中医方证代谢组学研究进展及其应用＊

苏红娜，张爱华，孙 晖，王喜军

（黑龙江中医药大学国家中医方证代谢组学研究中心 哈尔滨 150040）

中医学在治疗复杂性多基因疑难杂病方面已经凸显出其方剂配伍联合干预的绝对优势，在经典方剂传承及现代中药研发方面也取得了突破性成就，为中国及全球的健康维护做出了其他医学科学不可替代的贡献。然而，由于其理论的复杂性，其有效性不能以有限的药理学等指标来表达清楚，是中医理论的科学价值及中医临床经验的实用价值难以被现代医学科学乃至于生命科学家所认可和接受，致使中医药有效性的科学阐释成为摆在国内外现代医学科学家面前难以逾越的障碍，致使中医学的优势及其临床经验的价值难以充分的发挥和利用[1]。如何建立一种能够科学阐释中药方剂有效性及其机制的生物学语言，是发挥中医药在治疗复杂性疾病及个体化精准治疗方面优势的前提[2]。

中药方剂有效性包括3个方面，即临床效应、效应机制及表达效应的物质基础。首先，中药方剂有效性是基于证候表达的。其次，中医临床用药形式是方剂，方剂才是药物，只有在方证对应的状态下才能表达临床疗效，单方也是如此。单味中药饮片仅仅是原料药，同一中药饮片在不同的方剂中表达不同的体内成分，从而实现了配伍的药效取向。因此，研究中药有效性必须从证候和方剂入手，在方证对应的前提下探讨有效性，以往脱离证候和方剂单纯研究单一中药的有效性及药效成分的工作实际上已经与临床有效性失之交臂。然而，证候的模糊性及方剂多药物组成的复杂性，致使基于证候和方剂开展有效性研究的思路举步维艰。首先必须阐明证候客观表达的生物学实质，其次才能评价方剂的效应，才能发现产生效应的来源于方剂的体内成分，继而揭示表达效应的机制[3]。

由此，中医方证代谢组学以证候生物标记物发现为切入点，以方剂为研究对象，首先解决证候的生物学实质，然后再解决方剂体内成分分析的问题。即利用代谢组学技术发现并鉴定中医证候/病生物标记物，以证/病的生物标记物桥接复制与证/病关联的动物模型，建立方剂药效生物评价体系；在阐明方剂有效性的前提下，利用中药血清药物化学技术，采用与代谢组学一体化研究策略，分析鉴定有效状态下方剂体内直接作用物质，表征其显效形式，并将显效过程中方剂体内成分的动态变化与显效过程中证候生物标记物的动态变化相关联，挖掘与生物标记物轨迹变化高度关联的体内成分，从而鉴定表达方剂临床疗效的药效物质基础，揭示作用机制，解决中药有效性相关的系列科学问题。

1 中医方证代谢组学理论发展

中医药是数千年以来人类与自然、疾病的对抗中通过实践、不断总结各个时期的先进思想而得出的一套理论体系，同时也是中医临床经验的结晶。然而中医以整体、动态、辩证的思维认识疾病以及中药成分和作用机制的复杂性已成为中医药研究的制约因素[4-6]需要建立一种符合中医药特色的方法学体系，在系统论指导下从整体、动态、功能上诠释中医药理论的科学内涵，促进西医和中医的相互作用，弥合中西医学的文化差异，促进中医药的现代化和国际化发展[7,8]。

