散结镇痛胶囊对小鼠子宫平滑肌收缩的影响及其机制研究＊

孙 兰，李家春，刘莉娜，吕耀中，魏天杨，王振中＊＊

（1. 江苏食品药品职业技术学院 淮安 223003；2. 江苏财经职业技术学院 淮安 223003；

3. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；4. 中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

原发性痛经（Primary dysmenorrhea，PD）是最常见的妇科疾病之一，流行病学研究显示患病率为20%-90%，较为严重约为15%，给患者正常生活和工作带来严重影响[1]。虽原发性痛经多见，但病因不明。有研究认为，原发性痛经的病理生理学与子宫异常收缩有关，子宫收缩时，由于子宫肌层的血流量减少而引起缺血，厌氧代谢物积贮，刺激疼痛神经元引起疼痛反应[2]。研究认为，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的过量产生与痛经的发病机制有关，ROS诱导的蛋白质和DNA 的变化可能导致细胞功能的改变或蛋白水解反应的激活，最终导致子宫内膜损伤和炎症[3]。子宫是女性主要生殖器官，由子宫内膜、肌层和外浆膜层组成。在月经期间，子宫收缩活动增加，子宫在幅度和频率方面的收缩异常被认为是导致不孕、流产、痛经等各种临床问题的原因之一[4]。子宫组织的收缩生理功能受类固醇激素、二十烷酸和肽的不同调节。黄体酮（Progesterone，P4）促进子宫肌层松弛，雌激素（Estrogen，E2）增加子宫收缩力。P4 和E2 调控子宫平滑肌的收缩的主要通过调节编码收缩相关蛋白（Contraction-associated proteins，CAPs）基因的表达来实现的。一些重要的CAPs 包括缩宫素受体（Oxytocin receptor，OTR）和前列腺素F2a受体（Prostaglandin F2areceptor，FP）[5]。痛经发生时，子宫内膜血流量减少，产生和释放PGF2α增多，高浓度的PGF2α作用于螺旋小动脉壁上的FP受体，引起子宫平滑肌痉挛性收缩[6]。

原发性痛经尚无特效治疗方法，临床上常采用对症和经验性治疗方法，常用非甾体类抗炎药、钙离子通道抑制剂、口服避孕药等药物治疗[7]。非甾体抗炎药在原发性痛经患者中的作用机制尚不完全清楚，但由于其镇痛和抗炎的特性，常被用于治疗原发性痛经，如双氯芬酸治疗原发性痛经因已被证明有效而被广泛应用[8]。Ca2+是一种重要的离子，其控制细胞内的几个过程，如胞吐、分泌和凋亡。痛经时，子宫因缺血而发生再灌注损伤，使Ca2+大量进入细胞内，从而导致细胞内Ca2+过量增多引起细胞的能量损耗、细胞膜受损，致使子宫肌挛缩，出现痛经。硝苯地平等钙离子通道阻滞剂具有较好的治疗原发性痛经的作用[9]。PD属于与内分泌相关的妇科疾病，口服避孕药抑制排卵不仅减少了PGF2a的产生，而且减少了能产生PGF2a的月经量，从而减少了痛经的发生。但上述药物均产生一定的副作用，严重者甚至引起胃溃疡，如非甾体类抗炎药[10]，口服避孕药常引起患者内分泌功能失调等[11]。

在我国医学中，PD 归属于“行经腹痛”范畴，关于痛经的最早记载见于汉代张仲景《金匮要略》，其关于痛经的描述为：“少腹满痛，经水一月再见”。痛经病位在子宫，“不通则痛”和“不荣则痛”是其主要两个主要病机，有实有虚或者虚实夹杂，实者可由寒凝血瘀、气滞血瘀、湿热瘀阻导致子宫的气血运行不通畅，“不通则痛”；虚者主要由于肾气亏损及气血虚弱，从而导致子宫失于濡养，“不荣则痛”[12]。中医药通过多途径治疗PD 获得比较满意的疗效，且副作用小。然而，一些临床上疗效显著的中药方剂，因药理作用机制研究不够深入，很难被西医所接受，限制中医药走向世界[13]。

散结镇痛胶囊（Sanjie Zhentong Capsule，SJZTC）由古方血竭散和消瘰丸化载而来，由龙血竭、三七粉、薏苡仁和浙贝母4味药材组成，具有活血化瘀、软坚散结的功效。方中龙血竭、三七专入血分以攻其瘀，浙贝母、薏苡仁清热化痰、软坚散结，去除湿热，以利气血畅行，无瘀滞。在临床上，散结镇痛胶囊用于痰瘀互结兼气滞所致的继发性痛经、月经不调、盆腔炎包块、不孕等。研究表明，SJZTC 具有一定的解痉、镇痛作用，且能够降低血清雌二醇和血浆PGF2α，TXB2浓度，增加血清孕酮含量[14]。但SJZTC 对子宫收缩的影响还未见报道，本研究通过观察SJZTC 对小鼠子宫平滑肌收缩的影响，并探讨其机制，为临床治疗原发性痛经提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

