藏医“白脉病疗法”对脑缺血再灌注大鼠CD34、VEGF1、GAP-43蛋白表达的影响＊

李龙梅，郑丽娟，祝日荣，毛 萌，仁青加，邓志云，李佳林，武佳杰，任小巧＊＊

（1.北京中医药大学民族医药学研究所 北京 100029；2.北京中医药大学中医学院北京 100029；3.西藏藏医学院藏医药研究所 拉萨 850000）

近年来，脑损伤后机体的内源性修复机制的研究逐渐深入，越来越多的研究结果表明，神经再生是脑损伤后运动功能恢复的基础。因此，寻找挖掘能有效增加神经再生的医疗康复手段，同时配合常规的运动和物理治疗，将更加有助于脑卒中患者肢体运动功能的恢复。本研究团队的实验发现白脉病疗法对脑缺血大鼠脑组织有保护作用[1]，为进一步探讨其作用机制，本实验应用免疫组化技术分别检测了CD34蛋白、VEGF1蛋白、GAP-43蛋白在各组大鼠缺血再灌注后7天、14天两个时间点的表达量，以此评价白脉病疗法对于脑缺血大鼠的神经和血管再生的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性SD大鼠75只，清洁级（SPF），体重250±10 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。许可证号SCXK（京）2011-0004。饲养于北京中医药大学清洁级动物房，饲养温度20℃-24℃，正常饮食，自由饮水，适应性饲养5天。所有实验动物的操作流程及饲养条件均符合实验动物管理饲养条例，并遵循人道主义原则。

1.1.2 药物、试剂和设备

如意珍宝丸（生产批号:20150116），购自金科藏药股份有限公司；白脉软膏（生产批号:130826），购自西藏奇正藏药股份有限公司；辛伐他丁：默沙东制药有限公司；（ZLI-9064）柠檬酸盐缓冲液、（PV-9001）超敏型抗兔kit、DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠抗VEGF单克隆抗体、兔抗GAP-43多克隆抗体，美国Abcam公司；电热恒温培养箱（DH4000 AB型），天津市泰斯特仪器有限公司；BX40型光学显微镜、E320型显微照相机，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 局灶性脑缺血再灌注模型制备

参照Belayev报道的线栓法加以改良后建立右侧大脑中动脉栓塞缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。手术前1天禁食，自由饮水。缺血1.5 h后将漏在皮肤外的线栓拔出1 cm并剪断，使大脑动脉Willis环和MCA恢复血供，造成缺血再灌注模型，保持体温至清醒。造模后将动物置于放有清洁垫料的鼠笼内，自由饮水、进食。假手术组只进行术前麻醉和血管分离术，不结扎及导入线栓。手术过程中室温保持在24-25℃。

1.2.2 分组与给药

（1）分组：假手术组10只（Sham，S），其余55只动物于麻醉清醒后6 h时参照Zea Longa[8]5分制评分标准进行神经行为学评分，并以此评价、判断模型是否成功。评分为1-3分的纳入本研究。采用随机表将每个分值的大鼠分配到4组，即模型组（model，M）；阳性对照组（positive control group，P）；如意珍宝丸组(Ruyizhenbao pills group，R)；白脉病疗法组(Baimai therapy group，BT)，以此保证每组大鼠神经行为学评分没有显著性差异。每组又分为缺血再灌注7d、14d两个亚组。

（2）给药：各组大鼠每天1次灌胃，并涂抹相应的药物，从造模后开始给药至处死。如意珍宝丸组、白脉疗法组灌胃给与如意珍宝丸混悬液，灌胃给药量依据不同种类动物之间药物剂量换算法为依据，按成人（70 kg计算）每日每公斤体质量药量的6.3倍计算，如意珍宝丸成人每天用量5片，每天2次，每片重0.5 g，折合计算得每100 g体重给药约0.052 g，用生理盐水配成0.052 g·ml-1的药液，即每100 g体重灌胃1 mL药液，按1 mL·100 g-1体重给予如意珍宝丸灌胃；阳性对照药组灌胃给予辛伐他丁混悬液，成人每天用量辛伐他丁片以1 mL生理盐水配0.01 mg的药物配制，按1 mL·100 g-1体重给予辛伐他丁片灌胃。假手术组、模型组按1 mL·100 g-1体重给予生理盐水灌胃（normal saline，NS），每天1次至处死；每组2个亚组给药分别持续7天、14天。白脉病疗法组在大鼠患肢涂白脉软膏，每天2次，每次1 g并按摩5 min；假手术组、模型组和阳性对照组均于大鼠患肢涂凡士林。