代谢组学是对内源性和外源性小分子物质进行靶向和非靶向分析的关键技术，多维定量检测其整体代谢变化来分析疾病作用机制的学科[9,10],可以被理解为生命系统对遗传或环境扰动的多参数代谢响应的定量测定[11,12]。并结合先进分析技术，使内源性代谢物的改变与生理病理变化关联分析，能够更精准地探索机体的生物机制、活动功能[13-15]。其整体分析的特点符合中医的整体观念，为解决中医药关键科学问题开辟了一条新途径[6]。经过10余年的发展，中医药代谢组学研究取得了显著成就，从中医病/证的代谢轮廓表征及中药/方剂整体效应评价，中医病证生物学本质及中药方剂作用机制，再到药效物质基础的发现，以及深层次的阐明生物标记物功能及中药有效成分靶向调控的生物学机制，形成了一种生物学语言来科学表达中药的疗效，这也是进一步表述中医基础理论及其临床实践的关键。2011年底，王喜军教授团队正式提出中医方证代谢组学（Chinmedomics）方法和研究策略[16]，中医方证代谢组学定义为：以代谢组学技术发现证候的代谢轮廓及生物标记物，以证候轮廓及生物标记物为指标评价方剂的效应，在有效状态下，利用中药血清药物化学方法分析鉴定有效状态下方剂体内成分，并将体内成分与证候生物标记物相关联，提取与生物标记物轨迹变化高度关联的体内成分，从而鉴定表达方剂临床疗效的药效物质基础的应用科学称为中医方证代谢组学（Chinmedomics）。该创新理论包括4个核心技术：基于代谢组学技术的代谢生物标记物的发现；基于代谢生物标记物的证候模型制备；利用中药血清药物化学鉴定方剂体内直接作用物质；外源性方剂显效成分与内源性证候生物标记物之间的相关性分析，共同构成了中医方证代谢组学的核心技术。将中药血清药物化学理论与代谢组学技术相结合，对中医证候进行精准诊断，并对方剂的整体效应精准评价，解决了与中药疗效相关的证候生物标记物发现，有效状态下的中药体内显效成分表征，及其效应机制等科学问题[17-19]。中医方证代谢组学研究方法为中药有效性和安全性评价、质量控制、临床证候的诊疗提供了有效的研究手段。

2 中医方证代谢组学研究

2.1 中医方证代谢组学研究证候生物学本质

证候是机体受到致病因素刺激的情况下产生的综合性反应，是在总结病因、病机、病位、病势的共性基础上，揭示疾病阶段性的病理变化，集中反映疾病的发展规律和作用机制，具有特异性、整体性、动态演变性的特点[20]。辨证论治是指导中医临床正确诊疗、合理用药的核心原则，最具有中医特色的医疗手段。然而，由于中医证候的复杂性和研究方法的局限性，对证候的病理机制和整体特征很难深入研究[21]。基于此中医方证代谢组学从整体出发，利用高分辨的分析技术，基于生物网络揭示病理生理反应以及疾病进展中所涉及的潜在分子机制，揭示不同功能和结构的分子之间的相互作用，使分子含量变化与生物表征相关联并确定证候的生物标记物群，揭示证候的生物学物质基础[22,23]，为证候客观化提供科学依据，中医方证代谢组学不仅有助于理解中医证候，也有利于突破中医强调的整体理论和西医强调的还原论，搭建中西医结合的桥梁，拉近了中西医之间的距离[24,25]。

中医方证代谢组学已经取得了一定的成果，并揭示了肾虚证、黄疸证、实热证、心气虚证等证候以及高脂血症、肝癌、酒精肝、肥胖等疾病的生物学本质。Fang等人采用先进的UPLC-TOF-MS技术结合统计学方法对阳黄证进行整体网络分析，揭示其发病机制，并发现33个潜在的新型生物标记物，涉及到戊糖和葡萄糖转换、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、初级胆汁酸生物合成和谷胱甘肽代谢。并且发现其中10个关键代谢物与临床阳黄证患者的生物标记物具有高度相关性，因此这些潜在的生物标记物在相关代谢通路的调节中起关键作用，可作为治疗阳黄证的关键靶点[26]。高脂血症的主要特征是脂质代谢紊乱，并且是心血管疾病和动脉粥样硬化的主要致病因素。中医方证代谢组学分析在早期阶段有助于高脂血症患者的诊断和预后。因此使用液质联用技术，监测高脂血症患者代谢物和代谢途径变化。初步鉴定出高脂血症患者共37个血清代谢产物。参与11个代谢途径，如亚油酸代谢，甘油磷脂等代谢途径。这些结果为高脂血症的早期风险评估提供了潜在的生物标记物，并为高脂血症中复杂的代谢途径变化提供了科学依据[27]。

