基于网络药理学和分子对接技术探讨苜蓿素抗结肠癌作用机制＊

刘利艳，温世伟，刘卫云，周 艳，徐 彭

（1. 江西中医药大学药学院 南昌 330004；2. 江西省肿瘤医院药剂科 南昌 330029；3. 新余市人民医院儿科 新余 338000；4. 江西中医药大学实验动物科技中心 南昌 330004）

结肠癌为常见的消化道肿瘤，其发病率和死亡率居所有肿瘤前三位[1-4]。若早期发现，经手术治疗效果较好，然而其确诊往往是中晚期，因此以手术为主的术后辅助化疗是目前治疗结肠癌的最主要方法[5]，化疗耐药和毒副作用大已严重阻碍了化疗方案的实施，为此，寻找新的药物和作用靶点已成为结肠癌治疗中的热点问题。本课题组在前期工作中，分离纯化出了苜蓿素（Tricin）[6-8]，并发现其具有抗过敏作用，后经文献查阅发现苜蓿素具有抗炎、抗氧化、降血糖等功效，亦有文献报道了其在抗结肠癌的作用[9-13]，然而目前文献报道的研究只停留在体外实验和动物实验上，苜蓿素抗人结肠癌作用及作用机制的状况，尚无全面报道。本研究拟探索苜蓿素抗结肠癌作用机制，为使该项目研究更有目的性，研究先基于大数据库，采用网络药理学方法和分子对接技术，来探索其抗结肠癌可能的作用机制。故本研究以苜蓿素为研究药物，人结肠癌疾病为研究对象，进行了苜蓿素抗结肠癌机制的前期探索工作，为后续实验研究苜蓿素抗结肠癌作用机制提供依据和方向。

1 资料与方法

1.1 资料

本研究涉及的数据库有：PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、药物靶点swisstargetprediction（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）、String（https://string-db.org/cgi/input.pl）、疾 病 靶 点 数 据DisGeNET（http://disgenet.org）和Genecards（https://www.genecards.org）、数据交集数据库Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）和通路富集和分析数据库david（https://david.ncifcrf.gov）。

本研究涉及的软件有：Cytoscape，DISCOVERY STUDIO和作图软件graph pad。

1.2 方法

在PubChem 中输入苜蓿素的CAS 号，得到苜蓿素的SMILES 号，将其输入swisstargetprediction 数据库中，筛选物种为“Homo sapiens”，得到苜蓿素靶点文件.csv，此为苜蓿素的潜在靶点。在DisGeNET 和Genecards 数据库中输入“结肠癌”“肠癌”等英文关键词进行检索，获取结肠癌的疾病靶点，将苜蓿素的预测靶点与结肠癌相关靶点进行交集并绘制出韦恩图，提取共同交叉靶基因。

将交集后的共同靶点上传到String 数据库获取蛋白交互作用数据，然后导入Cytoscape 软件构建和分析蛋白作用的网络（PPI网络）。

将共同作用靶基因输入david 数据库，选择物种“Homo sapiens”，KEGG 数据库富集的通路，P＜0.05为统计学差异筛选条件，对苜蓿素抗结肠癌作用的潜在靶点进行生物学功能和通路分析。最后，构建苜蓿素-靶基因-信号通路的网络拓扑图。

苜蓿素与关键靶点的分子对接验证，选择苜蓿素作为配体，分子网络中“自由度”最大的靶点作为受体，进行分子对接验证。

2 结果

2.1 苜蓿素预测靶点与疾病结肠癌靶点交集靶基因筛选

经检索，苜蓿素药物作用靶点有100个，结肠癌疾病相关的靶点有4106个，经韦恩交集得到其共有靶点69个。见图1。

图1 药物作用和疾病交集韦恩图

2.2 苜蓿素抗结肠癌作用靶点

本研究将苜蓿素与活性成分靶点（共同靶基因）数据导入Cytoscape 中，绘制苜蓿素-靶点网络可视图（图2），圈中心为苜蓿素，圈上所有节点均为苜蓿素可能的作用靶点。这体现了苜蓿素治疗结肠癌多靶点作用的特点。edge 边越粗，代表该药物连接的靶点可能性越大。

图2 苜蓿素的抗结肠癌作用靶点图

2.3 PPI网络

本研究将苜蓿素-结肠癌69个潜在的靶基因上传至String 数据库平台获取的蛋白质相互作用关系数据，导至Cytoscape 软件优化构建和分析蛋白相互作用网络（PPI）；PPI网络共有69个节点（共同靶基因）通过350 条边发生作用，平均节点degree 为10.1，PPI 富集P值：＜1.0e-16。可视图中节点越大（半径）、颜色越深则说明其degree 越大，edge 边越粗、颜色越深，则说明其combined_score 值越大，关联性越好（图3）。经Cytoscape Network 分析后得到各靶点的degree 值，按照degree从大到小排序，排名前三分别为AKT1、EGFR和ESR1。

