CaM/CaMKⅡ在肠易激综合征大鼠脑肠互动中的表达及大建中汤干预效应研究＊

武 静，郑清海，王 慧，杨 毅，李尧锋，王俊霞，杨莎莎

（1. 贵州中医药大学基础医学院 贵阳 550025；2. 贵州中医药大学第一附属医院 贵阳 550002）

肠易激综合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是常见的消化系统疾病，临床上患者多以腹痛就诊，其病理基础为胃肠动力和内脏高敏性异常[1]。近年来研究证实CaMKⅡ在功能性胃肠病的发病中发挥重要作用，且参与痛觉过敏的形成，但作用机制不明。在此前提下本研究根据脑肠互动学说，将靶标定位到脑、肠，分别检测大鼠下丘脑和结肠CaM 信号通路关键基因CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白的表达，从而探讨肠易激综合征内脏痛的形成机制，并在此基础上探讨大建中汤对肠易激综合征的治疗机制。

1 材料

1.1 动物

SPF 级SD 大 鼠，雌 鼠16 只，雄 性8 只，体 质 量（150-170）g，由达硕生物科技有限公司提供，实验动物合格证号SCXK2019-15。自由饮食1 周后，为使雌鼠有效怀孕，分别将2 只雌鼠和1 只雄鼠放在一笼，雌鼠怀孕后再分开喂养。选择48 只雄性乳大鼠作为实验对象。

1.2 药物及试剂

大建中汤（贵州中医药大学第一附属医院药剂科提供）按比例（蜀椒∶干姜∶人参∶饴糖=1∶2∶1∶5）分别制成含生药1.5 g·mL-1剂量浓度的水浸液；匹维溴铵片（MYLAN LABORATORIES SAS 公司，批准文 号H20160396）；佐剂液态铝（Pierce 公司，批号QD218415 A）；卵清白蛋白（Sigma 公司，批号052K1275）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中山金桥生物技术有限公司，批号ZB-2301）；总蛋白提取试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，批号PC0020）；蛋白质定量试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，批号P1511）；实时荧光定量PCR试剂盒（美国Promega公司，批号0000042197）；Cam/CaMKⅡ引物（宝生物工程（大连）有限公司）。

1.3 仪器

石蜡包埋机（湖北欧美莱医疗科技有限责任公司，型号：YB-6D），石蜡切片机（德国莱卡公司，型号：RM2135），电子恒温水浴锅（上海胜卫电子科技有限公司，型号：J-HH-4A），光学显微镜（日本Nikon公司，型号：80i），多功能酶标仪（美国Perkin Elmer 公司，型号：EnSpire），Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统（美国Media Cybernetics 公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司，型号：GelDoc2000）。

2 方法

2.1 模型制备

根据相关文献[2]改良制备IBS 内脏痛大鼠模型。从出生第2 天起母婴分离每天3 h（8:00-11:00），不予哺乳，正常组母子同笼；第8-21 天增加0.5%乙酸直肠内刺激，每天1 次，每隔2 天增加0.1 mL，直至0.5 mL为止，正常组等量生理盐水灌肠。至第22 天起，正常饲养至第41 天；第42、46 天分别予腹腔注射30 g·L-1OVA 1 mL，正常组注射等量PBS；第47-57 天正常饲养。第58 天进行腹壁撤退反射（Abdominal withdrawal reaction，AWR）检测，评价内脏敏感性。

2.2 AWR检测

分别给予80、60、40、20 mmHg 压力，观察结直肠扩张（Colorectal distension，CRD）所产生的反应。每次扩张时间为20 s，重复6 次，每次间隔4 min，取6 次平均值。给与不同刺激时评分标准参照Al-chaer[3]，0分，大鼠情绪稳定；1分，偶有扭动头部；2分，腹背部肌肉轻微收缩；3分，腹背肌肉收缩的基础上出现腹部抬离地面；4分，腹部高离地面致使腹部呈弓状。

2.3 分组及给药

将造模成功的大鼠分为模型组，匹维溴铵对照组，大建中汤高、中、低剂量治疗组，每组8只。大建中汤组、匹维溴铵予相应药物混悬液灌胃，正常组和模型组分别给予等量0.9%生理盐水灌胃，给药2 周，并再次AWR检测。

2.4 取材

禁食12 h 后采用腹腔注射戊巴比妥钠（0.4%，10 mL·kg-1）麻醉，冰台上迅速取脑，分离下丘脑组织；同时切开腹腔在距离肛门7 cm 处取结肠3 cm，分3 段保存备用。

