫内膜的腹腔内部缺氧微环境，致使下调VEGF的表达，改善异位内膜的增长。

NF-κB 是一种重要的细胞核转录因子，发挥着多种生物学功能。EM 患者常常伴随有促炎因子的异常升高的腹腔炎性微环境[24]。Tao X 等[25]研究结果表明，EM病灶中NF-κB的表达成强阳性。而NF-κB被激活后，可使得许多促炎细胞因子、趋化因子以及促血管生成相关因子被上调表达，而这些细胞因子异常上调进一步促进异位内膜的种植和生长，从而促进EM 的发生和发展[26]。本研究发现，在EM 大鼠的异位内膜组织中IL-6 和IL-8 水平显著增高和NF-κB 的表达明显增加，而内异方抑制EM 大鼠的异位内膜组织中IL-6和IL-8水平以及NF-κB的表达。

在多种子宫内膜病变中PTEN 因子表达变化具有特殊的意义[27-28]。有文献[27]指出在子宫内膜增生中PTEN 蛋白的缺失可能会导致子宫内膜生长失控。Zheng 等[28]研究发现PTEN 的无表达或低表达的内膜细胞转移能力与侵袭能力均有所增加，易出现内膜细胞转移至子宫腔以外的地方，从而诱发EM。PTEN 表达下调可通过激活PI3K/Akt 信号通路并促进NF-κB表达上调，再者子宫异位内膜碎片在缺氧环境下进一步刺激NF-κB 的表达增加，负反馈调节使得PTEN 表达下调，使得EM 加重[29]。本研究同样发现EM 大鼠的异位内膜组织中PTEN 表达降低；而内异方促进EM 大鼠的异位内膜组织中PTEN的表达。

Notes: Confucius is said to have read The Book of Changes ( Yi Jing) so many times that the leather strings binding the bamboo slips upon which the book was written broke three times．[2]46

综上所述，内异方能够缓解对缺氧环境中的异位内膜组织的增厚，改善缺氧情况，从而对EM 大鼠具有明显的改善作用。推测这种改善作用可能是由于内异方能够抑制异位内膜组织中HIF-1α和NF-κB表达，从而减缓腹腔的炎性和缺氧微环境，进而降低异位内膜组织中VEGF的表达同时促进PTEN的表达，致使异位内膜组织中微血管生成减少，导致异位内膜组织内膜种植得以生长的营养物质供应不足，最终改善EM。本实验对内异方临床上治疗EM提供的实验依据。