中医药调控干细胞移植治疗肝硬化的研究进展＊

吕艳杭，吴姗姗，王振常，温智稀，叶学劲

（1. 广西中医药大学研究生学院 南宁 530222；2. 广西中医药大学国际壮医医院 南宁 530201）

肝硬化是由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损伤，是各种慢性肝病的终末期。我国目前感染乙型肝炎病毒的患者约有7300万人，同时随着社会生活水平的提高，大量饮酒、肥胖及糖尿病等发病率的增高引起酒精性和非酒精性脂肪肝增多，这些患者都有可能或已经发展成为肝硬化[1-2]。据此推断，肝硬化患者的群体十分庞大，而对于肝硬化有效的治疗，是目前医学界治疗肝硬化尚未攻克的一道难题。目前除了原位肝移植尚没有特效的治疗方法，但肝脏供体的缺乏、术后高免疫排斥反应及高医疗费用等因素限制了其在临床上的广泛应用，因此寻求有效的治疗措施是当前亟待解决的关键问题。

干细胞的移植为肝硬化患者带来了希望。干细胞是一类具有高度分化潜能及自我更新能力极强的细胞[3-4]。目前治疗肝硬化的干细胞有骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胚胎干细胞及脐带血细胞。大量研究证实了[5-6]来源不同的干细胞移植，对肝硬化引发的肝组织损伤的治疗均有明显的作用。干细胞移植是继传统原位肝移植（Orthotopic Liver Transplantation OLT）后一种新型的治疗肝硬化的治疗方法，该方法打破了肝硬化患者肝细胞损伤不可逆转的理念。中医药可以提高干细胞移植的存活及增殖能力，诱导其向肝细胞定向分化，改善移植后的肝脏的病理微环境等参与干细胞移植治疗肝硬化[7]，从而展现中医药独特的价值。本文通过阐述中医药调控干细胞治疗肝硬化已有的研究成果及中药复方或中药单体协同干细胞移植治疗肝硬化存在的机制，为中医药干预干细胞移植治疗肝硬化提供理论基础。

1 干细胞移植对肝硬化的影响

1.1 干细胞诱导转分化为肝样细胞

在特定的环境下，骨髓间充质干细胞、造血干细胞及脐带血细胞可以被诱导转分化为肝样细胞。雷香丽等[8]把绿色荧光（GFP）转基因SPF 级雄性大鼠间充质干细胞移植入肝硬化大鼠，移植3 周后行大鼠肝脏冰冻切片，在荧光显微镜下观察在肝脏内分布的GFP 细胞，采用石蜡切片行GFP 抗体及白蛋白抗体免疫组化双标法检测GFP 阳性细胞在大鼠肝脏内的分布，结果发现移植3 周后的大鼠肝内可见GFP 阳性细胞及ALB 阳性细胞。邢全台[9]与王忠琼等[10]骨髓间充质干细胞用HGF、EGF 等诱导分化为肝样细胞，表明大鼠骨髓间充质干细胞在细胞因子的诱导下可转分化为肝样细胞，对大鼠肝损害具有修复作用。王豪勋等[11]将分离纯化的间充质干细胞与四氯化碳（CCl4）诱导的大鼠肝硬化组织中以Transwell 共同培养，结果显示在受损的肝组织环境中，间充质干细胞可以分化为肝样细胞。Guo 等[12]体外细胞实验利用集落细胞刺激因子和肝细胞生长因子成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞转分化为肝样细胞。李梦等[13]将肝癌细胞HepG2与骨髓间充质干细胞（BMSCs）共同培养后发现HepG2对BMSCs 具有显著的趋化、增殖与分化作用，使用过表达肝癌高表达转录本后可促进BMSCs 转分化为肝样细胞，表明携带具有抑癌基因或细胞毒性药物的BMSCs 可以向肝脏癌变部位迁移，有利于提高肝癌治疗的特异性，同时可有效地减少治疗（放、化疗）全身毒副作用。