1.2.3 指标检测：

（1）常规检测：每天对各组大鼠皮毛状态观察并记录；

（2）行为学检测：分别与大鼠造模后3天、7天、14天，对各组大鼠进行神经行为学评分，主要应用“姿势反射测验（postural reflex test）”[2]。

（3）脑缺血大鼠脑组织病理学[1]

（4）免疫组化检测CD34、VEGF1、GAP-43的表达情况。

取材:于造模成功后7天、14天取材，经腹腔水合氯醛麻醉后断头取脑，每组取5只大鼠心脏灌注，沿胸骨左侧剪开胸腔，从左心室进针，插入到主动脉，固定针头，剪开右心耳，快速滴入预冷生理盐水（10 mL·min-1），无血污后改滴入4%多聚甲醛（5-10 mL·min-1），先快后慢，约250 mL，开颅取脑，4%多聚甲醛固定2天，石蜡包埋。

免疫组化SP法:石蜡包埋后进行免疫组化，采用免疫组化SP法，具体流程如下：脱蜡、水化组织切片；0.01 mol·L-1PBS洗三次各2 min；组织切片置于枸橼酸盐微波修复抗原修复；用3%H2O2，室温封闭10 min；PBS洗两次各3 min；滴加一抗（CD34为1：100，GAP-43、VEGF1均为1∶200），4℃过夜（4℃过夜后次日组织需在37℃复温45 min）。复温，PBS冲洗2 min×3次；滴加超敏二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂1（聚合物辅助剂），37℃孵育10 min；PBS冲洗2 min×3次；滴加试剂2（辣根酶标记抗兔IgG聚合物），37℃孵育10 min；PBS冲洗2 min×3次；DAB显色：滴加DAB显色剂显色10 min(镜下掌握显色程度，若10 min显色不足可适当延长时间)；蒸馏水洗终止显色反应；酒精梯度脱水、二甲苯透明、封片、镜检。

从标本中随机取部分切片，用0.01 mol·L-1PBS代替一抗，其余步骤相同，作为阴性对照。

观测指标

CD34指标的观察位置：大鼠缺血侧皮层CD34阳性细胞数。

VEGF1指标观测位置：每只动物随机取免疫组化切片5张，在高倍镜下（×200）计数大鼠皮层VEGF1阳性细胞，取其均值作为VEGF1阳性细胞数。

GAP-43指标观测位置：每只动物随机取免疫组化切片5张，在高倍镜下（×200）计数海马齿状回颗粒细胞区内1/3、颗粒下区GAP-43阳性细胞，取其均值作为海马海马齿状回的颗粒下层（SGZ）的GAP-43阳性细胞数。拍照定位参考《大鼠脑立体定位图谱》。

表1 各组大鼠姿势反射测验（postural reflex test）比较(xˉ±s)

表2 不同时间点大鼠大脑皮层CD34在大脑皮质的表达(xˉ±s)

1.2.4 数据统计分析

数据资料使用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料以均数依标准差(xˉ±s)表示，若符合正态分布和方差齐性，则采用单因素方差分析，两组间的比较采用LSD检验；若不符合正态分布或方差齐性，则采用秩和检验，以P＜0.05或P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常规检测

每天对各组大鼠进行皮毛观测并记录，发现缺血再灌注后前3天，各组大鼠毛发颜色差异不明显，随着缺血再灌注时间的增加，各组大鼠毛发状态呈现差异，7天后开始明显。具体为：白脉病疗法组的大鼠毛色光泽度较好，色白，接近自然状态，和假手术组没有显著性差异，与模型组及其他两组治疗组相比，好于这三组（M组、P组、R组）；如意珍宝丸组和阳性组没有显著性差异；模型组毛发情况最差，毛色枯黄成束状。

2.2 行为学检测

分别与大鼠造模后3天、7天、14天，对各组大鼠进行“姿势反射测验（postural reflex test）”。姿势反射测验结果表明：术后第3天，缺血再灌注各组与假手术组相比，行为学评分均低于假手术组，P＜0.05；如意珍宝丸组和白脉病疗法组大鼠的行为学评分高于模型组，P＜0.05；术后第7天，缺血再灌注各组与假手术组相比，行为学评分均低于假手术组，P＜0.05；白脉病疗法组、如意珍宝丸组大鼠行为学评分高于模型组，有显著性差异，；术后第14天，缺血再灌注各组与假手术组相比，行为学评分均低于假手术组，P＜0.05；白脉病疗法组、如意珍宝丸组大鼠行为学评分高于模型组，P＜0.05（表1）。

