扶正祛邪抑癌方治疗大鼠原发性肝癌的实验研究＊

雷 丹，黄素琼，李 波，王晓栋，刘友平，魏 嵋

（1. 西南医科大学附属中医医院 泸州 646000；2. 西南医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 泸州 646000）

我国每年约30 万-40 万人死于肝癌，约占全球肝癌死亡人数的50%[1]。而原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC）起病隐匿，早期缺乏典型的临床表现，位居我国癌症死亡率第二位。癌症最常发生在慢性炎症环境中[2]，通过转录因子介导炎症介质产生，包括趋化因子和细胞因子。细胞因子激活炎性细胞、基质细胞和肿瘤细胞中的相同关键转录因子，导致产生更多的炎症介质并产生癌症相关的炎性微环境。病毒感染、饮酒、药物、细菌等情况下，巨噬细胞的活化以及大量炎症因子参与肝脏慢性炎症环境的形成，导致肝癌的发生，并且大量促炎因子为肿瘤生长提供优势环境[3-4]。

扶正祛邪抑癌方是我院全国名中医孙同郊教授几十年治疗肝癌的临床经验总结，临床应用收效甚佳，主要针对临床上肝癌常见的气阴两虚，瘀毒互结的证型，该方由黄芪、枸杞子、女贞子、白术、土鳖虫、丹参、莪术、半枝莲、香附等十余味药物组成。方中重用黄芪、枸杞子为君药，注重气阴双补，臣以白术健脾益气、女贞子养肝肾之阴，以上药物共建扶正之基。半枝莲性苦、微寒，有清热解毒、活血化瘀之功；土鳖虫、莪术等药物具有破血逐瘀、消积止痛的功效；香附为使，疏肝理气，引药入经，诸药合用，共奏益气养阴、活血化瘀、清热解毒之效。

本实验通过扶正祛邪抑癌方干预二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine，DEN）导致的PLC 大鼠，通过检测肝功及相关细胞因子评估该方的有效性。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品试剂及主要仪器

实验动物、药品、试剂：清洁SD 雄性大鼠200 只，由西南医科大学实验动物中心提供。扶正祛邪抑癌方由我院制剂室统一制作为浓缩膏，每毫升含生药1.5 g,其中黄芪、白术等采用水提法，枸杞子、女贞子、土鳖虫、香附等药物采用醇提法。复方斑蝥胶囊：贵州益佰制药股份有限公司，批号：Z52020238，0.25 g/粒。试剂：DEN：美国sigma 公司，0.95 g/mL。γ-谷氨酰转肽酶（Gamma-glutamyl transpeptidase，GGT）、碱性磷酸酶（Alkaline phospbatase，ALP）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）试剂盒：南京建成生物工程研究所。白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-10（Interleukin-10，LI-10）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ（Interferon-γ，IFNγ）：茁彩生产。环氧化酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）多克隆抗体proteintech中国武汉。

主要仪器：台式高速冷冻离心机（Eppendorf 5424R）、全自动雪花制冰机（常熟市学科电器有限公司）、AU 2700全自动生化分析仪（日本Olympus）、酶标仪Multlskan MK3(赛默飞世尔仪器有限公司生产)。

1.2 方法

造模：清洁雄性SD大鼠200只，体质量150-180 g，适应性喂养1 周后，随机分为两组，正常组20 只，干预组180 只，正常组予以生理盐水2 mL/kg 腹腔注射；干预组予以DEN 腹腔注射，50 mg/kg，每周1次。至第13周开始，每周处死模型组大鼠2只，取肝脏行HE染色，至第17 周末病理学检查证实PLC 造模成功。造模成功后正常组剩余18 只，干预组剩余130 只，将干预组随机分为模型组、斑蝥组、高剂量组、中剂量组和低剂量组共5组。正常组、模型组予以生理盐水灌胃，斑蝥组予以复方斑蝥胶囊灌胃,低、中、高剂量组分别予以扶正祛邪抑癌方浸膏5 mL/kg、10 mL/kg、20 mL/kg，等体积稀释后进行灌胃。

