心复康口服液干预心力衰竭大鼠心肌线粒体蛋白质组学研究＊

李琪琳，胡元会，吴华芹，王 欢，孙 伟，王辉奇

（1.中国中医科学院望京医院 北京 100102；2.中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

心力衰竭是一组常见的临床综合征，是大多数心血管疾病发展的最终归宿。随着现代人口老龄化进程的加快和高血压、冠心病等发病人数增多，心力衰竭发病率和病死率逐年上升，已成为人类健康的重大挑战之一[1]。心复康口服液是我们临床治疗心力衰竭的经验方，该方由黄芪、人参、丹参、灵芝、红花、淫羊藿、附子等中药组成，具有益气温阳、活血化瘀之功效。多年的临床和实验研究表明，心复康口服液可保护心肌缺血性损害，改善临床症状和心功能，提高患者的生活质量[2，3]。线粒体蛋白质组学是研究线粒体在生理、病理过程中的功能变化及其与疾病发生发展关系和机制的重要方法，目前已越来越受到医学界的重视和广泛关注。本实验采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解吸离子质谱技术，以心肌线粒体为切入点，研究心复康口服液对心力衰竭大鼠心肌线粒体蛋白质组学的影响，探讨其可能的作用机制，从而为心力衰竭的早期诊断、寻找新的治疗靶点提供思路。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

正常雄性SD大鼠30只（体质量200±20 g），购自北京维通利华实验动物有限公司（许可证号：SCXK(京)2012-0001），分笼饲养于中国中医科学院广安门医院SPF级动物房。

表1 等点聚焦程序设置

1.2 主要仪器

彩色多普勒超声显像仪（型号：HP5500，美国PHILIPS公司）；动物呼吸机（型号：HX-300S，成都泰盟科技有限公司）；多功能电泳系统（型号：MultiphorⅡ，美国Amersham公司）；垂直电泳槽（型号：ProteanⅡXi cell，美国Bio-Rad公司）；胶图扫描仪（型号：Power Look 2100XL，美国UMAX公司）；质谱仪（型号：4700 MALDITOF/TOF，美国AB SCIEX公司）；凝胶分析软件（型号：Imagemaster2D，美国Amersham Biosciense公司）；凝胶成像分析系统（型号：Gel Doc XR+，美国Bio-Rad公司）。

1.3 主要试剂

固相PH梯度干胶条（pH=3-10，L=18 cm）、IPG缓冲液（pH=3-10，美国Bio-Rad公司）；CHAPS、溴酚蓝、乙二胺四乙酸均购自美国Sigma公司；十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷、琼脂糖均购自美国Promega公司；考马斯亮蓝、标准蛋白标志物均购自美国Amersham pharmacia公司；乙腈、胰蛋白酶、甘氨酸均购自美国Fisher公司；转印膜（美国Millipore公司）；无水醋酸钠、无水碳酸钠、戊二醛、乙醇、冰醋酸等均为国产分析纯。

1.4 药物

心复康口服液（主要成分为黄芪、人参、丹参、灵芝、红花、淫羊藿、附子等，批号：20120312）。

1.5 抗体

一抗：Anti-GRP75 antibody、Anti-ATP5A antibody、Anti-Nucleophosmin antibody均购自美国Abcam公司；二抗：羊抗小鼠、羊抗兔购自北京中杉金桥公司。

2 方法

2.1 动物模型

参照Pfeffer[2]报导的方法，结扎冠状动脉左前降支，制备心肌死后心衰大鼠模型，术后连续3天注射20万单位青霉素以抗感染。假手术组制备：仅在冠状动脉前降支起始点下约2-3 mm穿线而末结扎前降支，余步骤与动物模型制备方法相同。

2.2 实验分组及给药

分组：动物购回后喂养标准合成饲料，适应性喂养5天，禁食12 h后，以体重均衡，随机分为假手术组与造模组，假手术组8只，造模组22只。造模组大鼠按动物模型复制方法所述方法造模，术后第2周对模型大鼠行超声心动检测，以EF减损＞15%为入选模型组标准。将入选模型大鼠随机分为模型组、心复康口服液组，每组大鼠不少于6只。给药；①假手术组：生理盐水4.0 mL·kg-1灌胃；②模型组：生理盐水4.0 mL·kg-1灌胃；③Xinfukang口服液组：5.4 g·kg-1溶于生理盐水灌胃。大鼠于分组后开始灌胃给药，连续给药8周，每天1次。

