四神丸对腹泻型肠易激综合征模型大鼠及离体结肠的实验研究＊

刘 敏，薛 红，胡运莲

（1. 三亚市人民医院 三亚 572000；2. 中国中医科学院西苑医院 北京 100091；3. 湖北省中医院 武汉 430030）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种常见的功能性肠道病变，因应激事件诱发，主要表现为腹痛、腹胀、腹泻、便秘等症状，国际通常依照出现腹泻或者便秘将IBS 分为四型（腹泻型、便秘型、混合型和不定型），在我国腹泻型肠易激综合征（IBS with predominant diarrhea，IBS-D）患者较多，占到整个IBS 发病率的66.3%[1,2]。IBS-D 常常反复发作，由于缺乏理想的药物治疗，对患者的生活质量造成很大影响，因此亟需疗效确切的治疗药物。

四神丸最早见于宋·陈文中所著的《陈氏小儿痘疹方论》，由补骨脂、肉豆蔻、吴茱萸、五味子、大枣和生姜组成，是治疗脾肾阳虚泄泻的经典方。中医认为肾阳亏虚，脾失温煦，运化失司，发为泄泻是IBS-D 的病机变化特点[3]，因此四神丸的药性契合IBS-D 的病机，文献也显示以四神丸为基础方的加减治疗IBS-D临床疗效较佳[4,5]。由于缺乏较好的IBS-D动物模型和评价方法，IBS-D 的发病和病理生理变化还有待深入探究，目前四神丸对IBS-D 的药理作用特点和作用机制还不清楚[6]。近来有文献报道了改良的IBS-D 动物模型和评价方法，也发现IBS-D 发生与胃肠道动力调节失衡密切相关[7,8]。本研究拟采用母子分离联合慢性束缚应激和番泻叶灌胃法建立IBS-D 大鼠模型评价四神丸的作用效应，并通过观察四神丸对离体结肠动力作用来揭示四神丸的作用机制，为四神丸临床应用治疗IBS-D提供基础理论依据。

1 材料

1.1 动物

SPF 级SD 孕鼠10 只，孕期（18 ± 2）天，由思科贝（北京）生物技术有限公司提供，合格证编号：SCXK（京）2016-0002。造模全部使用新生雄鼠（饲养地点：湖北中医药大学实验动物中心；饲养条件：Ⅱ级，室温22-25℃，相对湿度45%-60%，自由进食、饮水。

1.2 试剂和药物

四神丸，北京同仁堂天然药物（唐山）有限公司，批号17090012，规格：27 g/瓶，研碎后过筛，用蒸馏水配制成0.72 g·mL-1、0.36 g·mL-1、0.18 g·mL-1的混悬液用于灌胃，放入4℃冰箱，备用。匹维溴铵片，法国苏威制药公司，规格: 50 mg/片，研碎后过筛，配制成1.5 mg·mL-1的药液备用。番泻叶（湖北中医药大学湖北省中医医院中药房提供并进行质量鉴定），水煎过滤浓缩成1g 生药/mL 的药液。其他试剂均由Sigma-Aldrich中国公司提供。

1.3 仪器

自制大鼠束缚网和带气囊的肠壁增压管（可通过三通管测定压力）；BIOPAC 生理记录仪采集系统（美国BIOPAC公司）；张力换能器（成都仪器厂）。

2 方法

2.1 模型制备与分组

选择由孕鼠生出的90 只SD 雄性乳大鼠，选取15只作为对照组，其余75 只参照文献[7,8]建立IBS-D 大鼠模型，将造模乳鼠从出生第2 天始每天上午与母鼠分开3 h，进行2周，对照组母子同笼。所有乳鼠出生3周后皆断奶并与母鼠分开放置，至大鼠体重达180 g 以上（大约7-8 周）后，采用自制束缚架对造模大鼠固定时间进行制动束缚3 h，连续3周（对照组不束缚）。造模大鼠在束缚应激第2周结束后开始给与番泻叶水煎剂（1 g·kg-1）灌胃，进行2 周，在此期间将造模动物随机分为模型组、中药组（SSW 高剂量组，SSW 中剂量组，SSW 低剂量组）、阳性药（匹维溴铵）组，在叠加番泻叶灌胃的同时，四神丸高、中、低剂量组动物每日按7.2 g·kg-1、3.6 g·kg-1、1.8 g·kg-1灌胃（分别相当于成人等效剂量的4、2、1倍），匹维溴铵组按15 mg·kg-1（相当于成人等效剂量的2 倍），连续灌胃4 周。模型组和对照组灌胃等量生理盐水。离体肠管实验直接将混悬液进行稀释后使用。