ICR 小鼠，雌性，体重：18-22 g，购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK（苏）2017-0007，分笼饲养，自由饮水。

1.2 药物与试剂

散结镇痛胶囊（江苏康缘药业股份有限公司）；苯甲酸雌二醇注射液（宁波第二激素厂）；缩宫素（Oxytocin，上海禾丰制药有限公司）；生理盐水（山东齐都药业股份有限公司）；PGF2α（Sigma 公司）；乙酰胆碱（Acetyl choline，Ach，Sigma 公司）；Bay K8644（Sigma公司）；乐氏液（NaCL 9.2 g，KCL 0.42 g，CaCL20.24 g，NaHCO30.15 g，Glucose 1.0 g 溶解于1000 ml 重蒸水中即得，PH = 7.4）；DMEM/F12 培养基（GIBCO）；胶原酶Ⅱ（GIBCO）；胎牛血清（Hyclone）；胰蛋白酶（Thermo）；EDTA（Amresco）；青霉素/链霉素混合液（Biotopped）；Calcium 6-QF Assay Kit（MD）。

1.3 仪器

电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；PowerLab16/35 生物信号采集系统（AD Instruments 公司）；PHSJ-4FPH 指示计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；FlexStation 3 多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；SW-CJ-2F 型超净工作台（苏净安泰）；二氧化碳培养箱（Thermo scientific）；CKX41SF 倒置显微镜（OLYPUS）；细胞自动计数仪（Invitrogen）。

1.4 离体子宫肌条的制备

取未孕小鼠，于实验前24 h 皮下注射雌二醇5 mg·kg-1，脱颈椎处死小鼠取子宫置于Locke's 溶液中漂洗干净，剪取子宫2 cm，两端分别固定于浴槽底部和张力换能器，置于装有20 mL乐氏液恒温浴槽中，温度为37±0.1℃，通入95%O2+5%CO2，给予1.0 g的负荷，待肌条的自发收缩稳定后即可进行实验。

1.5 离体子宫平滑肌收缩测定

按照1.4 制备离体子宫，记录10 min 正常收缩曲线，加入SJZTC，采用加倍累加给药法（浓度分别为0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1），每 次 给 药 间 隔5 min，观察SJZTC 对子宫自发收缩的影响。加入PGF2α（终浓度 1 mg·L-1）、Ach（1 µM）、Oxytocin（终浓度5 IU·L-1）及Bay K8644（1 µM），作用15 min 后再加入SJZTC（浓度分别为0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·ml-1），每次给药间隔5 min，观察SJZTC 对PGF2α、Ach、Oxytocin及BayK8644 致子宫收缩的影响。溶媒组（Vehicle group）加入对应的溶剂，记录给药前及给药后子宫收缩曲线，统计给药前5 min 及给予不同浓度SJZTC 后5 min 内子宫的收缩幅值，计算抑制率%（IR%），统计平均值并与溶媒对照组进行比较。计算方法如下：

1.6 子宫平滑肌细胞的原代培养

在实验前48 h 皮下注射雌二醇0.1 mg/每只，脱颈椎处死小鼠，消毒后剖出子宫放入含有双抗的PBS 溶液中，将肌条剪成1-2 mm3碎糜，加入2 mL 0.025 g·L-1的胶原酶Ⅱ，转移到锥形瓶中，于37℃水浴锅消化1 h，隔30 min 巴氏吸管吹打5 min。加入等体积含15%血清的完全培养基停止消化，200 目细胞筛过滤，1000 r×10 min 离心，弃上清，完全培养基混悬细胞，接种入25 cm2细胞瓶培养，于37℃、5%CO2细胞培养箱培养。

1.7 子宫平滑肌细胞钙离子检测

细胞传代，以1×105/mL密度种板于黑色96孔板，于37℃、5% CO2细胞培养箱培养过夜。弃上清，加入100 µL Calcium 6-QF 溶液，37℃孵育2 h。按需要分为溶媒组（Vehicle）、模型组（Oxytocin）和Oxytocin +SJZTC 组。Vehicle 和Oxytocin 组加入50 µL 的PBS，Oxytocin+SJZTC 组加入PBS 配制的加入SJZTC（终浓度50、25µg·mL-1），作用15 min。Flexstation®3钙流工作站检测动态钙离子变化：仪器设置成运行20 s 后Vehicle 组加入50 µL PBS，其余各组加入缩宫素（Oxytocin）（终浓度为7 µM）50 µL，测定100 s 内钙离子的变化曲线，计算曲线下面积（Area under curve，AUC）。实验重复3次。