2.3 心肌线粒体分离

采用差数离心法提取心肌线粒体。造模后第8周末，将大鼠麻醉后，开胸迅速取出心脏。PBS缓冲液反复洗净心脏，称取100 mg心肌，加入1.5 mL匀浆介质，冰浴匀浆。4℃1 300 r·min-1离心15 min，保留上清，重复该步骤2次；取上清液于另一干净离心管中，4℃17 000 r·min-1离心15 min，弃上清，沉淀用0.2 mL匀浆介质悬浮，重复该步骤2次，弃上清，所得沉淀即为线粒体。

2.4 线粒体蛋白提取

于上述心肌线粒体样品中加入1 mL裂解液，涡旋振荡破碎，冰浴中静置4 min以上，使蛋白样品尽量溶解；4℃ 40 000 r·min-1离心1 h，弃沉淀，上清液即为提取的线粒体蛋白。采用Bradford法测蛋白含量，-80℃保存。

2.5 双向凝胶电泳

取蛋白样品0.8 mg，加泡胀缓冲液稀释至350 μL，充分混匀；在泡胀盘泡胀槽一侧加入上述样品混合液，将胶条放入泡胀盘，水化12 h。水化完毕后，将胶条取出，于等点聚焦仪内聚焦电泳，温度设置为20℃（表1）。聚焦结束，将胶条取出，在平衡液I中平衡15 min，然后换平衡液II中平衡15 min。将平衡后的胶条放到SDS-PAGE凝胶上端，用0.5%的琼脂糖封严，并将胶板固定于电泳槽内。加入电泳缓冲液，接通电源，直至溴酚蓝前沿距离凝胶底0.5 cm时停止电泳。每次同时运行3个蛋白样品，每个蛋白样品重复双向电泳3次，以确保结果的可重复性。电泳结束后，行考马斯亮蓝染色。

图1 双向凝胶电泳图

2.6 图像扫描与分析

染色后的凝胶通过UMAX PowerLook 2100XL扫描仪透射扫描获取图像。扫描完后，采用Imagemaster2D Platinum 5.0软件对胶图依次进行蛋白点的检测、背景扣除、匹配、标准化及人工校对处理，寻找差异表达的蛋白质点。

2.7 差异蛋白质点的胶内酶解

沿斑点染色边缘将差异蛋白点切下，用NH4HCO3溶液脱色30 min，重复2-3次。脱色后的胶块离心干燥20 min。干燥后加入6 mL胰蛋白酶液，4℃放置30 min，再加入20 mL胰酶覆盖液，置于37℃水浴箱酶解20 h。在胶块内加入15 μL 5%TFA，37℃温育30 min，吸取上清，然后加入15 μL 5%TFA/50%ACN，37℃温育30 min，吸取上清与上一次吸取液合并，再加入15 μL 100%ACN，室温静置5 min，吸取上清与上两次吸取液合并，离心干燥。用3 μL含0.5%TFA溶液溶解干燥好的肽段，即可用于质谱分析。

2.8 质谱分析及数据库检索

采用AB 4700型MALDI-TOF/TOF质谱仪进行质谱检测。设定胰蛋白酶自切峰（MH+:2163.05Da）作为内标进行校正，用l mL标准品与基质混合肽作为外标进行校正，获得相应的肽质量指纹图（PMF）。根据质荷比（M/Z）通过Mascot软件在线检索SwissProt蛋白数据库（http://www.matrixscience.com）以确定鉴定结果。

2.9 Western blot验证

采用差数离心法提取大鼠心肌线粒体蛋白。取蛋白样品50 μg，加入等体积样品缓冲液，混匀，100℃变性5 min；12%SDS-PAGE电泳，结束后半干转至PVDF膜。摇床上封闭2 h；杂交一抗，4℃过夜，洗膜，杂交二抗，室温摇床上2 h，洗膜。用ECL发光剂浸膜5 min，取出后置曝光匣中曝光。扫描曝光片后，应用Gel Doc凝胶成像系统分析底片的目的条带。

