越鞠丸对Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠抗抑郁作用与前额叶场电位差异性分析＊

薛文达，聂瑞芳，周 童，陈 刚，王福顺，王 薇,,4＊＊

（1.南京中医药大学基础医学院转化系统生物学和神经科学研究中心/中医脑病重点实验室南京 210023；2.南京中医药大学医学与生命科学学院 南京 210023；3.南京中医药大学心理学院 南京 210023；4.南通大学神经再生协同创新中心 南通 226001）

抑郁症是一种以抑郁为主要症状的心境障碍或情感性障碍，常伴有自杀倾向而导致高死亡率和致残率，不利于个人的健康和社会的稳定[1，2]。其发病机制复杂多元，具体的病因现在仍然不是十分清楚。

目前临床上用于治疗抑郁症的药物大多起效缓慢、作用有限并且长期服用有毒副作用。近年来，氯胺酮以其快速持久抗抑郁作用成为抑郁症研究中的热点[3，4]。但是氯胺酮具有成瘾性、肝毒性、神经毒性等副作用，从而限制了其临床应用。中医药治疗抑郁症经验丰富，方药众多，且副作用小。其中，越鞠丸出自《丹溪心法·六郁》，由香附、川芎、栀子、苍术、神曲五味药组成，是治疗郁证的经典方。由于抑郁症与郁证具有相似性，因而越鞠丸也被广泛应用于现代抑郁症的治疗[5]。我们前期研究结果表明越鞠丸具有快速抗抑郁作用，并且越鞠丸的这种快速解郁与氯胺酮作用效果相似[6，7]。

在越鞠丸抗抑郁研究中发现，不同品系的小鼠对于越鞠丸易感性反应不同[8]。对于人体各类疾病包括神经精神疾病而言，小鼠是重要的模式动物，特别在疾病遗传物质研究方面，小鼠具有多方面的优势。在以小鼠作为模式动物研究抑郁相关行为时，不同的品系，如近交系与远交系之间存在巨大的差异，不同的近交系小鼠之间也有明显的差异性。近交系小鼠Balb/c、C57BL/6J、DBA/2J和远交系小鼠Swiss Webster在抗压方面的基底敏感性上有很大差异，这显示出遗传背景的影响作用[9]；对于慢性不可预知温和应激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型来说，Balb/c小鼠比Swiss小鼠更敏感[10]；而在产后母婴分离模型中，8种近交系小鼠（分别是129S1/SvImJ、129P3/J、A/J、Balb/cJ、Balb/cByJ、C57BL/6J、DBA/2J、FVB/NJ）在焦虑和抑郁表型上也表现出明显不同[11]。这些结果也表明不同品系小鼠由于遗传变异性不同，导致其对抑郁样反应易感性存在差异。

前额皮层是重要的加工整合中枢，更是情感回路中的核心结构[12]。近年来，人们越来越多地关注前额皮层相关通路是如何促进认知功能和情绪调节的[13-15]。研究认为前额皮层的病理生理学与多种精神疾病有关，包括精神分裂症和抑郁症[16，17]。目前已经证明，前额皮层相关通路暴露于急性或慢性应激源后，神经可塑性受损，并已确定抗抑郁药物和抗精神病药物可以恢复应激动物的神经可塑性[18]。考虑到有报道称氯胺酮对神经可塑性的早期影响可能与氯胺酮的抗精神病作用以及长期抗抑郁作用有关[19]，因而我们研究越鞠丸对于抑郁样小鼠前额皮层通路的场电位及长时程增强的影响。

本研究针对近交系Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠，拟采用行为学测试和离体脑片电生理检测，来分析越鞠丸在这两个品系小鼠中的抗抑郁作用差异以及对小鼠前额皮层突触传递的影响，以探讨越鞠丸在不同品系小鼠中作用差异的神经生物学机制，为临床用药提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠，雄性，7-8周龄，各30只，体质量20-24 g，购自南京市江宁青龙山动物繁殖场（动物合格证号：SCXK（苏）2014-0002）。实验前小鼠适应饲养环境1周，屏障间环境温度20-24℃，湿度40%-60%，昼夜交替时间12 h，小鼠可自由摄食饮水。