指标检测：灌胃观察12 周后计算大鼠生存率，腹腔注射10%的水合氯醛0.3 g/kg，腹主动脉采血，并取肝脾组织，进行相关指标检测。通过全自动生化仪检测γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）；Elisa检测白介素-6（IL-6）、白介素-10（LI-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）；免疫组化检测AFP、COX-2。

2 统计学处理

统计软件SPSS 20.0用于数据的统计分析。

统计描述性分析：①计数资料以频数表示；②计量资料以均数±标准差表示。

各组间差异比较：①多组计量资料以单因素方差分析进行检验；多重的组间比较以LSD 检验进行；②计数资料采用秩和检验。检验水准α=0.05，当P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 DEN对SD大鼠原发性肝癌造模

造模17周后，取大鼠肝脏行HE染色：可见肝细胞变性坏死，局部区域肿瘤形成，肿瘤细胞周围大量纤维组织增生形成包囊，证明肝癌造模成功。见图1。

3.2 取材时肝脏大体观

肉眼观察：正常组大鼠肝组织质地柔软，颜色淡红,表面光滑,边缘锐利；模型组大鼠肝脏表面见弥漫性结节，存在结节出血，肝叶之间黏连不清，结节间正常肝组织少；低剂量组大鼠肝脏可见弥漫性结节或散在结节，结节较大，并且有相互融合，部分可见结节内出血；中剂量组肝脏见多发结节，但在结节数量及大小较其余各给药组明显好转；高剂量组大鼠肝脏表面散在多个较大的结节，结节之间存在彼此融合，部分可见结节内出血情况；斑蝥组大鼠肝脏结节大小不一，结节数量较模型组减少，与中剂量组最接近。见图2。

3.3 取材时肝脏组织病理检查

肝组织HE染色,镜下观察可知，正常组：大鼠肝小叶、细胞形状结构正常，大小均匀、边界分明、呈放射状整齐排列。模型组：肝索排列紊乱，肝细胞变性坏死。局部区域肿瘤形成，大量异形细胞增生，肿瘤细胞排列密集，分化程度低，异形性大，部分肿瘤细胞内可见多个细胞核，细胞间可见大量增生纤维组织，肿瘤内部呈片状坏死，局部区域亦可见灶状炎细胞浸润，血管增生明显。低剂量组：与模型组相比，肝细胞坏死程度稍减轻，肿瘤细胞排列相对疏松，肿瘤细胞坏死程度稍减轻。中剂量组：与模型组相比，肿瘤细胞分化程度高，排列紧密，类似肝细胞，体积较大，肿瘤细胞坏死不明显。高剂量组；与模型组相比肿瘤细胞分化程度高，肿瘤细胞坏死好转。斑蝥组：与中剂量组基本相似。见图3。

图1 大鼠肝脏行HE染色（*100）

图2 肝脏大体观

图3 肝组织HE染色（*100）

3.4 各组大鼠一般情况、生存率比较

在灌胃过程中，除正常组外，各组大鼠均出现不同程度的生长缓慢或体质量下降、精神差、怠动，毛色晦暗无光泽等情况，但总体而言，正常组＞中剂量组＞高剂量组/斑蝥组＞低剂量组＞模型组。各组大鼠生存率与模型组相比有增加趋势，其中模型组与中剂量组差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表1、表2和图4）。

表1 大鼠生存率比较

表2 大鼠死亡数量与时间关系表

图4 生存曲线图

3.5 体质量、肝脏指数、脾脏指数

3.5.1 体质量

如表3、图5 和图6 所示，在大鼠开始灌胃时，除正常组外，各组大鼠体质量接近，差异无统计学意义。至灌胃第13周取材时体质量分析发现：正常组大鼠与其余各组差异具有统计学意义（P＜0.05）；模型组与斑蝥组、高剂量组、中剂量组差异有统计学意义（P＜0.05），与低剂量组比较差异无意义。

3.5.2 肝脏指数、脾脏指数情况

如表4 和图7 所示：与正常组相比，各组大鼠肝脏、脾脏指数明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，斑蝥组、高剂量组、中剂量组的肝脏、脾脏指数均有不同程度下降（P＜0.05），其中以中剂量组下降最明显。