2.5 RT-PCR 检测各组大鼠结肠、下丘脑组织CaM/CaMKⅡ基因表达

按照反转录试剂盒要求操作，提取总RNA 及反转录合成模板cDNA，放置于-20℃保存备用。目标基因引物：CaMKⅡ引物序列，上游：5'-GATGTGCGACCCT GGAATGA-3'，下 游：5'-ATGTAGGCGATGCAGGCT GAC-3'，扩增长度：183 bp；CaM 引物序列，上游：5'-TCAGAACCCAACAGAGGCTGAA-3'，下游：5'-GTCA AAGACTCGGAATGCCTCAC-3'，扩增长度：160 bp；βactin 引物序列，上游：5'-GGAGATTACTGCCCTGGC TCCTA-3'，下游：5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC TG-3'，扩增长度：150 bp。以β-Actin 作为内参基因，得到各扩增反应的Ct值后，用比较Ct值法计算相对表达量。

2.6 Western blot 检测各组大鼠结肠、下丘脑组织CaM/CaMKⅡ蛋白表达

分别将结肠、下丘脑组织裂解剪成碎片匀浆，离心后提取组织蛋白；采用BCA 方法在标准曲线上定量检测目的蛋白；制胶、电泳、转膜后免疫检测：将PVDF膜加入适量封闭液，放入相应的一抗溶液，37℃恒温水浴摇床上封闭2 h，摇床上洗膜3次，将洗好的PVDF膜放于配制好的二抗溶液，摇床上孵育2 h 再洗膜；采ECL 法显色，并根据不同显影光强度调整曝光条件用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件进行扫描分析，以βactin 与目的蛋白密度比值作为待测目的蛋白相对表达量。

2.7 统计学方法

应用SPSS19.0 统计分析软件对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。多个样本均数间两两比较，采用最小显著差法（Least-Significant Difference，LSD）法。如样本资料不符合方差分析的条件，则采用完全随机设计的秩和检验（Kruskal-Wallis）。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般状况

正常组大鼠进食正常，毛发光泽，行动灵活；造模大鼠失去光泽，行动迟缓，喜好扎堆，收腹、舔舐腹部等现象；灌服大建中汤和匹维溴铵后，大鼠进食和毛发恢复正常，舔舐腹部现象消失。

3.2 对IBS内脏痛大鼠模型腹痛的影响

与正常组比较，模型组AWR 评分在60、40、20 mmHg 压力下增加，肠道痛觉明显上升（P＜0.05、P＜0.01），证明成功造模。与模型组相比，AWR 评分在40、20 mmHg 压力下，匹维溴铵组，大建中汤高、中剂量组明显降低（P＜0.05、P＜0.01），模型大鼠肠道痛觉减轻。与匹维溴铵组相比，在40 mmHg 压力下的AWR评分，大建中汤高剂量组治疗效果要优于匹维溴铵组（P＜0.05）（表1）。

表1 大建中汤对IBS内脏痛模型大鼠AWR评分的影响（xˉ± S，n = 8）

3.3 对IBS内脏痛模型大鼠结肠HE染色的影响

正常组的结肠上皮组织完整，黏膜连续，淋巴细胞散在，未见水肿和溃疡，未见明显病理改变。模型组结肠组织黏膜层不连续，腺体轻度水肿，固有层内散在分布少量淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等。匹维溴铵组和大建中汤组大鼠结肠黏膜上皮结构较完整，腺体排列规则，固有层及黏膜肌层结构清晰，固有层内有大量大肠腺分布，杯状细胞数量正常，肌层和浆膜层未见明显变性坏死和炎细胞浸润。提示大建中汤能够显著减轻模型大鼠肠道炎症、改善损伤（图1）。

图1 各组大鼠结肠组织病理学形态（HE×100）

3.4 对IBS 内脏痛模型大鼠结肠、下丘脑CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的影响

通过实时荧光定量RT-PCR 和Western Blot 技术检测显示，与正常组相比，模型组结肠、下丘脑组织中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，匹维溴铵组，大建中汤高、中剂量组结肠、下丘脑组织中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平显著降低（P＜0.01）（表2、表3）。