1.2 干细胞促进肝星状细胞凋亡

肝纤维化是有各种损伤因素所致的肝脏内结缔组织异常增生的病理过程，是所有慢性肝病的共同病理阶段，是肝硬化的必经阶段。参与肝纤维化的细胞包括肝星状细胞、中性粒细胞、肝窦内皮细胞等。而肝星状细胞（Hepatic Stellate Cell，HSC）是致肝纤维化的最效应细胞，其增殖与活化是肝纤维化发生发展的中心环节。诸多研究者[14-16]发现骨髓间充质干细胞移植入肝硬化的大鼠体内后，BMSCs 能够在肝脏内定植，发挥减轻肝脏的炎症反应及改善肝功能和肝纤维化的程度。骨髓间充质干细胞能分泌肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子，白细胞介素、转化生长因子等多种细胞因子，其中肝细胞生长因子具有促进肝星状细胞凋亡的作用，不仅仅其具有诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的功能，还可以抑制转化生长因子-β（TGF-β）的产生，达到抑制肝星状细胞活化后的细胞外基质过度沉积，从而促进肝星状细胞发生凋亡[17-18]；白细胞介素-10（IL-10）能阻断肿瘤坏死因子（TNF-α）的纤维化的信号通路，从而减少纤维化进程。姚志成等[19]发行培养骨髓间充质干细胞的上清液可有效的下调肝星状细胞中的转化生长因子（TGFβ）、金属蛋白酶抑制因子（TIMP）、胶原蛋白I（COLα1）的表达，促进肝星状细胞的凋亡，抑制肝纤维化的发生发展进程。

2 干细胞移植治疗肝硬化的实验研究

2.1 基础实验研究

大量研究证实[20-22]肝脏受损时会诱导SDF-1 的表达上调，不仅可以促进炎性细胞向损伤的肝脏聚集，还可以促进表达CXCR4 的干细胞发生迁移，高表达SDF-1 的微环境对干细胞在受损肝脏中的存活及修复发挥着至关重要的作用。王华伟等[23]研究显示补肾化瘀生新方促进干细胞归巢、增加干细胞数量，达到延缓衰老的目的。Shao 等[24]研究表明，肝硬化后出现SDF-1 表达上调，干细胞移植到体内后SDF-1 表达进一步上调，与脾脏和骨髓相比较，大部分的干细胞进入受损的肝组织中，进一步说明SDF-1/CXCR4在干细胞归巢到受损的肝脏发挥修复作用。Mohamed 等[25]认为BMSCs 移植胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型，结果显示肝细胞的HCF 和MMP-2 mRNA 升高，CK-19 mRNA HGF 在MSCs 分泌的细胞中表达减少，从而纤维化大鼠肝脏中的BMSCs 表达明显增多，表明细胞因子联合骨髓干细胞可促进干细胞转化为肝样细胞。赵家峰等[26]研究发现采用CXCR4 拮抗剂和CXCR4 受体能明显抑制羊水干细胞迁移到大鼠肝脏中，进一步说明SDF-1/CXCR4 介导的信号通路发挥着至关重要的作用。王志红等[27]体外研究证实通过转染使得过表达CXCR4 的干细胞更具有向SDF-1 的迁移能力。马虎成等[28]研究发现转染CXCR4 基因能促进干细胞在肝脏的定植，改善肝功能，进一步表明干细胞向损伤的组织迁移与干细胞表面表达的CXCR4 的数量成正比。黄晓明等[29]研究表明在受损肝组织中SDF-1主要分布在CXCR4表达的肝卵圆细胞上，更进一步说明了在受损肝组织的修复过程中，通过SDF-1 浓度梯度变化对CXCR4 的吸引，同时SDF-1/CXCR4 轴可能是刺激肝干细胞的激活，从而促进肝卵圆细胞的增殖，以此完成对肝脏受损部位的修复。目前，肝卵圆细胞是公认的专能肝干细胞，在肝脏微环境的调控下，其可以分化为肝细胞。当肝脏发生肝纤维化甚至肝硬化时，大量肝细胞生长受阻甚至死亡，而肝卵圆细胞出现在肝小叶周围，使其能够促进SDF-1、CXCR4 高表达。