2.10 统计分析

实验获得的各计量数据以均数±标准差（xˉ±s）表示。模型组与假手术组、给药组与模型组灰度值相比大于2或小于0.5的蛋白点定义为差异蛋白点，其中大于2为表达上调，小于0.5为表达下调。PMF图谱分析以Mascot Score得分＞55为鉴定成功蛋白。

3 结果

3.1 双向凝胶电泳结果分析

各组双向凝胶电泳图谱如图1所示。图像经Imagemaster软件分析，假手术组可分辨蛋白点为698±35，模型组为712±42，心复康口服液组为677±52，双向电泳各组重复3次，每组分别将其中的一块分辨率高、质量好的凝胶定为参考胶，进行组内3块胶间的蛋白质点匹配，发现样品重复性好，制备稳定，可用于差异蛋白质点的分析。

3.2 差异蛋白点质谱鉴定结果

图2 459号点PMF图

表2 13个鉴定成功蛋白

模型组与假手术组相比有差异而心复康口服液可使差异趋势逆转的蛋白点为20个，对这20个蛋白点进行了MALDI-TOF-MS分析，获得20张PMF图谱（图2为459号点PMF图），PMF图谱数据经SwissProt数据库检索，成功鉴定出13个蛋白（表2）。其中心复康口服液上调的蛋白为鸟氨酸转氨酶（Ornithine aminotransferase）、谷胱甘肽S-转移酶P（Glutathione S-transferase P）、谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase）、3-磷酸甘油脱氢酶（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase）、ATP合成酶α亚基(ATP synthase subunit alpha)、磷酸丙糖异构酶（Triosephosphate isomerase）、α-烯醇酶（Alpha-enolase）、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(Pyruvate kinase isozymes M1/M2)，下调的蛋白为线粒体应激蛋白70（Stress-70 protein）、微管蛋白β-5(Tubulin beta-5)、葡萄糖调节蛋白78（78 kDa glucose-regulated protein）、核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin）、核内不均一核糖核蛋白 A2/B1（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1）。根据功能分类和生物学分析，这13个蛋白主要与能量代谢、应激反应、氧化损伤、细胞骨架、细胞分化增殖等功能相关。

3.3 部分差异蛋白回复性验证结果

与假手术组相比，模型组Stress-70、Nucleophosmin表达明显升高，ATP-α表达明显降低；与模型组相比，心复康口服液组Stress-70、Nucleophosmin表达明显降低，ATP-α表达明显升高（图3）。

4 讨论

心力衰竭是各种心脏病的终末阶段，其高患病率和高死亡率已俨然成为人类共同面对的一个公共健康问题。研究发现，无论心衰的基础原因是血流动力学异常、神经体液激素过度激活、功能性心肌丧失还是瓣膜异常等，均伴有线粒体结构和功能的改变[5-7]。因此，深入线粒体蛋白质组学研究对阐明心衰病理生理机制、发现新的治疗靶点具有举足轻重的意义。

中医认为心力衰竭的基本病机为气虚阳亏、血瘀水停，以益气温阳、活血利水为其主要治法。心复康口服液是我们临床治疗气虚血瘀型心衰经验方，该方由黄芪、人参、淫羊藿、灵芝、丹参、当归、川芎等中药组成，组方以益气温阳、活血化瘀为主，兼有利水消肿之功。既往实验研究中，通过建立不同动物模型，证实了心复康口服液对各种心肌损伤及心力衰竭模型具有钙拮抗、保护缺血心肌等药理作用，为其临床治疗心力衰竭提供了切实依据[8]。

本实验结果表明，模型组与假手术组相比有差异而心复康口服液可使差异趋势逆转的蛋白点共有20个，经质谱分析成功鉴定出13个蛋白，其中7个与能量代谢相关，2个与应激反应相关，1个与氧化损伤相关，1个与细胞骨架相关，2个与细胞分裂增殖相关。具体分述如下：