2.2 方剂有效性评价

中药方剂是以中医药理论为指导将传统中药按照“君臣佐使”进行配伍，方剂药效研究可分为药效评价和作用机制，由于中药方剂的化学成分多样性、成分之间相互作用的多样性、药理机制多样性，难以对方剂效应进行精准评价，因此需要一种技术科学地表达方剂的有效性[28]。基于中医方证代谢组学，建立方剂药效生物评价体系从而评价方剂对于“证”的整体效应，有利于解释中药方剂药效整体性和动态性、配伍规律性，揭示方剂多靶点的治疗机制。因此中药方剂的药效评价和作用机制的研究对中医药的实践指导和理论发展具有重要的意义[29,30]。

四君子汤用于治疗胃肠疾病、增强免疫的作用。Zhao等人通过结合NMR和MS代谢组学方法研究四君子汤对丝裂霉素C诱导免疫毒性的保护作用。找出10个关键生物标记物参与到氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢中。最主要的代谢通路是天门冬氨酸、丙氨酸、和谷氨酸代谢。揭示了四君子汤对丝裂霉素的免疫毒性的预防作用，并推测了可能的代谢机制[31]。黄连解毒汤对脑缺血治疗确有疗效。为进一步明确其治疗机制作用，利用UPLC-Q-TOF/MS技术对大脑中动脉闭塞组和黄连解毒汤组大鼠的血浆样品进行分析，并结合HMDB、KEGG和MetaboAnalyst测定这些潜在生物标记物的相关代谢途径。发现黄连解毒汤改善了大脑中动脉闭塞诱导的脑损伤，阻断了严重的炎症反应。鉴定出19个生物标记物，表明通过调节谷氨酸代谢，乙酰胆碱水平和功能的基本病理生理网络，实现黄连解毒汤对脑缺血的治疗作用[32]。茵陈蒿汤是治疗湿热黄疸的经典方剂[33]，其特点是具有肝脏调节作用，缓解黄疸等疾病，尤其是阳黄证。Liu等人基于中医方证代谢组学方法通过UPLC-Q/TOF-MS技术鉴定了22个潜在的生物标记物，并结合多变量分析茵陈蒿汤对阳黄证的功能机制，发现通过调节关键生物标记物能有效改善代谢紊乱，阐明了茵陈蒿汤治疗阳黄证的有效性[34]。这表明中医方证代谢组学技术是探索中医证候发病机制和中药方剂有效性的有力手段。

2.3 药效物质基础研究

中药药效物质基础是指中药或方剂中含有的能够表达与中药或方剂传统临床疗效相关的活性化学物质。包括中药体内直接作用物质及其前体化合物。它是与中药有效性、安全性、质量控制直接相关的关键因素。中药血清药物化学是有利于研究中药活性成分的有效方法，但它仅局限于对化学成分进行定性定量分析，由于在体内中药的复杂成分之间的相互作用，无法整体分析其疗效和作用机制。因此与代谢组学方法结合，建立中医方证代谢组学新方法，弥补中药血清药物化学的缺陷。在整体评价方剂有效性的基础之上进行中药血清药物化学分析，阐明中医证候或疾病的生物学机制，然后找出中药体内直接作用物质，将外源性中药活性成分与内源性证候生物标记物的相关性分析用于阐明药效物质基础及其协同机制[35,36]。