表3 大鼠体质量变化表（单位：g）

图5 大鼠体质量变化曲线图

图6 各组大鼠体质量比较

表4 肝脏、脾脏指数比较表

3.6 检测肝功能指标

检测ALT、AST、ALP、GGT结果示：与正常组相比，各组ALT、AST、ALP、GGT都明显升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，各给药组均可以不同程度降低ALT、AST、ALP、GGT，差异具有统计学意义（P＜0.05），其中中剂量组改善以上指标最显著，低剂量组肝功能与模型组最接近。与斑蝥组相比，中剂量组改善AST、ALP、GGT效果更好(P＜0.05)（见表5和图8）。

图7 肝脏指数、脾脏指数比较

表5 大鼠肝功能（ALT、AST、ALP、GGT）比较

图8 各组ALT、AST、ALP、GGT比较

表6 血清细胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ）比较

图9 各组IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 比较

3.7 细胞因子

通过Elisa 检测IL-6、IL-10、TNF-α与IFN-γ结果（见表6 和图9）所示：与正常组相比，各组的IL-6、IL-10、TNF-α均明显增高(P＜0.05)。与模型组相比，各给药组均可以不同程度降低IL-6、TNF-α（P＜0.05）,斑蝥组、高剂量组、中剂量组可以降低IL-10（P＜0.05），以中剂量组降低最为明显。且中剂量组降低IL-6、TNF-α的作用优于斑蝥组（P＜0.05）。与正常组相比，斑蝥组、中剂量组IFN-γ都有所升高（P＜0.05）。与模型组相比，斑蝥组、高剂量组、中剂量组均可以升高IFN-γ（P＜0.05）。

3.8 免疫组化检测肝组织COX-2、AFP的表达

免疫组化COX-2、AFP，阴性细胞呈蓝色，阳性细胞呈黄色或棕黄色，AFP、COX-2 阳性产物主要分布在细胞浆。结果如表7、图10、图11和图12所示：与正常组相比，各组COX-2、AFP 光密度值明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，斑蝥组、高剂量组、中剂量组的AFP、COX-2 光密度值有所下降（P＜0.05），以中剂量组降低最明显，且中剂量组降低AFP 效果优于斑蝥组（P＜0.05）。

4 讨论

图10 大鼠肝脏组织中AFP、COX-2 OD值比较

图11 大鼠肝组织AFP的表达（*400）

图12 大鼠肝组织COX-2的表达（*400）

通过查阅相关文献，本实验对SD 大鼠予以DEN 50 mg/kg每周一次腹腔注射[5]。在以往报道中，对于造模时间存在13-18周不等[6-8]，造模时间难以把握，故本实验自第13 周末开始每周取2 只大鼠肝脏行病理检查，至第17周证实大鼠肝癌诱导成功。

表7 AFP、COX-2光密度值比较

丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase，AST）主要存在于肝细胞中，是最常用的肝细胞破环和肝功能受损的指标。急慢性肝炎或肝硬化等慢性肝病中，ALT、AST 都会升高；碱性磷酸酶（Alkaline phospbatase，ALP）是主要分布于肝脏、骨骼、肠、肾等组织，经肝脏向胆外排出的一种酶，血清中γ-谷氨酰转肽酶（Gamma-glutamyl transpeptidase，GGT）主要来自肝脏，肝癌时会出现GGT、ALP 过多产生及排泄障碍，故目前临床上肝癌患者大多存在ALP、GGT 明显升高。有动物实验发现[9]，DNE 诱发大鼠PLC 的过程中，GGT 可被作为肝细胞变异的阳性标志，并且随着肿瘤的增大，GGT 会不断升高。目前研究中多把GGT、ALP 联合肿瘤标志物作为肝癌诊断的重要依据[10-11]。本实验观察到大鼠ALT、AST、ALP、GGT 有不同程度升高，说明DEN 导致的原发性肝癌大鼠存在肝功能损伤，且各组大鼠中AST/ALT＞1，因本实验中对肝癌大鼠观察时间为12 周，大鼠处于肝癌晚期，肝细胞稳态被打破，线粒体破坏，大量AST 释放。使用药物治疗后，各组大鼠肝功能指标与模型组相比均有不同程度改善，以中剂量组改善以上指标更明显。本研究认为，扶正祛邪抑癌方全方具有益气养阴，活血化瘀，清热解毒的作用，针对肝癌过程中的虚、瘀、毒的病理特点，从而达到改善以上指标的效果；另外现代药理研究中发现方中黄芪、白术、莪术等多种药物具有抗肿瘤、改善肝功能的效果。