1.8 结果统计

图1 SJZTC对小鼠离体子宫自发收缩幅值的影响和抑制作用

采用Graphpad Prism 5.0 软件进行数据分析，统计学数据用±S 表示，对多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t 检验，P < 0.05 具有统计学意义。

2 结果

2.1 SJZTC对小鼠离体子宫自发收缩的影响

SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）均能减小子宫收缩幅值，随着浓度的增加，对子宫收缩幅值抑制作用越明显，结果见图1A；SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1）对子宫收缩幅值的抑制率%（IR%）分别为29.02± 9.71、38.40 ± 8.98、41.03 ± 8.13、51.86 ± 9.10、57.16±3.77，溶媒组（Vehicle group）对子宫收缩幅值的抑制率%（IR %）分别为6.24 ± 5.65、7.65 ± 1.84、6.52 ±2.40、9.69 ± 4.88、11.22 ± 6.48，与Vehicle group 比较，SJZTC 不同浓度组（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）对子宫收缩幅值的抑制率均有显著差异（P<0.01）。结果见图1B。

2.2 SJZTC对PGF2α致小鼠离体子宫收缩的影响

图2 SJZTC对PGF2α致小鼠离体子宫收缩幅值的影响和抑制作用

SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）均 能减小PGF2α诱导的子宫收缩幅值，随着浓度的增加，对子宫收缩幅值抑制作用越明显，结果见图2A；SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1）对子宫收缩幅值的抑制率%（IR%）分别为13.56±4.58、27.18±4.81、38.83±6.80、49.88 ± 7.70、72.00 ± 8.16，Vehicle group 对子宫收缩幅值的抑制率%（IR%）分别为3.82±1.64、5.63±2.93、5.16 ± 3.17、5.52 ± 3.76、6.18 ± 3.91，与Vehicle group 比较，SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）对PGF2α诱导的子宫收缩幅值的抑制率均有显著差异（P<0.01）。结果见图2B。

2.3 SJZTC对Ach致小鼠离体子宫收缩的影响

SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1）均能减小Ach诱导的子宫收缩幅值，随着浓度的增加，对子宫收缩幅值抑制作用越明显，结果见图3A；SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）对 子 宫 收 缩 幅 值 的 抑 制 率%（IR %）分别为10.85 ± 3.41、35.69 ± 8.57、47.50 ±8.74、61.61 ± 8.23、77.56 ± 11.98,Vehicle group 对子宫收缩幅值的抑制率%（IR %）分别为9.28±2.53、10.26±1.67、12.23±2.38、12.46±4.39、14.14±4.57，与溶媒组 比 较，SJZTC（0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）对Ach诱导的子宫收缩幅值的抑制率均有显著差异（P < 0.01）。结果见图3B。

图3 SJZTC对Ach致小鼠离体子宫收缩幅值的影响和抑制作用

2.4 SJZTC对Oxytocin致小鼠离体子宫收缩的影响

SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）均能减小Oxytocin 诱导的子宫收缩幅值，随着浓度的增加，对子宫收缩幅值抑制作用越明显，结果见图4A；SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1）对子宫收缩幅值的抑制率%（IR%）分别为27.57±9.83、44.99±17.66、62.93±18.86、80.61 ± 12.48、87.02 ± 10.08，Vehicle group 对子宫收缩幅值的抑制率%（IR %）分别为8.13 ± 5.28、11.98 ± 5.24、15.61 ± 3.66、17.74 ± 3.96、17.43 ± 2.88，与Vehicle group 比较，SJZTC 不同浓度组（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）对Oxytocin 诱导的子宫收缩幅值的抑制率均有显著差异（P<0.01）。结果见图4B。