1.2 实验药物

实验中所用中药材购自南京中医药大学国医堂门诊部药房。越鞠丸由香附100 g、栀子100 g、川芎100 g、苍术100 g、神曲100 g组成，将药材打粉后过100目筛混匀。混合后将药粉浸泡于95%乙醇（6倍体积）中48 h，期间不停揽拌，静置后收集上清液，重复2次，收集3次获取的上清液，过滤，于55℃减压浓缩至无乙醇，获得醇提越鞠丸。药物制备好后于-20℃保存备用。临用前用生理盐水配制成所需浓度。

1.3 实验试剂和仪器

人工脑脊液（ACSF）（NaCl 119 mmol·L-1，KCl 2.5 mmol·L-1，NaH2PO41 mmol·L-1，NaHCO326.2 mmol·L-1，MgCl21.3 mmol·L-1，D-glucose 11 mmol·L-1，CaCl22.5 mmol·L-1，pH=7.4-7.5）；切片准备液（cutting solution）（Sucrose 194 mmol·L-1，NaCl 29.95 mmol·L-1，KCl 4.56 mmol·L-1，NaH2PO41.17 mmol·L-1，NaHCO325.96 mmol·L-1，MgCl20.1 mmol· L-1，D-glucose 9.99 mmol· L-1，CaCl21 mmol·L-1），实验所用试剂均购自中国国药公司。

旋转蒸发仪（南京金正教学仪器有限公司，RE-852）；超声清洗机（上海 Branson公司，SB5200-型）；台式离心机（德国Hermle公司，Z-32）；电子天平（METTLER公司，AE100）；振动切片机（德国leika公司，VT1200S型）；电极拉制仪（德国DMZ公司）；显微操纵仪（美国Sutter公司，ROE-200）；记录分析软件（美国Axon公司，PClamp10.1）；放大器（美国Axon公司，MultiClamp700B）；可编程刺激器（以色列A.M.P.I公司，Master-8）；隔离器（以色列A.M.P.I公司）；蠕动泵（中国润泽公司）。

1.4 强迫游泳测试

将Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠，分别随机分为空白对照组（Con）与越鞠丸给药组（YJ）。空白对照组：小鼠腹腔注射生理盐水；越鞠丸给药组：小鼠灌胃给予越鞠丸。实验动物给药30 min后进行行为学测试。强迫游泳测试如下：将小鼠放入高30 cm、直径18 cm的圆柱形玻璃缸中，缸中水深10 cm，水温（25±2）℃ ，观察小鼠在缸中游泳6 min，记录后4 min内小鼠的累积不动时间。不动时间是指小鼠在水中停止挣扎、呈漂浮状态，或仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的时间。行为分析采用ANY-maze软件。

1.5 脑片制备

图1 越鞠丸在Balb/c小鼠与C57BL/6J小鼠上的抗抑郁作用

小鼠灌胃给予越鞠丸，给药30 min后经吸入异氟烷麻醉后断头取脑，从断头至脑组织取出时间应小于1 min，完整取出脑组织修形后用少量502胶将其与切片机标本托垂直粘合后置于切片槽中，随后置于蔗糖冰水混合溶液中冷却，在同样的溶液中用振动切片机将包含前额叶的前脑冠状位切片，厚度为300 μm。将脑片转至32℃的人工脑脊液中孵育1 h，然后室温下孵育30 min。所有溶液均持续给予95%O2和5%CO2的混合气体，并维持pH值7.4-7.5。

