组学技术在现代中药药理研究中的应用与思考＊

姜云耀，孙明谦，马 博，陈进成，刘 楠，刘 华，刘建勋＊＊

（1.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所中药药理北京市重点实验室 北京 100091；2.北京盈科瑞药物安全性研究有限公司 北京 102206）

中医学是我国传统文化的瑰宝，具有数千年的临床经验积淀，即使在现代医学飞速发展的今天，中医药在我国医疗保健体系中依然发挥着不可替代的作用[1]。同时，中医药又反映了中国传统文化与哲学的基本原则，以辨证施治为精髓，将人体与自然进行了有机的结合。在中医的理论中，“证候”乃是从整体性出发，对个体疾病状态下特征的描述以及对疾病内在变化规律的概括，是中医有别于现代医学诊疗体系的一大特色和优势[2,3]。中医药的功效在日常临床实践中被不断地展现出来，它在改善人类健康状况以及预防和治疗疾病方面也越来越受到世界全国的认可和欢迎。然而由于构建中医的基本理论（气、血、经络等）在现代医学中没有直接的对应物，中医的医学诊断和治疗变得和它的理论一样抽象。更严重的是，由于缺乏科学的标准和明确的规定，中医药治疗方案的安全性在世界医学中备受质疑[4]。因此，在科学的范式下对中医药进行研究是非常必要和重要的。中药具有丰富的资源，是药物开发的潜在来源。然而，中医药理念与现代药理学存在根本的差异，极大地阻碍了中药现代化的发展。近年来，组学技术在中药研究中的应用备受关注[5]。其中，基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学已经成为中药研究中使用的主要策略。系统生物学和组学技术的发展和应用为中医药在整体水平上的系统研究开辟了一条新途径。

1 基因组学

对于机体生理与病理的认知，现代医学与中医学从不同的角度进行阐述。不同于疾病的概念，证候在中医学的理论与临床实践中具有绝对的指导作用。证候所反映的是疾病在发展过程中某一个阶段的病理变化本质，包括了病变的原因（病因）、部位（病位）、性质（病性）以及邪正之间的关系（病势），因而，证候比疾病的症状更全面、更系统地揭示了疾病的本质，并指导临床的诊疗原则与方法。从基因的表达谱或表达差异角度，研究证候发生的基因表达与调控规律，探索证候表达的基因特性、基因表达调控的变化及其规律，概括证候的基因组学特性，有学者提出了证候基因组学概念[6]。

中药的基因组学研究一方面用于中药作用的遗传分子机制研究，研究中药作用的个体化差异；另一方面，对于复方或中药复合成分的研究，阐明特定基因的作用模式。因此，中药基因组学的研究，既可以阐明中药的作用机理，也是对中药有效成分分析的辅佐。在中药对机体的作用机制研究中，中药在证候中的反证研究是重要的一部分，如对肾虚证的研究等[7]。有学者研究了三七总皂苷对动脉粥样硬化的作用机制[8]，利用基因芯片发现三七总皂苷对于整合素的抑制作用显著，可以调控脂质的摄取，影响泡沫细胞的形成。Watanabe等[9]采用高密度的寡聚核苷酸微阵列方法，研究银杏叶提取物对Alzheimer症小鼠脑功能相关基因的影响，发现银杏叶提取物通过调节微血管相关τ蛋白基因，清除β淀粉样蛋白而发挥神经保护作用。对于中药成分的研究，丹参的基因组解析是一个代表性研究[10,11]，该项研究完成了丹参基因组的测序与组装，并采用转录组学方法揭示了丹参活性成分合成的分子机理，并为其他药用植物基因组解析提供的研究策略。

2 转录组学

转录组学能够从整体水平研究特定条件下细胞中基因的转录情况及其调整规律[12]。这一研究思路和中医用药整体观的指导思想不谋而合。中药多以复方的形式在临床应用，药味较多，用药考究且化学成分复杂，药物各作用靶点之间互相关联、协同发挥作用，因此仅从单一角度去研究中药很难解释其整体作用机制。转录组学的发展给中药的研究和发展带来了新的可能。常见的转录组学研究技术包括基因芯片、高通量测序和单分子测序。

