广藿香超声辅助提取工艺考察＊

朱浩东，吴卓娜，吴卫刚，王 冰，张 彤＊＊

（1.上海中医药大学中药学院 上海 201203；2.河北楚风中药饮片有限公司安国 071200；3.上海中医药大学教学实验中心 上海 201203）

广藿香药材为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.的干燥地上部分，具有芳香化浊，和中止呕，发表解暑之功效[1]。广藿香的化学成分包括挥发油、黄酮和生物碱等[2]，挥发油为其主要活性成分[3]，具有抗炎、抗真菌[2]、镇痛[4]、化痰止咳[5]、杀虫抑菌[6，7]等药理作用。广藿香挥发油中广藿香醇（Patchouli alcohol，PA）含量最高[8]，亦称百秋李醇，是一种三环倍半萜类小分子挥发性化合物[2]。2015版《中国药典》将广藿香醇作为广藿香药材及广藿香油的含量测定指标[1，9]。

目前，广藿香醇含量测定法主要为气相色谱法[10-16]。现有的广藿香油及广藿香醇的提取方法，主要有浸提法[17]、CO2超临界萃取法（SFE-CO2）[18，19]、水蒸汽蒸馏法[18，20]及三氯甲烷超声辅助提取法[1，21]等 。 其中，浸提法耗时过长，SFE-CO2法所需设备昂贵，水蒸汽蒸馏法耗能较大，而超声辅助提取法具有提取时间短、提取效率高的特点，可防止一些不稳定物质在高温和长时间提取条件下发生降解、褪色等变化[22，23]，适合于以广藿香挥发油或广藿香醇的提取工艺。但现有的三氯甲烷超声辅助提取法，所用提取溶剂安全性不佳，考察以安全性更好的乙醇为溶剂进行广藿香超声辅助提取非常有必要。因此，本文以提取时间（min），乙醇浓度（%）和液料比（mL·g-1）为影响因素，以提取物中广藿香醇的含量为考察指标，利用单因素试验优化广藿香超声辅助提取工艺，并用GC-FID法测定广藿香醇含量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

气相色谱仪（7890B，美国Agilent公司）；氢火焰离子化检测器（Agilent公司）；超声波清洗机（SB5200D，宁波新芝生物科技股份有限公司）；粉碎机（上海广沙工贸有限公司）；电子分析天平（XS105DU，瑞士梅特勒-托利多公司）；电子天平（BS124S，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（DK-S24，上海精宏实验设备有限公司）；循环水式多用真空泵（SHBIIIS，郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试剂

图1 空白溶剂、内标溶液、对照品溶液及供试品溶液GC-FID色谱图

广藿香醇对照品（99%，110772-201608，中国食品药品检定研究院）；正十八烷（20160706，国药集团化学试剂有限公司）；水为纯化水；乙醇除特殊标记，均为95%乙醇，其余试剂均为分析纯。广藿香饮片（茎和叶）采购自广东道地良药馆（0016M60913），经上海中医药大学张红梅博士鉴定为广藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.，现保存于上海中医药大学教学实验中心。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[1]

弹性石英毛细管柱（Agilent HP-5：30 m×0.32 mm，0.25 μm）；程序升温：初始温度150℃，保持23 min，以3℃·min-1的速率升至230℃，保持2 min；进样口温度：280℃；检测器温度：280℃；分流比：20:1；进样量：1 μL。

2.2 对照品贮备液的制备

精密称取广藿香醇对照品35.57 mg，置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇溶解定容，摇匀，制成浓度为3.557 mg·mL-1的对照品贮备液[24，25]，置 4℃冰箱冷藏备用。

2.3 内标溶液的制备

精密称取正十八烷507.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加正己烷溶解定容，摇匀，制成浓度为5.070 mg·mL-1的内标溶液，置4℃冰箱冷藏备用。

2.4 供试品溶液的制备

精密称取广藿香粗粉3.00 g置具塞锥形瓶，加入60 mL95%乙醇，超声提取30 min，滤过，收集滤液，回收溶剂至干，以少量多次原则滴加乙醇溶解提取物[25]，转至10 mL容量瓶，精密加入1 mL内标溶液，乙醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，续滤液即为供试品溶液。

2.5 专属性考察

精密称取一定量广藿香粗粉，按“2.4供试品溶液的制备”方法，制得样品溶液。分别取空白乙醇溶液、内标溶液、对照品溶液及供试品溶液，按“2.1”项下条件，进样GC系统测定。比较空白乙醇溶液及内标溶液对广藿香醇的测定有无干扰。结果表明，在该方法下空白溶剂和内标物正十八烷对广藿香醇的测定无干扰（图1）。

2.6 线性关系考察

分别精密吸取广藿香醇对照品贮备液2000、1000、800、600、400、200、100 µL于5 mL量瓶，精密加入0.5 mL内标溶液，乙醇定容至刻度，摇匀，制成浓度分别为1.4228、0.7114、0.5691、0.4268、0.2846、0.1423和0.0711 mg·mL-1的系列广藿香醇对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，取1µL续滤液注入气相色谱仪，记录峰面积，以质量浓度（mg·mL-1）为横坐标，广藿香醇对照品峰面积与内标物峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。得线性回归方程为y=1.8104x+0.0031，r=0.9999，结果表明，广藿香醇在0.0711-1.4228 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.7 精密度考察