1.6 电生理细胞外场电位和长时程增强作用的记录

脑片孵育结束后转移至灌流槽的载玻片上，用盖网固定，以1-2 mL·min-1持续灌流脑片，持续给予95%O2和5%CO2的混合气体，刺激电极置于前额叶皮层第ⅴ层，玻璃记录电极充灌人工脑脊液作为电极内液并置于前额叶皮层第Ⅱ-Ⅲ层。连接MultiClamp700B放大器，在电流钳（Current-clamp mode）模式下，用0.03 Hz的刺激频率诱发场电位，并记录波形。相同刺激频率诱发场电位后记录20 min。当场电位记录基线稳定记录10 min后，给予4×100 HZ的高频theta波刺激（high frequency stimulation，HFS）来诱发长时程增强，引起场电位幅度大于50%的变化并持续记录60 min为诱发长时程增强成功。

1.7 统计分析

所有数据均采用SPSS 20.0统计软件进行处理分析，数据均采用xˉ±s表示。组间两两比较采用t检验。P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 越鞠丸在Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠上抗抑郁作用比较

强迫游泳测试结果显示，与对照组相比，单次给予越鞠丸，能够显著减少Balb/c小鼠的不动时间（P＜0.001）（图1A），表现出抗抑郁作用；而与对照组相比，单次给予越鞠丸，C57BL/6J小鼠的不动时间则无显著性变化（P＞0.05）（图1B）。

2.2 Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠PFC区的fEPSP比较

小鼠脑片PFC区电生理实验记录（图2），结果显示Balb/c小鼠的越鞠丸组与对照组相比，fEPSP斜率百分比显著升高（P ＜ 0.01）（图2A）；而C57BL/6J小鼠的越鞠丸组和对照组相比，fEPSP斜率百分比则无显著性差异（P＞0.05）（图2B）。

2.3 Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠PFC区的LTP比较

fEPSP记录后给予HFS来诱发LTP，结果显示Balb/c小鼠与C57BL/6J小鼠的对照组和越鞠丸组的斜率都显著增加，表明给予HFS后能够成功诱发出稳定的LTP，提示给予HFS后均能在Balb/c小鼠与C57BL/6J小鼠中诱发前额皮层神经元突触传递的明显增强（图3）。其中，Balb/c小鼠的越鞠丸组与对照组相比，fEPSP斜率百分比显著升高（P ＜0.01）（图3A）；而C57BL/6J小鼠越鞠丸组和对照组相比，fEPSP斜率百分比则无显著性差异（P＞0.05）（图3B）。

3 讨论

本研究比较分析了越鞠丸在Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠中的抗抑郁作用，结果显示越鞠丸能够改善Balb/c小鼠的抑郁样表型；进一步检测两个品系小鼠脑片前额皮层区的场电位和长时程增强，发现越鞠丸能够增加Balb/c小鼠前额皮层的场电位及长时程增强，提示越鞠丸通过提高突触传递效能，从而产生抗抑郁作用。

图2 Balb/c小鼠与C57BL/6J小鼠脑片PFC区fEPSP的比较 数字横纵坐标向内

图3 Balb/c小鼠与C57BL/6J小鼠脑片PFC区LTP的比较 数字横纵坐标向内

越鞠丸，功用行气解郁，是治疗郁证的经典方，然而其作用特点和分子机制的研究相对较少。我们前期研究结果支持越鞠丸的抗抑郁作用具有快速性的特点：运用动物模型实验发现越鞠丸醇提物单次灌胃一天后即可检测到对获得性无助抑郁行为的缓解作用[6]，而常规单胺类药物在此模型上至少需要七天以上处理时间才能起作用[7]，并且越鞠丸的快速抗抑郁作用效果与氯胺酮相似；另外，应用模拟临床慢性抑郁的小鼠模型，发现单次给予越鞠丸两小时后，可产生与氯胺酮类似的缓解快感缺失的症状，与之相比，5-HT重摄取抑制剂（SSRIs）类代表性药物氟西汀就不能起效。本研究选用强迫游泳测试来检测越鞠丸在两种近交品系小鼠中的抗抑郁作用。而小鼠强迫游泳测试在行为药理实验中，对于抗抑郁药物的快速筛选至关重要，在行为学测试中强迫游泳应激可以使小鼠出现行为绝望状态。而在本研究中，单次给予越鞠丸，能够显著降低Balb/c小鼠在强迫游泳测试中的不动时间，有效改善Balb/c小鼠的抑郁样状态。