2.3 组织病理学结果

假手术组7天皮层神经元结构完整，数量多，核圆、大，偶见核固缩，14天与7天比较无明显差异。模型组7天神经元排列紊乱，部分细胞排列疏松，细胞核固缩，深染，周围出现空泡，正常神经元数量减少；14天见大量细胞溶解后残留的痕迹，细胞稀疏，排列紊乱。阳性组7天神经元排列疏松，偶见细胞核皱缩，深染；14天正常神经元数量进一步减少，核固缩细胞增加，细胞间的空泡区域增多。7天如意珍宝丸组有少量核固缩细胞，与模型组相比明显少，与假手术组相比没有显著差别；7天白脉病疗法组有少量核固缩细胞，与模型组相比明显较少，与假手术组相比没有显著差别；14天白脉病疗法组核固缩细胞比7天多，但与模型组相比明显少许多，有显著性差异（图1）。

2.4 CD34、VEGF1、GAP-43免疫组化检测结果

2.4.1 CD34判定标准

任何被CD34抗体染成棕黄色细胞或细胞簇均可视为阳性表达，参照weidner法即与背景明显分别的任何一个棕色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要结构不连续，分支结构也可作为一个血管。每张染色切片先在低倍镜下（×40）于脑缺血皮层寻找3个微血管密集区，随后再在高倍镜下（×200）下计算5个不同视野中的微血管数，取其均值作为本张片子CD34的值。免疫组化结果显示，梗死区域几乎没有血管新生，新生的血管主要集中在缺血半暗带中，血管形态扭曲并且不规则。术后7天、14天假手术组微血管有少量表达，术后7天、14天，白脉病疗法组、如意珍宝丸组与模型组、阳性对照组比较微血管显著增加，且有统计意义（P ＜ 0.05）（表2）。

2.4.2 VEGF1

脑缺血再灌注损伤后7天，如意珍宝丸组、白脉软膏组、白疗组三组大鼠脑缺血侧皮层的VEGF1阳性细胞积分光密度高于假手术组、模型组和阳性组，且有显著性差异（P＜0.05）；白脉病疗法组、如意珍宝丸组VEGF1阳性细胞表达高于假手术组及模型组，且均有显著性差异（P＜0.05）。14天各组VEGF1阳性细胞数较7天均有所下降，阳性组、如意珍宝丸组、白脉病疗法组均高于假手术组和模型组与模型组。7天、14天，如意珍宝丸组VEGF1阳性细胞表达高于阳性对照组、白脉病疗法组，且均有显著性差异（P＜0.05）（表3）。

2.4.3 GAP-43

脑缺血损伤后7天，如意珍宝丸组、白脉病疗法组GAP-43阳性细胞积分光密度与模型组、阳性对照组比较，均显著增高，且有显著性差异（P＜0.05），而如意珍宝丸组于白脉病疗法组比较无显著形成以；14天时如意珍宝丸组、白脉病疗法组高于模型组、阳性对照组，且有显著性差异（P＜0.05），而白脉病疗法组GAP-43高于如意珍宝丸组，有显著性差异（P＜0.05）（表4）。

3 讨论

藏医白脉病疗法是临床上治疗脑卒中经典治疗方法，有研究证明本研究所选药物在改善卒中患者肢体运动功能方面具有较好疗效[3]。本实验从神经血管再生角度观察了藏医白脉病疗法对于缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用，从HE染色及神经功能评分可以看出白脉病疗法对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用。本研究又从CD34、VEGF1、GAP-43的表达情况对其作用机理的进行了进一步的探讨。

以往认为成年后大脑血管内皮细胞已经停止增生，但动物实验证明局灶性缺血后有新的血管生成。毛细血管生成在脑卒中后2-7天会于缺血灶边缘区开始出现，这些血管早期表现是梗死灶边缘区的大管径薄壁血管，然后（脑卒中后2-28天）这些薄壁血管通过发芽和分枝形成小血管，并逐渐进入梗死灶[4]，从而有利于神经功能的再塑。诸多研究表明，脑组织血管密度高的缺血性脑血管病患者预后明显好于血管密度低的患者，缺血区脑组织的血管新生可明显改善缺血区周围的组织灌流，弥补血流量下降导致的脑损伤，促使神经功能尽可能恢复。CD34在维持此动态平衡中起着重要的作用，在缺血缺氧等因素可降低CD34数量并破坏其功能，使内皮细胞功能受损，最终造成组织缺血[5]。CD34减少的程度已被用来评价内皮细胞功能受损的程度。本研究显示，术后7天白脉病疗法组、如意珍宝丸组较模型组比较，CD34表达显著增加；术后14天，白脉病疗法组、如意珍宝丸组与模型组、阳性对照组比较，CD34表达量均明显增加，同时14 d时白脉病疗法组与如意珍宝丸组比较，明显较高，有显著差异，说明白脉病疗法组在促进CD34蛋白表达方面较单纯应用如意珍宝丸治疗有明显的时间相关性，同时也说明综合治疗手段比单纯应用某种药物治疗更具有优势。