2.7.1 日内精密度

精密吸取 0.1423、0.4268、0.7114 mg·mL-1的低、中、高三个浓度的广藿香醇对照品溶液，按“2.1”项下条件，分别连续重复进样6次，记录峰面积并计算RSD值。RSD值分别为0.17%、0.73%、0.22%。

表1 加样回收率结果

2.7.2 日间精密度

精密吸取 0.1423、0.4268、0.7114 mg·mL-1的低、中、高三个浓度的广藿香醇对照品溶液，按“2.1”项下条件，连续3天，每天重复进样3次，记录峰面积并计算RSD值。RSD值分别为0.73%、1.02%、1.17%。

2.8 重复性考察

按“2.4供试品溶液的制备”方法，平行制备6份样品溶液，进样GC系统测定广藿香醇含量，并计算RSD值。RSD为0.88%，表明该方法重复性好。

2.9 稳定性考察

精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12和24 h进样GC系统测定，记录峰面积并计算RSD值。RSD值为0.56%，表明样品在测定的24 h内稳定。

2.10 加样回收率考察

精密称取已知含量的广藿香粗粉9份，每份1.50 g，分为低、中、高浓度3组，每组3份，分别加入相当于样品含量50%、100%和150%的广藿香醇对照品溶液，按“2.4供试品溶液的制备”方法制得样品溶液，按“2.1”项下GC条件测定广藿香醇的含量，并计算低、中、高三个浓度的加样回收率。

在50%、100%和150%的对照品加入量下，广藿香醇测定方法的平均回收率分别为98.88%、98.36%和102.18%，且RSD值均＜3.00%，说明该方法回收率较好（表1）。

3 提取工艺考察

3.1 提取时间考察

精密称取广藿香粗粉3.00 g置具塞锥形瓶，平行3份，加入48 mL乙醇溶液，分别超声提取20、30、40、50、60 min，滤过，收集滤液，回收溶剂，以少量多次原则滴加乙醇溶解提取物，转至10 mL容量瓶，精密加入1 mL内标溶液，乙醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，按“2.1”项下条件，进样GC系统测定广藿香醇含量。由图2可知，随着提取时间延长，当提取时间在20-30 min时，广藿香醇含量不断增加；但当提取时间超过30 min以上时，广藿香醇含量并未随提取时间延长而增加。因此，选择超声提取30 min较为适宜。

3.2 乙醇浓度考察

精密称取广藿香粗粉3.00 g置具塞锥形瓶，平行三份，分别加入80%、85%、90%、95%、100%浓度的乙醇溶液48 mL，超声提取30 min，滤过，收集滤液，回收溶剂，以少量多次原则滴加乙醇溶解提取物，转至10 mL容量瓶，精密加入1 mL内标溶液，乙醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，按“2.1”项下条件，进样GC系统测定广藿香醇含量。当乙醇浓度在80%-90%范围内时，提取物中广藿香醇含量的升高趋势较小；当乙醇浓度由90%-95%时，提取物中广藿香醇含量增加较大；当乙醇浓度为100%时，广藿香醇含量并无明显提高（图3）。因此，选择95%浓度乙醇作为提取溶液较适宜。

3.3 液料比考察

精密称取广藿香粗粉3.00 g置具塞锥形瓶，平行3份，分别加入24、36、48、60、72 mL乙醇溶液，超声提取30 min，滤过，收集滤液，回收溶剂，以少量多次原则滴加乙醇溶解提取物，转至10 mL容量瓶，精密加入1 mL内标溶液，乙醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，按“2.1”项下条件，进样GC系统测定广藿香醇含量。当料液比在8∶1-20∶1 mL·g-1时，广藿香醇含量呈上升趋势，并且在20∶1 mL·g-1时含量最高；当液料比增大至24∶1时广藿香醇含量并无提高（图4）。因此，确定液料比为20∶1 mL·g-1较为适宜。

图2 提取时间对广藿香醇含量的影响（n=3）

图3 乙醇浓度对广藿香醇含量的影响（n=3）

图4 液料比对广藿香醇含量的影响（n=3）

4 讨论与总结

广藿香醇为广藿香的主要活性成分，为一种挥发性的小分子化合物，不溶于水，而溶于醇、醚等有机溶剂。然而广藿香醇不易从广藿香中直接提取，故常以广藿香提取物或广藿香油作为药用成分。目前关于广藿香提取工艺的报道，较少以乙醇作为提取溶剂，且多以出油率作为考察指标。受生长条件、提取工艺等因素影响，出油率并不一定能反映广藿香醇含量。因此，以广藿香醇含量为指标进行工艺优化有一定的必要性。

因文献报道广藿香乙醇提取物不能完全溶于正己烷[25]，经实验发现以正己烷溶解本实验乙醇提取物时亦有溶解不完全现象，而研究报道广藿香醇在95%乙醇中溶解性好[24]，因此，为保证提取物中广藿香醇能够提取完全，在供试品溶液制备时，本文选择更为安全绿色的95%乙醇作为供试品溶液制备的提取溶剂，而未选用药典中测定药材所使用的正己烷作为供试品处理溶剂。

本文以广藿香醇含量为指标，从对于提取效果影响较大的提取时间、乙醇浓度、料液比三个主要因素进行单因素考察，确定适宜广藿香药材最佳超声辅助提取条件为：超声时间30 min，乙醇浓度为95%，液料比20∶1 mL·g-1。在该工艺条件下，广藿香醇提取率为32.75%，含量为0.15%（按干燥药材计）。该法便于产业化操作，安全无污染，为广藿香醇的工业超声辅助提取工艺的应用提供了实验室依据。