2.2 国内外的临床研究

温智稀[30]研究表明，柔肝化纤颗粒联合干细胞移植可改善肝功能及延缓肝纤维化的进展，达到协同治疗肝硬化的作用。李劲等[31]选取丙肝代偿期和失代偿期肝硬化患者60例，研究结果显示肝硬化患者外周血中的SDF-1与CXCR4表达量上调，且两者水平呈正相关，提示了SDF-1与CXCR4参与调控肝硬化的发生发展。Jang 等[32-33]采用自体骨髓间质干细胞输注治疗肝硬化失代偿期，结果显示肝纤维化指标下降、CP 级下降、肝再生（肝体积增加）。Liu等[34]采用拉夫米定联合阿德福韦酯联合干细胞移植治疗乙肝肝炎失代偿期肝硬化，实验组显示肝功能指标、临床症状明显改善，结果表明，联合干细胞分化为正常肝样细胞，恢复肝脏结构，改善肝功能，提高患者生存质量。郑盛等[35]研究分别选取肝硬化失代偿期患者67 例与48 例，采用抽取自体骨髓间充质干细胞及体外分离方法，于肝动脉行自体骨髓间充质干细胞移植治疗，治疗组患者经治疗后发现AST、ALT、TB 均下降，ALB 上升，食欲不振、腹水、腹胀腹满等症状好转，术后严重并发症0例，所有患者均无白细胞下降、出血或肝区疼痛等情况，结果表明在经肝固有动脉自体BMSCs 移植治疗肝硬化失代偿期，能有效改善肝功能、凝血功能及临床症状，是一种安全、有效的治疗方法。

目前，对晚期肝硬化患者的的内科治疗相对比较保守，且国内外对原位肝移植所需要的肝源是非常紧张，因此阐述中医药调控干细胞移植治疗肝硬化的具体机制，为干细胞移植治疗肝硬化的疗效提供理论基础。

3 中医药调控干细胞移植治疗肝硬化的机制

3.1 中药复方调控干细胞移植治疗肝硬化机制

刘芳等[36]研究发现茵陈四苓颗粒联合干细胞移植，能有效减轻肝硬化慢性大鼠肝功能损害，移植肝细胞凋亡，其机制可能与下调肝脏组织Caspase-3 蛋白的表达，调控凋亡基因Bax mRNA、BCL-2 mRNA 表达有关。黄晶晶等[37]通过动物实验及细胞实验发现鳖甲煎丸联合BMSCs 具有延缓CCl4 诱导的大鼠肝纤维化及缓解肝功能损害的作用，采用CXCR4的特异性拮抗剂后，发现联合组与单纯鳖甲煎丸组、干细胞组与模拟组的疗效相当，而未使用CXCR4 的特异性拮抗剂，联合组与单纯鳖甲煎丸组、干细胞组与模拟组的疗效存现显著差异，结果表明鳖甲煎丸联合BMSCs 移植可提高肝纤维化的治疗效果，其机制可能与SDF-1/CXCR4 有关。温智稀等[38]研究表明鳖甲煎丸能促进干细胞分化为肝样细胞，其作用机制可能与调节干细胞Notch 信号通知中Notch-1 蛋白以及Notch-1 mRNA表达水平有关。张久梅[39]研究表明干细胞移植能够改善肝硬化大鼠的肝功能、减轻胶原蛋白的沉积及肝纤维化程度，健脾活血方联合干细胞移植治疗肝硬化大鼠能显著降低大鼠ALT、TBIL 水平及羟脯氨酸含量，增加ALB 的含量，从而减轻胶原蛋白的沉积及改善肝纤维化程度。刘莹等[40]研究证实济生肾气汤联合干细胞移植可明显改善肝硬化大鼠的T淋巴细胞亚群和红细胞免疫功能。现报道表明[41]一贯煎能够促进BMSCs 募集到肝脏，从而发挥逆转肝纤维化的作用。左归丸可通过抑制炎症发生、改善肝纤维化、激活细胞因子等诱导BMSCs 横向分化为肝实质细胞[42]。张金生等[43]研究认为活血化瘀方药不仅能激活并促进内源性干细胞的大量增殖，也可调控干细胞分化方向。温智稀等[44]研究发现鳖甲煎丸联合组在诱导14、21、28 天时ALB、CK18 及AFP 阳性细胞率均高于肝细胞生长因子（HGF）加纤维化生长因子（FGF-4）组，说明鳖甲煎丸具有BMSCs 转分化为肝样细胞的能力，且效果优于HGF+FGF-4 的诱导分化能力，进一步证实了活血化瘀、软坚散结具有促进干细胞的转分化肝细胞。黄进等[45]研究证实了补肾益精的代表方左归丸含药血清可促进干细胞的增殖，可能与促进细胞SCF mRNA 及可溶性SCF 蛋白表达有关。李连达院士等[46]研究发现归元方与干细胞移植对急慢性肝损伤有明确的治疗作用，两者合用优势互补，协同增效。刘江凯[47]研究发现百令胶囊联合干细胞移植可有效治疗肝纤维化及早期肝硬化，保护肝细胞以及改善肝功能及肝纤维化指标。