图3 蛋白与蛋白之间的相互作用

2.4 KEGG富集通路

本研究将作用靶点导入david 数据库，选择KEGG富集通路，可得70 条通路（表1），进一步根据P＜0.05，筛选出55 条通路（图4）。在筛选的55 条通路当中，与癌症相关相关的通路有21 条，与免疫炎症相关的通路有5 条，与血管生成的通路有1 条，与激素相关通路有5条，与感染、血小板聚集相关和代谢等其他相关通路23 条。使用Cytoscape 软件作出了苜蓿素-靶点-通路拓扑图（图5），从图中可清晰见苜蓿素抗结肠癌作用是多靶点-多通路的。

表1 苜蓿素抗结肠癌可能的作用通路

2.5 分子对接验证

续表

图4 苜蓿素的作用通路

图5 苜蓿素-靶点-通路拓扑图

以苜蓿素为配体，蛋白网络中degree 前三的蛋白为受体，进行分子对接验证，经分子对接验证发现（图6A、图6B、图6C、图6D）：苜蓿素分别能与AKT1、EGFR 和ESR1 蛋白稳定结合。并分别通过氨基酸残基LYS A276、THR A160、THR A195 氢键连接、GLY A159、GLY A294、GLU A198 碳氢键等连接与AKT1 稳定结合；通过THR A570、METB576 碳氢键、ALA A573 PI 氢键、VAL A575、PRO A572PI 烷基、GLY A574 与EGFR 能稳定对接；通过GLY B457、ARG A434 氢键连接、TYR B459、ALA A430、SER A433、ASN B455 碳氢键连接等与ESR1稳定结合。

图6 A1、A2、A3、A4分别为苜蓿素的3D结构、AKT1、VEGF和ESR1蛋白结构

图6 B1、B2、B3 分别为苜蓿素与AKT1蛋白对接示意图

图6 C1、C2、C3苜蓿素与VEGF蛋白对接示意图

图6 D1、D2、D3苜蓿素与ESR1蛋白对接示意图

3 讨论与总结

网络药理学的研究是由大规模生物数据库支持的，提供了大量关于生物实体相互作用的信息，如药物-基因-疾病。数据库的开发是为了实现互补的目标[14]。分子对接技术是通过化学计量学方法模拟小分子配体与蛋白受体的几何匹配、能量匹配，计算出两者间的作用力，以进行分子间相互作用识别并预测受体-配体复合物结构的一种方法，可用于研究成分与靶点的相互作用[15-21]。本研究以人结肠癌为研究对象，基于网络药理学和分子对接技术进行探索苜蓿素的抗结肠癌作用机制。苜蓿素又名麦黄酮、小麦黄素，常以糖苷的形式广泛存在天然可食性植物中，如小麦、大麦、竹根等其他植物中[22]。现有研究报道，苜蓿素能有效地抑制乳腺癌、肝癌、肺癌和结肠癌等恶性肿瘤[23-24]，因其安全性好，越来越多用于癌症的防治[25-27]，且其在结肠癌中的研究也越来越多[11,28-29]。本研究通过网络药理学的方法来探讨苜蓿素的抗结肠癌作用机制，对苜蓿素-靶点-信号通路进行拓扑分析，得出其潜在的抗结肠癌靶点有69个，涉及通路有55条，主要的作用靶点为AKT1、VEGF和ESR1等。本研究分别通过调控细胞周期、抗炎、血管合成和抑制肿瘤等多靶点途径进行作用。研究显示，在胃癌细胞中，苜蓿素能抑制HIF-1α表达，从而抑制VEGF表达，在血管内皮细胞中，苜蓿素能抑制VEGFR2 的表达，抑制AKT 相对蛋白表达量，来达到抗血管生成的目的[28]。这与本课题组的研究结果不全相同，目前未见有关苜蓿素在结肠癌中，通过AKT 和VEFG 作用靶点来发挥抗结肠癌作用的研究，也未见苜蓿素通过ESR1 途径抗肿瘤的文献报道，本研究结果为下一步苜蓿素抗结肠癌作用机制实验研究提供了新的思路和方法。

综上，以苜蓿素作为研究对象，通过网络药理学的方法来分析其在结肠癌中治疗中的潜在靶点和作用通路，通过分子对接技术来验证其潜在的作用靶点，为后续苜蓿素抗结肠癌治疗分子机制研究，奠定了基础。