表3 不同时间点大鼠皮层VEGF1阳性细胞积分光密度(xˉ±s)

表4 不同时间点大鼠SGZ区GAP-43阳性细胞积分光密度(xˉ±s)

血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，具有促进血管形成的作用[6，7]本实验选择Anti-VEGF antibody[VG-1]（ab1316）来检测各治疗组对于血管再生的调节作用，其可以诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞凋亡，诱导血管透化作用。本研究结果表明，脑缺血再灌注7天、14天时，如意珍宝丸、白脉病疗法治疗组均可以提高大鼠脑缺血后梗死区的VEGF1的表达，如意珍宝丸组作用最明显，此结果与14天时CD34的阳性表达反应白脉病疗法组优于如意珍宝丸组的结果有些不一致，可能因为，一是如意珍宝丸的作用主要在调节血管内皮的功能而发挥作用，而白脉病疗法属于综合治疗，其作用的发挥可能有更多的途径；二是实验例数较少，在统计学上未能反应出白脉病疗法综合治疗在改善VEGF1表达上的优势，需要进一步研究。

生长相关蛋白（GAP-43）在神经组织中广泛存在，是一种胞膜磷酸蛋白质，它是一种神经特异性的蛋白质，在生长、分化和再生的轴突末端以及突触前膜含量极高，研究表明其主要参与神经细胞外生长，突触发育的形成和神经细胞的再生[8]，所以可以被用作轴突生长的标记物。GAP-43在正常脑组织亦有一定量的表达，阳性细胞主要分布于大鼠海马齿状回颗粒细胞层、齿状回颗粒细胞下层（subgranular zone，SGZ）、门区等[9]。本实验主要分析海马齿状回GAP-43阳性细胞，阳性神经细胞多呈颗粒状。研究表明，7天、14天时如意珍宝丸组、白脉病疗法组GAP-43阳性表达均明显高于模型组、阳性对照组，而7天时如意珍宝丸组与白脉病疗法组比较无显著性；至14天时白脉病疗法组GAP-43高于如意珍宝丸组，说明白脉病疗法综合治疗方法在促进神经的再生方面明显优于单纯的药物治疗方法。

总之，白脉病疗法可促进脑缺血再灌注大鼠GAP-43、VEGF1、CD34的阳性表达，促进微血管增生，说明脑缺血可诱导侧支循坏的建立和微血管网的再建，起到神经保护的作用。其机理有待进一步探讨。

附录

图1 假手术组7 d海马G区GAP-43免疫组化×200

图2 模型组7 d海马G区GAP-43免疫组化×200

图3 阳性组7 d海马G区GAP-43免疫组化×200

图4 如意组7 d海马G区GAP-43免疫组化×200

图5 白脉病疗法组7 d海马G区GAP-43免疫组化×200

图6 假手术组14 d海马G区GAP-43免疫组化×200

图7 模型组14 d海马G区GAP-43免疫组化×200

图8 阳性组14 d海马G区GAP-43免疫组化×200

图9 如意组14 d海马G区GAP-43免疫组化×200

图10 白脉病疗法组14d海马G区GAP-43免疫组化×200

图11 假手术组7 d皮层VEGF1免疫组化×200

图12 模型组7 d皮层VEGF1免疫组化×200

图13 阳性组7 d皮层VEGF1免疫组化×200

图14 如意珍宝丸组7 d皮层VEGF1免疫组化×200

图15 白脉病疗法组7 d皮层VEGF1免疫组化×200

图16 假手术组14 d皮层VEGF1免疫组化×200

图17 模型组14 d皮层VEGF1免疫组化×200

图18 阳性组14 d皮层VEGF1免疫组化×200

图19 如意珍宝丸组14 d皮层VEGF1免疫组化×200

图20 白脉病疗法组14 d皮层VEGF1免疫组化×200

21 模型组7 d皮层CD34免疫组化×200

22 假手术组7 d皮层CD34免疫组化×200

23 白脉病疗法组7 d皮层CD34免疫组化×200

24 如意组7 d皮层CD34免疫组化×200

25 阳性对照组7 d皮层CD34免疫组化×200

26 模型组14 d皮层CD34免疫组化×200

27 假手术组14 d皮层CD34免疫组化×200

28 白脉病疗法组7 d皮层CD34免疫组化×200

29 如意珍宝丸组14 d皮层CD34免疫组化×200

30 阳性对照组14 d皮层CD34免疫组化×200