图4 SJZTC对Oxytocin致小鼠离体子宫收缩幅值的影响和抑制作用

图5 SJZTC对Bay K8644致小鼠离体子宫收缩幅值的影响和抑制作用

图6 SJZTC对Oxytocin所致原代小鼠子宫平滑肌细胞内Ca2+影响和荧光值曲线下面积

2.5 SJZTC对Bay K8644致小鼠离体子宫收缩的影响

SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）均 能减小BayK8644 诱导的子宫收缩幅值，随着浓度的增加，对子宫收缩幅值抑制作用越明显，结果见图5A；SJZTC（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、 1.0 mg·mL-1）对子宫收缩幅值的抑制率%（IR %）分别为10.26 ± 5.72、21.04± 6.67、45.23±9.47、59.60±7.42、66.96±6.56，Vehicle group 对子宫收缩幅值的抑制率%（IR%）分别为2.47±1.56、4.21±2.79、7.36 ± 4.36、6.77 ± 4.63、8.15 ± 4.91，与Vehicle group 比 较，SJZTC 不 同 浓 度 组（0.0625 mg·mL-1、0.1250 mg·mL-1、0.2500 mg·mL-1、0.5000 mg·mL-1、1.0000 mg·mL-1）对BayK8644 诱导的子宫收缩幅值的抑制率均有显著差异（P<0.01）。结果见图5B。

2.6 SJZTC对子宫平滑肌细胞钙离子含量影响

缩宫素（Oxytocin）（终浓度为7µM）能够诱导小鼠子宫平滑肌细胞内Ca2+释放，结果见图6A；与Vehicle group 比较，模型组（Oxytocin）Ca2+的荧光值AUC 显著增加（P < 0.001）；与模型组比较，SJZTC（终浓度50、25 µg·mL-1）显著抑制缩宫素诱导小鼠子宫平滑肌细胞内Ca2+荧光值的AUC（P < 0.05 或P < 0.01）含量。结果见图6B。

3 讨论

原发性痛经病理机制相关的通路主要体现在疼痛、炎症及抗氧化应激三个方面，不规则下腹疼痛是原发性痛经患者主要的临床症状，子宫痉挛性收缩是引起疼痛的主要原因，其病因与子宫组织PGF2α含量升高密切相关，PGF2α能导致子宫肌层血管收缩使子宫内膜血流量不足而引起疼痛[15-16]。钙离子（Ca2+）是调节子宫平滑肌细胞收缩的关键因子，当子宫平滑肌细胞内Ca2+浓度超过10-6M 时就会诱导子宫收缩[17]。细胞内Ca2+来源主要有外Ca2+内流和内Ca2+释放两种途径，细胞外Ca2+内流由细胞膜上Ca2+通道的开放所介导，在外界因素刺激下，细胞膜去极化诱导通道开放，Ca2+进入细胞内，引起子宫平滑肌收缩[18]。

缩宫素与子宫平滑肌细胞膜受体结合，激活磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）-三磷酸肌醇（Inositol triphosphate，IP3）-蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）系统[19]。PKC 能引起细胞膜上Ca2+通道的开放，细胞外Ca2+内流；IP3 与其受体结合，引起内质网Ca2+释放，两种途径同时引起细胞内Ca2+浓度升高，导致子宫平滑肌收缩[20]。本研究显示，散结镇痛胶囊显著抑制缩宫素引起的子宫平滑肌条收缩的幅度，并显著抑制缩宫素诱导的子宫平滑肌细胞Ca2+释放。表明散结镇痛胶囊对离体子宫平滑肌的舒张作用，可能与阻断细胞膜Ca2+通道开放进而抑制细胞外Ca2+内流及细胞内质网Ca2+释放有关。

原发性痛经与PGF2α导致子宫收缩有关，PGF2α作用于子宫平滑肌细胞上前列受体引起细胞内Ca2+浓度的升高[21]，Ach 也作用于平滑肌细胞上相应受体引起细胞内Ca2+浓度的升高[22]。研究显示，散结镇痛胶囊能够剂量依赖性抑制PGF2α和Ach 诱导的子宫平滑肌条收缩的幅度，提示散结镇痛胶囊可能是由于抑制细胞内Ca2+浓度的增加从而抑制离体子宫平滑肌的收缩。BayK8644 是Ca2+通道激动剂，通过使细胞内Ca2+增加及激活磷脂酰肌醇信号通路从而诱导离体子宫的节律收缩[23]。结果表明，散结镇痛胶囊对Bay K8644引起的离体子宫平滑肌收缩具有显著抑制作用，结果提示，散结镇痛胶囊通过抑制Ca2+通道，进而减少子宫平滑肌细胞内Ca2+水平。

综上所述，散结镇痛胶囊对子宫平滑肌收缩具有抑制作用，其机制可能与抑制细胞外Ca2+通过离子通道涌入细胞内以及细胞内Ca2+释放有关。散结镇痛胶囊对子宫平滑肌的松弛作用能够显著缓解因子宫收缩而导致的痛经。本课题组后续将进一步研究散结镇痛胶囊成分对子宫平滑肌收缩影响，探讨其影响子宫收缩的物质基础。