2.2 内脏高敏感性的测定

异氟烷气体麻醉后，将涂石蜡油的带气囊的增压管插入肛门约6 cm，固定在尾根部，并把实验大鼠限制于透明盒中，待动物清醒后，对球囊充气模拟肠道对机械刺激的敏感性，造成直肠扩张而引发大鼠腹壁逃避反射（abdominal withdrawal reflex，AWR），实验按照20、40、60、80 mmHg 四个压力值进行加压，每4 min加压20 s，每个压力值重复观察3 次，取平均值作为AWR 分值。AWR 分值的积分标准：0 分，未见明显变化；1 分，出现扭动头部等轻微不安变化，腹背部肌肉未见收缩；2 分，出现腹背部肌肉收缩，腹部未抬离地面；3分，出现腹背部肌肉较收缩，腹部抬离地面；4分，腹背部肌肉收缩，腹部呈弓状弯曲，腹部抬离地面。将AWR评分为3分时的压力阈值作为疼痛阈值。

2.3 粪便粒数和腹泻指数

单独放置大鼠，在固定时间笼内放置滤纸，保存4 h，记录每只大鼠粪便粒数，排稀便次数、粪便污迹的直径等腹泻情况，并计算腹泻指数（稀便率×平均稀便级）。稀便率是指每只大鼠所排稀便数（污迹数）与总便数（粪便粒数+污迹数）之比；稀便级是指稀便污迹面积的大小，按照污迹直径分为四级：＜1 cm 为一级，1-2 cm 为二级，2-3 cm 为三级，＞3 cm 为四级。平均稀便级=稀便级数总和/污迹数。

2.4 大鼠离体肠管实验

取15 只雄性成年大鼠，实验前禁食24 h，不禁水，脱颈后处死，取肛门远侧3-5 cm 左右的结肠，剪成1.5 cm 小段，去除联结的系膜和脂肪，洗净肠管，放入Tyrode 液（NaCl 136，KCl22，CaCl21.8，MgCl21，NaHCO312，NaH2PO40.6，Glucose 5，HEPES 10，mmol·L-1pH =7.4）浴槽中，将2 个三角形金属钩各一边穿过肠管，其中1 个固定浴槽底部，另1 个连接张力换能器，给予1.5 g 前负荷，稳定90 min，每隔15 min 换Tyrode 液，浴槽内温度维持在（37 ± 0.5）℃，持续通入95%O2和5%CO2混合气，张力换能器连接到BIOPAC 生理记录仪采集系统。首先观察SSW 对肠管自发收缩作用的影响：等待肠管稳定后，累积加入不同浓度SSW 混悬液（0.375-6 g·L-1），观察大鼠肠管的张力反应；然后观察SSW 对乙酰胆碱所致肠管收缩作用的影响：待肠管平稳后向浴槽内加入氯化乙酰胆碱（终浓度100 mmol·L-1），稳定后向浴槽内累积加入不同浓度的SSW混悬液，观察大鼠肠管的张力反应；最后观察SSW 对高钾所致肠管收缩作用的影响：待肠管平稳后向浴槽内加入无钙高钾Tyrode 液（正常Tyrode 液中的KCl 提高为60 mmol·L-1，并去除CaCl2），平稳后加入高钙高钾Tyrode 液（正常Tyrode 液中的KCl 提高为60 mmol·L-1，CaCl2提高为100 mmol·L-1），稳定后向浴槽内累积加入不同浓度的SSW 混悬液（0.375-6 g·L-1），观察大鼠肠管的张力反应。采用收缩抑制率反映药物引起的张力变化，计算公式如下：收缩抑制率（%）=（T2 -T0）/（T1 - T0）×100%，其中T0表示基础张力值，T1表示Ach 或高钾加入后张力值，T2表示SSW 加入后张力值。

2.5 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 一般状态

束缚前，各组大鼠状态良好，自主活动活跃皮毛有光泽，眼角无分泌物，耳廓呈淡粉色，大便干稀适中。束缚造模的3 h内排便量减少，而在束缚期最后1周，给予番泻叶灌胃后，模型组和给药组都很快出现稀便，造模结束后，对照组大鼠自主活动活跃，皮毛光洁，排便未见异常，模型组大鼠状态差，自主活动减少，抓取时反抗减弱，无光泽，眼角有分泌物，耳廓色淡，稀便明显增加，给药各组动物一般状态较模型组略好。各组实验大鼠部分脱落。