中医方证代谢组学全面反映中药作用后引起的整体代谢变化，进而阐明中药的作用机制，符合中医药整体性的特点，其优势是通过中药多成分、多靶点的协同作用来确定中药发挥作用的药效物质基础、作用机制和变化规律，改变了传统中药作用机制研究方法的单成分、单靶点的缺点，可以为阐明中药作用机制提供较为科学合理全面的解释[37]。近几年，中医方证代谢组学技术已应用于中药效应关联成分的生物学功能研究过程。基于中医方证代谢组学方法通过UPLC-MS整体分析关黄柏预防前列腺癌的有效成分和血清代谢物，在体内表征的38个化合物中，29个原型入血，并且在体内鉴定了9个代谢物。确定30个生物标记物与前列腺癌相关，并且黄柏能够回调这些扰动的代谢物恢复至正常水平[38]。肾气丸治疗肾阳虚证，通过中药血清药物化学，在体内初步表征了34个成分其中24个是原型成分，10个代谢产物。还研究了肾阳虚证的代谢概况和23个潜在的生物标记物。通过对生物标记物和入血成分进行关联性分析来筛选20个高度相关的有效成分，并将其视为肾气丸的药效物质基础。其中14个关键的生物标记物作为潜在的治疗靶点，并与醛固酮调节的钠重吸收和肾上腺素能信号通路有关。因此中医方证代谢组学不仅能预测疾病的治疗靶点还能高通量筛选中药的药效物质基础，对现代中药研究具有重要意义[39]。

2.4 中药安全性评价研究

随着中医药在国内外的快速发展，由中药引起的不良反应的报道也日趋增多，如“马兜铃酸肾毒性事件”、“黄连素事件”、“小檗碱事件”等等。中药的毒性是在中药效应表征的同时对机体造成的损伤，也是药物性能的一种，中药毒性有狭义和广义之分，狭义的毒性是指药物对机体的损伤，而广义的毒性是指利用药物的偏性来驱邪扶正产生疗效。因此在中医基础理论指导下进行方剂配伍可达到增效减毒的目的。

中药毒性的现代研究都是集中在急性期和长期毒性研究，毒性物质紊乱了内源性代谢物的表达，因此指标的选择局限于生化指标检测和组织病理学观察，并缺少与中医药相关的毒性生物标记物的研究，无法阐述药物在机体内早期的发生及整个发展机制[40]。近年来，中医方证代谢组学通过核磁共振，气相色谱、液相色谱-质谱联用等技术对生物体毒性标记物进行定性定量分析[41]，分析与毒性标记物相关的生理病理变化过程，从而发现由药物引起的异常代谢变化，由此获得有关药物毒性作用机制的信息[42]。中医方证代谢组学通过研究有毒中药及配伍前后对机体内源性标记物的影响，阐明有毒中药的毒性物质基础及复方配伍前后增效减毒的作用机制。

乌头是世界范围广泛应用的传统中药[43]。乌头具有镇痛和抗炎活性，其主要药理活性是乌头碱型二萜生物碱。Zhao等人利用UPLC-Q-TOF/MS技术研究乌头区分于云南省收集的其他七种乌头属的标记化合物。使用正交偏最小二乘鉴别分析方法，鉴定了8个标记化合物，其中次乌头碱，新乌头碱和尼奥灵具有显著的急性毒性，而附子灵对小鼠没有急性毒性，表明这种生物碱的相对安全性。此研究说明如何使用代谢组学方法区分真正的药用植物和普通掺杂物，并鉴定可能开发成新药的化合物[44]。草乌是乌头的块根，用于治疗风湿性关节炎，关节疼痛和肿瘤等疾病。然而，草乌引起的心脏和中枢神经系统毒性限制了其应用。因此通过尿液代谢组学鉴定了草乌诱导的心脏和肝脏毒性相关的13个生物标记物，其中有5个生物标记物在乌头属中共同拥有。利用代谢组学结合模式识别方法分析草乌与甘草、白芍和人参配伍的减毒机制。在这项工作中强调了代谢组学结合模式识别分析，可以用于评估药物毒性和配伍减毒方法[45]。为了研究金瓜花肝毒性，Wang等人基于UPLC-MS将细胞代谢组学与血清药理学相结合对人HL-7702肝细胞进行研究，并确定了7个生物标记物。此外，确定了参与溶血磷脂酰胆碱的生物合成途径和鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸途径的两种信号分子和四种酶，分析了与特定生物标记物和两种代谢途径相关的代谢过程，以揭示金瓜花肝毒性可能的机制。结果发现脂质过氧化和氧化应激，溶血磷脂酰胆碱途径，以鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸途径和脂肪酸代谢为中心的鞘氨醇-1-磷酸代谢谱的干扰可能是金瓜花引起的肝损伤的关键因素[46]。