在该技术的早期阶段，其在中医药研究中的巨大潜力就得到了广泛认可。近十年里，转录组学为揭示中药配方相容性规则的基本原理和确定负责配方的治疗和作用的活性成分提供了方法[13]。周岚等[14]通过基因芯片技术，以基因敲除的小鼠为模型检测以川芎、当归组成的活血中药和三棱、莪术组成的破血中药治疗动脉粥样硬化的作用并研究其作用机制。结果发现了两组中药调控动脉粥样硬化的相关基因，并预测这些中药的作用机制主要涉及炎症反应、免疫应答、细胞粘附、脂质代谢、细胞凋亡等生物学过程以及TGF-β、MAPK、Jak-STAT和NF-κB等信号通路。Qu等[15]利用高通量的Illumina RNA-seq技术，使用MCF-7人乳腺癌细胞系作为初始体外模型来鉴定复方苦参注射液诱导的基因表达变化，获取了复方苦参注射液处理的细胞转录组数据。通过分析发现，复方苦参注射液扰乱了MCF-7细胞的多个生物途径，其中细胞周期被认为是其作用的主要靶途径，同时复方苦参注射液还通过p53非依赖性机制诱导MCF-7细胞凋亡。

3 蛋白组学

蛋白质组学是指基于质谱技术，对完整的细胞，组织，体液等样品的全部蛋白质进行定性，定量，修饰状态等进行研究的学科[16]。定量蛋白质组学是蛋白质组学研究领域中的重要分支，凭借其高通量、高灵敏度、高线性范围和较高准确度的技术特点，成为了解生命活动过程、验证疾病生物标志物的重要方式，广泛地应用于生物学和医学研究中。目前比较成熟的蛋白质定量技术主要有双向电泳技术和基于质谱的蛋白质定量技术两种[17]。近10年来，随着高精度生物质谱技术和数据处理技术的不断进步，基于质谱的蛋白质定量技术成为该领域的主流。

蛋白质组学的研究思路与中医整体观、多靶点的观点十分相似，特别是在中医临床研究中，蛋白质组学利用质谱技术检测临床样本的蛋白质表达情况，可以从分子水平对中医病证进行表征和阐释，寻找与证候相关的分子标志物，为中医临床诊断和治疗提供新的途径和理论依据[18]。中药药理学研究的主要任务是揭示中药治疗的作用机理和机体对药物的代谢过程，是涉及多成分、多靶点、多途径的作用过程。中药各成分之间通过相互协同或抑制作用，共同发挥治疗效果。通过多途径、多靶点调控发挥作用，可引起机体相应靶器官/组织多种蛋白质丰度的改变[19]。中药是一个复杂的物质体系，通过经典的分子生物学研究手段，难以对复杂的样本进行研究。利用蛋白质组学技术，可以对中药本身在蛋白质水平进行探究，同时，对病人用药前后蛋白水平的表达情况进行高通量的测定，比较细胞或组织样本在不同生理或病理条件下蛋白表达异同，对相关蛋白质进行鉴定和量化，研究蛋白质之间相互作用和生物学功能[20]。中药归经论是中药理论体系的重要组成部分，用以表述药物作用的定位。应用蛋白质组学方法，可以从分子水平对中药作用靶点，药效机制等进行评价和表征，对中药理论的完善和科学性解释具有重要的促进作用。张杰等[21]结合中药归经理论与系统生物学理论，认为归某经的药物在发挥效应的组织脏器上具有一定的共性，药物的作用强度也与相关蛋白的表达水平有一定的相关性。蛋白质组学技术从整体的角度分析细胞、组织等生物样本全蛋白的动态变化，组成成分与修饰状态，这种强调联系、动态和整体的思想方法与中医药理论一致。蛋白质组学技术可以提供良好的数据支持，已经成功的运用于中药现代化的研究中[22]。但其存在一定的局限性，对样品制备要求很高。且中药特别是植物药主要是通过小分子化合物成分发挥药效，目前对于中药材中蛋白发挥药效的机制研究并不明确。

4 代谢组学

代谢组学是后基因组学时代涌现的一门新兴学科，与基因组学、转录组学和蛋白质组学一起成为系统生物学的主要研究方法[23,24]。代谢组学的定义为生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)其代谢产物(内源代谢物质)种类、数量及其变化规律的科学。主要通过对机体体液中小分子代谢产物在某个特定时间的定量和定性分析，从整体上评价当时的生命体功能状态及其变化[25]。代谢组学是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，借助高通量、高灵敏度与高精度的现代分析技术，对细胞、组织和其他生物样本如血液或尿液中内源性代谢物整体组成进行定量分析，并通过代谢物变化来辨析被研究对象的生理病理状态。目前用于代谢组学研究数据采集的分析技术主要有：核磁共振技术（NMR）、气相色谱与质谱共用技术（GC-MS）、液相色谱与质谱共用技术（LCMS）、毛细管电泳与质谱连用技术（CE-MS）、液相色谱与质谱先后使用技术（LC-MS/MS）、超临界色谱与质谱联用技术(SFC-MS)、毛细管电泳与质谱联用技术(CE-MS)、傅立叶变换-离子回旋共振质谱技术(FTICR-MS)、高效液相色谱与质谱和核磁共振共用技术（LC-NMR-MS）等。最广泛使用的是NMR、GC-MS、LC-MS这3种技术[26]。代谢组学同样强调整体观和系统性。