3.2 中药单体调控干细胞移植治疗肝硬化机制

崔运浩[48]研究证实黄芪甲苷、毛蕊异黄酮两药配伍能有效激活JAK2/STAT5 信号转导通路，上调小鼠骨髓干细胞的珠蛋白基因调控网络因子的KLF1 mRNA、BCL1 mRNA，促进GATA1 蛋白的表达。张继红等[49]在干细胞培养液中加入肝细胞生长因子（HGF）+ GS（珠子参皂苷）诱导分化21 天后，实验组的干细胞贴壁集落样增殖，形态分化为肝样细胞，表达肝细胞特有的ALB、AFP 及CK18，采用RT-PCR 及Western Blot 显示ALB、AFP 及CK18 mRNA 及蛋白的表达，糖原染色可在荧光显微镜下看见有油红色的颗粒，表明经过联合培养的细胞有肝细胞特有的合成糖原的功能，为后续于体内进行BMSCs 联合珠子参皂苷治疗终末期肝病。沈自尹等[50]提出“肾所藏之精可相应于胚胎干细胞以及其他分化为各种组织器官的成体干细胞，干细胞具有先天之精的属性”的新学术观点，并证实了补肾中药淫羊藿可通过动员与提高激素、细胞因子水平激活内源性干细胞，发挥机体储备的潜力而治疗疾病。杨谕晨[51]研究表明虫草多糖联合间充质干细胞治疗肝硬化具有协同、增效作用，可促进胶原蛋白的降解、减少胶原沉积，缓解甚至逆转肝纤维化。欧阳竞峰[52]等研究证实了红景苷天联合干细胞移植可协同治疗肝硬化，既可促进干细胞的存活、增殖和分化能力，又可明显改善肝功能，逆转肝纤维化，其具体机制可能与干细胞的转分化能力及分泌的生长因子相关。

4 讨论

目前国内外关于中医药调控干细胞移植的研究报道已有众多，本文通过搜索国内外数据库，如知网、万方、维普、Pubmed等数据库，系统阐述干细胞移植对肝硬化的影响、中医药调控干细胞移植治疗肝硬化的实验研究及中医药调控干细胞治疗肝硬化机制等三个方面着手，是该文的创新点。其在一定程度上可揭露中医药联合干细胞移植治疗肝硬化的作用机制，研究证实相对成熟的机制有SDF/CXCR4 信号通路,表明SDF-1浓度梯度变化对CXCR4具有吸引作用，同时干细胞可沿SDF-1/CXCR4轴向肝脏归巢，且还可能促进肝干细胞的激活，从而促进肝卵圆细胞的增殖，以此完成对肝脏受损部位的修复，其机制还包括JAK2/STAT5、BCL/Bax、Notch信号通路等。但是国外关于药物研究的机制已经渐渐步入细胞自噬、外泌体及非编码RNA 等方面深入药物分子机制的研究，然而目前我国的诸多研究，研究质量较低、研究层面表浅，实验的可重复性比较差，且后期无进一步深入探讨，这将不利于祖国传统瑰宝中医药机制的阐明及中医药靶向分子的深入挖掘。因此今后我们要更加规范的将基础研究与临床研究紧密结合，从而提高中医药调控干细胞移植在治疗肝硬化的应用效果。