慢性炎症通过提供炎症因子等生物活性物质促进肿瘤发生或诱导树突状细胞产生免疫抑制因子诱导肿瘤发生，并且保护癌细胞免受免疫攻击[12]。在HCC 中，病毒成分或炎性细胞因子，如TNF-α，通过酪氨酸激酶型受体起作用的生长因子，增强了HCC 细胞中p-SMAD3L（Ser-213）及其靶基因MMP-9的水平[13]。多项研究证实，TNF-α可以促进肝癌细胞转移[14-15]。IL-6是炎症反应中重要的细胞因子，IL-6与IL-6受体结合后可以通过IL-6/JAK2/STAT3、Ras/Erk 和PI3K/AKT等多条通路发挥其致癌活性[16]，有研究表明其IL-6 可促进肿瘤生长[17]。IL-10 是目前公认的炎症免疫抑制因子，被认为在肿瘤微环境中通过减少抗肿瘤免疫反应使肿瘤逃避免疫[18]。通过抑制促炎细胞因子的产生，下调共刺激分子以及主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)II 类的表达来抑制抗原呈递细胞（APCs）和T 细胞功能，被认为有助于免疫抑制环境，从而促进肿瘤逃逸[18-20]，叶韵斌等[21]在分析PLC 组织中细胞因子的表达中发现肝癌组织中IL-10 明显高于非癌组织。IFN-γ由自然杀伤细胞(NK细胞)和活化T细胞产生，具有抗肿瘤、抗病毒及调节免疫等作用。COX-2催化产物PGE2与肿瘤细胞上前列腺素受体结合，通过激活细胞内PI3K/Akt/mTOR信号，促进细胞增殖[22]，在临床研究中发现，抗肿瘤血管生成药物可诱导肿瘤组织缺氧，缺氧期间COX-2的上调并通过不同的VEGF 途径诱导血管生成，有研究发现加用COX2 抑制剂有助于克服子宫内膜癌、直肠癌等在治疗过程中的耐药[23-24]。

在实验中发现，与模型组相比，扶正祛邪抑癌方各剂量组，特别是中剂量组（等效药物剂量），能够降低血清中的IL-6、TNF-α、IL-10 水平，升高IFN-γ水平，降低肝脏组织中AFP、COX-2 的表达。因扶正祛邪抑癌方注重扶正解毒，研究证明方中黄芪、白术、土鳖虫等药物可以抗肿瘤、提高机体免疫功能，本研究认为可能是该方在一定程度上抑制了过度的炎症反应，提高了机体免疫水平，减少肿瘤细胞的逃逸，从而达到抗癌的效果。

在本实验中，使用扶正祛邪抑癌方低剂量、中剂量和高剂量进行灌胃，其中中剂量为等效药物剂量，实验证明其效果最佳。中医治病讲究的是辩证论治，根据疾病的病因病机，遵循“寒者热之”“热者寒之”“虚则补之”“实则泻之”等用药原则，但是若剂量过大则可能出现调整太过，从而效果欠佳，或者出现不良反应，故出现高剂量组效果不如中剂量组。所以在临床使用扶正祛邪抑癌方时，不宜在加大使用药物剂量。

综上所述，一定剂量的扶正祛邪抑癌方可以t 提高DEN 所致的原发性肝癌大鼠的生存率，改善其肝功能，调节大鼠体内细胞因子水平，降低肝脏组织中AFP、COX-2水平，从而对肝癌有一定治疗作用。