3.2 四神丸对IBS-D模型大鼠内脏敏感性的影响

与正常组比较，模型组大鼠对20 mmHg 压力下的AWR 评分和痛觉阈值具有显著差异（P＜0.05），提示模型组大鼠肠道痛觉敏感性增高。但是20 mmHg 以上压力下的AWR 评分无论正常组和模型组都明显提高，无显著差异（P＞0.05），提示高压力下的AWR评分对评价肠管的痛觉敏感性的意义较差。与模型组比较，SSW 低、中、高剂量组及匹维溴铵组痛觉压力阈值均明显升高且差异显著（P＜0.01）。SSW 中、高剂量组及匹维溴铵组在低压力下（20 mmHg 和40 mmHg）的AWR 评分也表现出明显差异（P＜0.05），提示四神丸可提高IBS-D模型大鼠肠道痛觉敏感性（表1）。

表1 四神丸对IBS-D模型的AWR评分的影响

3.3 四神丸对IBS-D模型大鼠腹泻的影响

与正常组比较，模型组大鼠粪便粒数出现明显增高（P＜0.01），而且粪便粒明显变软，并且出现稀便。与模型组比较，SSW 低、中、高剂量组及匹维溴铵组粪便粒数和腹泻指数均明显降低（P＜0.01或＜0.05），提示四神丸可减轻IBS-D模型大鼠的腹泻（表2）。

表2 四神丸对IBS-D模型的粪便粒数和腹泻指数的影响

3.4 四神丸对离体肠管的影响

平衡后可见离体肠管自发收缩舒张，加入梯度浓度SSW 混悬液（0.375-6 g·L-1）后，结肠自发收缩张力曲线未见明显变化。平衡后加入M 受体激动剂氯化乙酰胆碱（Ach）（终浓度10-4mol·L-1），可见张力明显增加，可维持20 min 未见明显变化。进入平台期后按累加浓度法加入SSW 混悬液（0.375-6 g·L-1），每个浓度作用5 min 后加入下一浓度。SSW 混悬液在1.5-6 g·L-1可呈剂量依赖性的减弱乙酰胆碱造成的肠管张力增加，图1A 显示一例SSW 对Ach 预收缩肠管呈剂量依赖性舒张作用张力变化图，计算各个浓度的收缩抑制率，建立浓度舒张效应曲线（图1B）。其中1.5 g·L-1，3 g·L-1，6 g·L-1对Ach 收缩作用的收缩抑制率分别为（80.7 ± 10.4）%（n= 7），（52.5 ± 13.9）%（n= 8），（34.7 ± 16.8）%（n= 6），与相同时间点未加入SSW 比较差异显著（P＜0.01）。平衡后加入无钙高钾Tyrode液可见自主舒缩减弱，重新平衡后加入高钙高钾Tyrode 液，可见张力明显增加，20 min内张力逐渐减弱至初始张力的70%以内，按累加浓度法加入SSW 混悬液（0.375-6 g/L），每个浓度作用5 min 后加入下一浓度。SSW 混悬液在0.75-6 g·L-1可呈剂量依赖性的减弱高钾造成的肠管张力增加，图2A 显示一例SSW 对高钾预收缩肠管呈剂量依赖性舒张作用张力变化图，计算各个浓度的舒张率，建立浓度舒张效应曲线（图2B）。其中0.75 g·L-1，1.5 g·L-1，3 g·L-1，6 g·L-1对高钾收缩作用的收缩抑制率分别为（72.6±4.1）%（n=8），（29.4±16.6）%（n=7），（11.2±10.8）%（n=8），（7.1±10.5）%（n=8），与相同时间点未加入SSW 比较差异显著（P＜0.01）。