4.1 与能量代谢相关蛋白

心力衰竭时，心肌缺血缺氧，心肌能量代谢模式发生改变，表现为脂肪酸有氧氧化降低，氧化磷酸化减弱，葡萄糖无氧酵解增强，ATP生成总量明显下降[9，10]。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组参与氧化磷酸化的关键酶ATP-α亚基表达下调，经过心复康口服液治疗后ATP-α亚基表达上调，说明心复康口服液可使受损心肌氧化磷酸化得到保护，在一定程度上纠正心肌能量代谢障碍。既往研究也证实，心复康口服液可上调心肌梗死后心衰大鼠心肌细胞GLUT1mRNA表达，增加心肌组织中ATP含量[11，12]，这与本研究结果有类似之处。同时，我们也发现参与糖酵解的关键酶丙酮酸激酶同工酶M1/M2、3-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、α-烯醇酶在中药组表达上调，考虑其原因可能是心复康口服液一定程度上增强了心肌细胞糖酵解作用，以代偿性弥补ATP生成不足。

此外，本实验还发现中药组鸟氨酸转氨酶和谷氨酸脱氢酶表达上调，说明心复康口服液可调节模型动物氨基酸代谢失衡，并最终改善心肌能量代谢。

图3 Western blot验证结果

4.2 与应激反应相关蛋白

结扎冠状动脉致心梗后心衰，可诱导心肌细胞发生内质网应激(ERS)，介导细胞凋亡，加速心衰的发生发展[13，14]。应激蛋白70家族又名热休克蛋白70家族（HSP70），在防止应激引起的细胞损害或修复受损细胞方面发挥着重要作用。有研究示，HSP70血浆浓度越高，心力衰竭越严重[15]。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）属HSP70家族，目前国内外学者一致认为GRP78表达上调是ERS反应的开始[16，17]。本实验结果发现，模型组应激蛋白70、GRP78较假手术组表达上调，中药干预后两者表达下调，提示心复康口服液可减轻模型动物出现的应激反应，使受损心肌得到保护，但其作用机理有待明确。

4.3 与氧化损伤相关蛋白

研究发现，心力衰竭动物模型中氧自由基明显增加，抗氧化系统受损，过多的活性氧产生导致钙超载。当氧自由基生成过多或抗氧自由基物质活性降低，引起氧自由基堆积，导致氧化损伤[18]。谷胱甘肽转移酶(GST)是谷胱甘肽结合反应的关键酶，具有清除自由基、抗氧化的作用。GSTP是GST家族中的成员之一，本实验中，模型组GSTP表达下调，经中药治疗后表达上调，表明心复康口服液可减轻模型动物氧化损伤，提高心肌抗氧化能力，推测其机理可能与心复康口服液通过增加GSTP的表达，间接性的起到清除自由基作用有关。

4.4 与细胞骨架相关蛋白

微管蛋白是细胞骨架的重要组成成分。研究发现，微管蛋白在缺血缺氧后10 min即可出现明显改变，2 h内几乎已经完全破坏，表现为丝状结构的破坏及荧光强度的减弱[19，20]。本实验结果表明，经心复康口服液治疗后，模型组上调的微管蛋白β-5出现下调，提示心复康口服液在一定程度上可保护细胞骨架免于受损裂解。此前，有学者应用电镜硝酸镧电子示踪技术证实了心复康口服液能够保护心肌细胞的超微结构，减轻心肌膜通透性改变[21]，这与本实验结果相吻合。

4.5 与细胞分化增殖相关蛋白

核内不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)是一种重要的RNA连接蛋白，与细胞有丝分裂、成熟、分化及凋亡的调节相关。核仁磷酸蛋白（NPM）是一种多功能核仁磷酸化蛋白，参与核糖体前体运输和合成、中心体的复制、有丝分裂、DNA修补以及应激反应等生命活动，进而调控细胞的增殖发育等。研究发现，以上两种蛋白与肿瘤等增殖性疾病的发病密切相关[22，23]，但与心血管疾病关系鲜有报道。本实验结果显示，模型组hnRNPA2/B1和NPM表达均上调，中药组两者均下调，推测心复康口服液可能参与了调节心肌细胞分化增殖、减缓细胞凋亡、修复损伤心肌，但其具体作用机制有待进一步研究。

本实验采用Western blot技术，从蛋白水平验证线粒体Stress-70、ATP-α、Nucleophosmin在各组的表达水平，实验结果表明，模型组Stress-70、NPM表达上调，ATP-α表达下调，心复康口服液组Stress-70、NPM表达下调，ATP-α表达上调。此结果与蛋白质组学变化趋势一致，提示采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术，以心肌线粒体为切入点，研究心复康口服液对心衰大鼠心肌线粒体蛋白质组学的影响，结果真实可靠。