2.5 中药质量标志物研究

中药是中医治疗疾病的基础，其质量直接影响功效和安全性，然而中药质量控制一直是全球范围内关注的焦点[47]。由于中药复杂的化学成分及其相互作用、采收、加工、运输、提取、净化等过程，还有中药研究思路和技术的局限性都会影响中药质量评价。因此2016年，刘昌孝院士首次提出了中药质量标志物（Q-marker）的概念及其基本条件[48]，确立能够反映中药安全性和有效性的质量标志物的中药质量控制体系[49]。中药质量标志物的基本条件：1、传递性与溯源性2、成分有效性3、成分特有性4、成分可测性5、复方配伍规律。提出基于“五原则”的复方中药质量标志物研究和发现的路径。既反映了中药质量标志物与有效性和安全性的关联性，又体现方剂配伍，进一步找出中药有效状态下的显效成分以此作为质量标志物才能提高临床用药价值[50]。

中药的化学成分非常复杂，是种类繁多、结构各异的代谢产物的合集，仅仅对单一药物或者某一成分进行分析无法满足质量控制的准确性和整体性，并且难以通过传统的技术手段进行全面分析。因此采用中医方证代谢组学技术高通量分析中药整体代谢物组，确定整体表征的质量标志物，并将这些质量标志物投影到中药治疗的“疾病-成分-靶点”网络，建立以成分为中心、药效为重心、质量为核心的“物-量-效”群，用于中药的质量控制，对提高中药临床用药准确性具有重要意义[51]。

生脉散已被广泛用于治疗气阴两虚证，改善认知功能障碍。然而，生脉散的质量标志物仍需要进一步研究。Zhang等人利用代谢组学方法表征生脉散治疗阿尔茨海默病的相关尿液代谢标记物，并应用中药血清药物化学来分析生脉散的体内显效成分，通过中医方证代谢组学方法将阿尔茨海默病相关的代谢标记物与生脉散的体内直接作用物质进行相关性分析。结果发现生脉散对APP/PS1小鼠具有很好疗效，能够回调4个潜在的尿液生物标记物，共检测到17个体内成分，包括14个原型成分和3个代谢产物。相关性分析显示五味子素、异长春花苷等8个成分与生脉散治疗阿尔茨海默病极为相关，被认为是生脉散的潜在质量标志物[52]。一些研究已经表明茵陈蒿汤的药理活性和组分。然而，其质量标志物和作用靶点尚未揭示。采用高灵敏度UPLC-MS技术结合模式识别方法分析血清样本和尿液样本。多变量数据分析和网络药理学技术用于鉴定与治疗效果相关的有效成分和生物标记物。结果，在茵陈蒿汤中共鉴定出69个化合物，其中41个入血成分。此外，还鉴定了湿热性黄疸证的34个尿液生物标记物。基于高通量的中医方证代谢组学方法，将尿液生物标记物和入血成分进行相关性分析最后确定9个关键化合物作为茵陈蒿汤的质量标志物。最后，共发现了12个潜在的治疗靶点。中医方证代谢组学提供了一种有利的方法来阐明中药的有效性，是发现中药质量标志物的新策略[53]。

2.6 中医方证代谢组学与肠道微生态相关研究

研究者们不断强调肠道微生物群对人类健康的影响，因为人体肠道的盘旋构造被称为人体的第二大脑，并携带着人体“第二基因”，并切拥有500至1000种的100万亿个细菌，占体重的1-3%，编码超过4 M的基因，它们是机体内最重要的一种外环境，各种微生物之间的互相联系形成一种生态平衡。肠道菌群可以作为具有巨大代谢能力的生物反应器并且在许多生物功能方面与宿主相互作用形成共生的超级有机体[54]，按照菌群的特性，它们可分为：与宿主共生的有益菌；与宿主共栖的致病菌；病原菌。当人体复杂的生态系统失去平衡之后，导致菌群失调，免疫力下降，引发多种疾病。研究表明，肠道菌群对宿主生理功能有着重要的影响，包括体内代谢、营养平衡、免疫系统，甚至是大脑活动。这些效应是由细胞间的相互作用、微生物产生的代谢产物或环境和宿主分子转化产生的代谢物来介导的，产生的分子能够与宿主的生理功能相互作用，并在局部和远端发生反应，因此肠道菌群失调可能是疾病发病机制的起始或强化因素[55,56]。