就抑郁症发生发展的机制来说，目前更广泛认同的是神经可塑性假说，该假说认为抑郁症主要是由情感相关脑区的神经可塑性在应对不良适应比如应激时所引起的，而抗抑郁药物则是在抗抑郁治疗中所引起的神经信号传导、细胞内特定基因和蛋白质、神经系统可塑性等方面的变化是抗抑郁作用的微观基础。前期研究发现，越鞠丸醇提物具有快速起效的抗抑郁作用，这种作用可以迅速增强海马脑区脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达[6]，并持久激活环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）信号，提示CREB及其相关的突触可塑性信号通过调节BDNF的表达参与了越鞠丸的快速抗抑郁作用[8]。后续研究中我们发现越鞠丸的快速抗抑郁作用与激活PKA-CREB-BDNF信号通路相关。cAMP依赖蛋白激酶（cAMP-dependent protein kinase，PKA）可以磷酸化并激活CREB，而细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）则是PKA-CREB信号通路的重要调节蛋白，因而PKA-ERK-CREB信号通路在抑郁症的发病机制和抗抑郁机制中起着重要作用。任荔等[7]研究显示与抑郁模型小鼠相比，越鞠丸给药小鼠的海马中PKA、CREB信号显著上调，这说明越鞠丸特异性地作用于该信号通路。有研究表明，蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamcycin，mTOR）参与了氯胺酮的快速抗抑郁过程。而我们的研究显示，越鞠丸也可快速激活Akt、mTOR，进一步促进神经可塑性变化，从而在动物模型上表现出明显的抗抑郁作用。mTOR与神经元的长时程增强和长时程抑制的诱导和维持有关，进而影响突触传递。突触传递是调控突触可塑性稳态的重要机制之一，而fEPSP和LTP则是突触传递重要的表现形式[20，21]。很多研究证明LTP的增加与AMPA受体在膜上的增加有关，从而增加了谷氨酸能的传递[22]，这与我们前期验证越鞠丸改变了前额皮层上NMDAR与AMPAR的比例关系结果相一致[23]。本研究的电生理实验也证实，在Balb/c小鼠中，越鞠丸组较对照组的fEPSP斜率百分比显著升高，且在给予HFS诱发LTP后越鞠丸组的fEPSP斜率百分比明显上升，表明越鞠丸增强了Balb/c小鼠前额皮层突触传递。

本研究中C57BL/6J小鼠与Balb/c小鼠在同等条件下进行实验，但是C57BL/6J小鼠在行为学测试与电生理测试中结果显示均无统计学差异，说明不同品系的小鼠对于越鞠丸易感性反应不同，这种品系易感性差异可能与动物的遗传背景密切相关[24]。Bearss等研究发现Balb/c和C57BL/6的免疫应答包括细胞募集动力学和下游细胞功能不同[25]。Tarantino等研究显示与C57BL/6小鼠相比，Balb/c小鼠在焦虑和抑郁的行为模型中被认为是更适合的研究对象[26]。通过不同品系小鼠的行为、细胞、分子多层次研究来分析抑郁症的病因病机，可提供更适合的抑郁症研究模型和更科学的抗抑郁药效测试[27]。在遗传学研究的基础上对不同品系小鼠进行辨证论治，也是中医证候模型的一大研究方向。

本研究通过行为学测试来分析越鞠丸在近交系Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠中的抗抑郁作用差异，并利用电生理学方法来研究越鞠丸对小鼠前额皮层基础场电位及长时程增强的影响，探讨越鞠丸在两个品系小鼠中突触传递效能作用差异的神经生物学机制。下一步应继续研究越鞠丸对于基础场电位及长时程增强的影响是如何产生作用的，进一步深入分析越鞠丸发挥持久抗抑郁作用的分子机制，为其临床应用提供理论依据。