4 讨论

虽然肠易激综合征的病因和发病机制目前尚不明确，但大多数学者认为心理因素通过影响胃肠道黏膜屏障、感觉等生理功能，从而改变IBS患者的疾病体验和行为，因此提出“脑肠互动”假说，其互动调节失常与IBS 发生关系密切[4,5]。脑肠互动是胃肠道将各种刺激信号通过脊髓背根神经节及脊髓背角神经元突触，将内脏信息投射到感觉信息处理中枢下丘脑。下丘脑整合内脏信息后，由自主神经系统借传出神经元将调控信息传送到肠神经或直接作用于肠效应细胞，故本实验将靶标定位在下丘脑和结肠，探讨脑肠之间的互动机制。

表2 大建中汤对IBS内脏痛模型大鼠结肠、下丘脑CaM/CaMKⅡmRNA的影响（xˉ± S，n = 8）

表3 大建中汤对IBS内脏痛模型大鼠结肠、下丘脑CaM/CaMKⅡ蛋白的影响（xˉ± S，n = 8）

中医学认为IBS 病位在脾胃，病因有气滞、感寒、血凝、虫积等，病机为脾胃虚寒，运化乏力，气血不足“不荣则痛”及气机阻滞，气血经脉运行不畅“不通则痛”。《金匾要略》记载的大建中汤是治疗腹痛的经典方剂，其由干姜、人参、蜀椒、饴糖组成，针对腹痛病位在脾胃，脾胃虚寒之证，具有健脾止痛、温中散寒之功。临床研究也表明大建中汤能够治疗多种急慢性内脏痛，疗效确切[6]。

内脏高敏被认为是IBS 的最重要的病理基础，本研究结果表明，造模大鼠出现行动迟缓、收腹、舔舐腹部、肛周污浊等现象，符合IBS 内脏痛症状。IBS 内脏痛大鼠AWR 评分中4个扩张压力均有明显升高，表明模大鼠肠道在长期的伤害性刺激下形成IBS慢性内脏痛，由于中枢以及外周的双重疼痛敏化，大鼠痛阈降低，痛行为表现明显。与模型组比较，经大建中汤治疗后，大鼠在4 个扩张压力下均明显降低，趋于正常。表明大建中汤治疗能够使IBS 内脏痛大鼠痛阈升高，痛行为改善，提示大建中汤对内脏痛大鼠有明显的镇痛作用。

CaM 是重要的细胞信号传递物质，其与Ca2+形成Ca2+-CaM 复合物实现细胞内信号转导[7]。现已证明Ca2+-CaM 信号通路广泛存在于多种真核细胞内，Ca2+通过与CaM 结合，激活Ca 激酶Ⅱ（Ca2+-CaM 依赖的蛋白激酶Ⅱ）发挥作用。研究[8]表明Ca2+/CaMKⅡ是一种多功能CaM 激酶，可在细胞内被激活，在全身各组织内广泛分布。CaMKⅡ特有的身磷酸化机制可形成突触后膜长时程增强效应（Long-term potentiation,LTP），在中枢神经系统突触可塑性变化中发挥重要作用。近年研究发现CaMKⅡ尚参与痛觉过敏的形成，且在功能性胃肠病的发病中亦发挥重要作用[9]。本实验中，课题组采用母子分离、乙酸灌肠、鸡卵清白蛋白腹腔注射等复合造模方法，成功复制IBS 内脏痛大鼠模型。与正常组相比，模型组结肠、下丘脑组织中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，匹维溴铵组，大建中汤高、中剂量组结肠、下丘脑组织中CaM/CaMKⅡmRNA 和蛋白水平显著降低（P＜0.01），实验结果呈现出了CaM/CaMKⅡ在下丘脑和结肠中含量变化的同步性，不仅进一步表明CaM/CaMKⅡ与肠易激综合征的发病密切相关，同时也证实了“脑肠互动”学说。大建中汤能够通过抑制CaM/CaMKⅡ含量水平，降低IBS内脏痛觉高敏状态。实验中我们发现，在40 mmHg 压力下AWR 评分下大建中汤组优于匹维溴铵组，这可能与大建中汤的多靶点镇痛作用有关。我们前期研究发现[10]，大建中汤可通过抑制神经递质5-HT 产生和释放，下调神经递质5-HTP、5-HIAA 含量，从而达到镇痛作用，而匹维溴铵针对上述疼痛靶点的作用尚未相关报道。

本课题组从CAMKⅡ信号途径关键分子角度揭示肠易激综合征的发病机制以及大建中汤作用机制和科学内涵，基于“脑肠互动”及细胞信号转导理论探索肠易激综合征内脏痛的发生机制，有助于寻找到中医药治疗IBS 内脏痛的作用药靶部位，将为加快研发治疗IBS内脏痛的有效中医复方制剂提供科学依据。