在现代医学中，由于细菌的多重耐药性导致抗生素有效性降低。新型抗菌药物不太可能在短期内广泛使用。对于肠道菌群的调节作用，中药多成分、多靶点的特征占据了很大的优势[57]。肠道微生态学与中医学尽管存在着形式上的不同，但是两者都是从多途径、多靶点、多环境去探究机体与环境之间的整体规律。中医的整体观、脏腑学说及阴阳失调等诸多方面与肠道微生态学理论相通并存在着紧密的联系[58,59]。鉴于肠道菌群全面参与宿主的生理病理过程，所以研究者们表明肠道菌群能够作为中药治疗的主要靶点，其通过多组分发挥整体效应将生理调节至正常状态[60]。大量研究表明由于肠道菌群与中药的复杂相互作用，这些相互作用包括：肠道菌群将中药转化为具有差异性生物利用度和差异性生物活性/毒性的代谢物；中药中含有的化学成分改善肠道菌群的组成，从而改善其功能障碍以及相关的病理状况；肠道菌群介导中药中多种化学成分之间的相互作用（协同和拮抗）[61]，因此中药能够有效调节肠道菌群的异常状态，对肠道菌群失调所导致的病证有着较好的临床疗效。

在正常情况下，肠道微生物之间的联系与作用维持着内环境的稳态，而且与机体的生理病理状态密切相关，是机体代谢网络的一部分。因此仅利用宏基因组学分析DNA层面，不能很好地研究微生物组的功能情况。从而应用代谢组学、转录组学、基因组学等多组学研究的技术[62]，其中代谢组学与肠道菌群结合，并对人体肠道菌群代谢产物进行研究，了解中医病证下的肠道菌群的改变及代谢状态，并且阐明在疾病状态下中药对肠道菌群的作用机制。

在一项研究中，网络药理学和功能代谢组学的结合来研究芒硝通过调节胆汁酸代谢治疗结肠直肠癌的机制。基于代谢组学通过UPLC-Q-TOF-MS技术结合多变量模式识别分析，发现潜在的生物标记物位于胆汁酸代谢的相关途径中，例如牛磺酸，鹅去氧胆酸，胆酸和脱氧胆酸。表明芒硝在调节胆汁酸相关生物标记物达到了抑制结直肠癌中的作用，进一步揭示了结肠直肠癌的代谢紊乱并解释芒硝的治疗效果[63]。脾阳虚证是中医常见的疾病，它是一种复杂的表型，反映胃肠道消化功能紊乱所引起的代谢改变，Zhang等人基于LC-Q-TOF/MS的代谢组学和16s rRNA测序方法，对脾阳虚患者和健康个体的血浆、尿液和粪便进行综合代谢和微生物分析，结果发现与健康组相比脾阳虚患者的肠道菌群失调与代谢紊乱密不可分，将肠道细菌的差异性与代谢产物综合分析，结果表明拟杆菌门减少、厚壁菌门增多，并鉴定出一些活性细菌参与宿主粘膜完整性、胆汁酸代谢和多糖分解。因此表明肠道菌群可能参与调节代谢变化，有助于进一步研究肠道菌群在脾阳虚证发病机制中的作用[64]。

3 总结

近年来，科学家逐渐认识到代谢组学可以作为中医与现代医学和生命科学之间的桥梁，在中医临床研究中取得了巨大进步，有助于阐明中医证候的本质和作用机制。特别在21世纪，中医方证代谢组学研究方法有利于促进中医药学的国际化发展，开创了中医药系统评价的新局面，它结合现代先进的分析技术，力图揭示中药的药效物质基础和作用机制这个复杂的“黑箱体系”。使人们对中医药有了全新的认识，开辟了中医药治疗和开发的新途径，从而推进中医药的科学化、现代化和国际化发展。