图1 SSW对Ach预收缩肠管量效曲线

图2 SSW对高钾预收缩肠管量效曲线

4 讨论

腹泻型肠易激综合征是临床常见的消化内科疾患，其临床主要表现为晨起形寒肢冷，腹痛腹泻，得温痛减，并可伴有腰膝酸软等症状，该病发病因素复杂，具体机制目前尚不完全清楚，大量文献报道可能与脑－肠轴双向调节功能紊乱、肠道菌群紊乱、胃肠动力学失调、内脏高敏感性等多种因素有关[9]。中医临床认为IBS-D 可能与脾胃运化功能失调有关，虽然病位在肠，但是涉及肝脾肾三脏，主要表现为脾肾阳虚。作为治疗脾肾阳虚泄泻的名方四神丸能够温肾暖脾，涩肠止泻，用于脾肾虚寒，五更泄泻，久泄不止等病症的治疗，近来的文献报道以四神丸为基础方对腹泻型肠易激综合征的治疗优于其他中西药物[10-11]，但目前四神丸整体方剂的药理学研究相对较少，原因可能是还缺乏一致公认的IBS 动物模型[12]，而制备良好的IBS动物模型是研究发病机制、病理生理、药物治疗等方面的基础。有报道采用慢性不可预知轻度应激联合番泻叶浸剂灌胃造模符合IBS-D 证型特点，是一种较好的造模方式[13]。本研究采用母子分离联合慢性束缚应激造成不可预知轻度应激并联合番泻叶灌胃法制备IBS-D 大鼠模型，结果显示模型大鼠的肠道敏感性和腹泻状况均高于正常组，显示这种造模方法能够反应IBS-D 的临床特点，可以应用与对IBS-D 的深入研究。不同剂量的SSW 和阳性对照药匹维溴铵治疗4 周后，模型大鼠的痛觉压力阈值明显升高，而粪便粒数及腹泻指数均明显下降，说明四神丸能够从排便功能和内脏敏感性两个方面改善IBS-D 的病理生理异常，且具有浓度依赖性。但是在使用评价内脏敏感性指标AWR 评分时我们发现低压力下（20 mmHg上下）AWR评分变化比较显著，高压力下的AWR评分对评价肠管的痛觉敏感性的意义较差。只有联合应用AWR 评分和痛觉压力阈值2个指标，才能有效评价大鼠内脏敏感性的改变。

既往研究发现IBS-D 患者在空腹和进食后乙状结肠动力指数较正常人明显增高，而且移行性高幅收缩波的波幅及持续时间也异于正常人，肌肉松弛剂可有效改善IBS 患者腹痛症状[14,15]，表明IBS-D 发病过程中出现的腹泻和腹痛可能与肠道平滑肌功能紊乱造成张力异常密切相关，提示调节肠道平滑肌的张力异常有可能改善IBS-D 的症状。有研究表明四神丸对家兔离体肠管的自发活动有明显的抑制作用而且能够对抗BaCl2引起的肠道平滑肌痉挛，提示四神丸可能通过调节肠道平滑肌的张力发挥药效[16]。为进一步探究四神丸对肠道平滑肌张力的调节作用机制，本实验应用电生理技术观察了药物对正常大鼠离体结肠肠管的舒缩功能的影响，结果显示四神丸仅对乙酰胆碱或高钾刺激的肠管痉挛性收缩具有浓度依赖性的抑制效应，对正常的自发性舒缩无明显影响，表明四神丸对正常状态的肠功能影响相对较小，对收缩亢进肠管产生缓解作用。Ca2+是肠道平滑肌的兴奋-收缩偶联者，细胞内Ca2+的增加可引起肠道平滑肌收缩。作为平滑肌内兴奋传递的化学递质乙酰胆碱能够激动平滑肌细胞表面的M 胆碱能受体，一方面启动受体依赖型Ca2+通道（RDC），另一方面活化磷酸酯酶C，提高使三磷酸肌醇的含量而启动受体操纵型Ca2+通道（ROC），来增加肠管的收缩幅度和张力。高钾溶液可以引发电压依赖性的钙通道开放，引起外钙内流而促进内钙释放引发平滑肌收缩[17]。四神丸对Ach 和高钾刺激的肠管痉挛性的拮抗作用表明该药可能既能通过抑制内钙释放又能拮抗外钙内流缓解肠管的异常收缩。最近的报道显示四神丸可能通过保护肠道黏膜屏障、抑制炎症反应、改善胃肠道运动、消化系统的分泌功能紊乱和肠道内敏感性来达到治疗腹泻型肠易激综合征的作用[18,19]，提示四神丸可通过多种途径发挥作用，但具体机制有待进一步研究。

总之，四神丸可能通过其有效成分抑制肠道平滑肌细胞的内钙释放和拮抗外钙内流2种途径拮抗肠道的张力异常，改善肠痉挛引起的内脏敏感性增高和肠功能亢进引发的腹泻。本研究为四神丸治疗IBS-D提供了药理学依据。