通过测定药物干预后血浆和组织中代谢物的含量变化，揭示药物干预疾病的代谢通路，从而理解药物作用过程及药理作用机制，最终更好的掌握并运用药物。目前，代谢组学在中医药领域中的研究应用越来越多。Wang[27]等借助代谢组学方法，采用UPLC-MS研究技术，并结合多元统计分析研究心肌缺血心气虚证的发病机理和中药复方温心方的作用机制。结果在大鼠尿液中共识别鉴定了17种与心肌缺血相关的生物标志物，它们主要与糖酵解、糖异生、不饱和脂肪酸的合成与代谢、脂肪酸合成以及嘌呤代谢等生物代谢途径相关，而温心方能够调节其中多条代谢通路并且结果与生化指标和病理分析的结果相一致。Tan[28]等采用基于超高效液相色谱串联质谱和核磁共振的代谢组学技术，研究四逆散。结果鉴定出与心肌损伤相关的19种潜在生物标志物，这些生物标志物与大鼠体内的糖酵解、三羧酸循环、氨基酸代谢、嘌呤代谢及嘧啶代谢相关。刘胤敏[29]等利用代谢组学方法对复方丹参滴丸进行研究，发现冠脉结扎导致的心肌缺血模型组大鼠血浆中延胡索酸、琥珀酸、葡萄糖、柠檬酸、乳酸等内源性代谢物有差异性变化，模型组大鼠尿液中葡萄糖、果糖、脯氨酸、苏氨酸、甘氨酸等有差异性变化，而复方丹参滴丸给药的大鼠这些内源性代谢物都有不同程度的回调，说明复方丹参滴丸的有效成分能够通过改变机体代谢物的变化，改善机体代谢途径，从而发挥降低心肌耗氧、改善心肌能量代谢、保护心肌细胞等调节作用。代谢组学具有整体性和系统性的特点，与中药复方的“多组分、多靶点、整体调节”的特点和中医理论的“辨证论治”、“整体观”的思想相一致，可以用来研究中药复方引起机体内源性代谢组的变化，代谢组中的某种或多种相关生物标志物的变化特征模式能够提供中药复方作用机制和作用靶点等方面信息。代谢组学技术应用在中药复方研究中可以使以经验为基础的中药复方向以科学方法和标准为基础的现代化中药复方转变。

5 网络药理学

为了揭示多组分药物的协同作用规律，探索药物的影响或干预，寻求高效低毒的多靶点药物，研究人员提出了网络药理学的概念[30]。网络药理学是一种结合系统网络分析和药理学的新方法。通过成分-成分、成分-靶点和靶点-疾病网络，可以阐明化合物之间的协同作用及多组分和多靶点药物在分子水平上的潜在机制，帮助研究人员了解成分、基因、蛋白质和疾病之间的相互作用[31]。中药是多组分、多靶点和多作用途径的，因此网络药理学适用于中药复方的研究[32]。通过网络药理学鉴定中药活性物质及其相应的分子靶标并确定活性物质与疾病之间的关系，有助于阐明中药复方的分子机制[33]。

近年来，网络药理学在揭示中药治疗复杂疾病的分子机制方面备受关注[34]。Liang等[35]探索了中药网络药理学的方法，并将其用于六味地黄丸作用机制的研究，揭示了六味地黄丸的核心分子靶点和生物过程网络。Li等[36]同样利用网络药理学方法探讨了葛根芩连汤治疗2型糖尿病的活性成分和作用机制，并确定了一个葛根芩连汤中新型的抗糖尿病成分4-羟基美芬妥英。刘楠[37]等通过网络药理学的方法，对补阳还五汤治疗脑梗死的作用机制进行探讨和研究，发现补阳还五汤可能通过药物的反应、老化、对缺氧的反应、血液凝固等生物过程，并涉及蛋白质结合、酶结合和丝氨酸型内肽酶活性等分子功能发挥治疗脑梗死的作用，对PI3K-Akt，TNF，HIF-1和cAMP等信号通路的调控也是其作用机制。Tang等[38]应用网络药理学方法预测了麻黄附子细辛汤治疗过敏性鼻炎的有效成分和潜在的靶标。

6 多组学的联合应用

在认识到大多数生命活动是有多个基因或基因网络而不是单个基因控制的以后，许多研究人员开始从更全面的角度来看待基因以获得更全面、更可靠的信息，即组学方法[39]。基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学以及分析技术的整合补充了生物学并以系统生物学的形式提出系统级研究中药的方式。基因组学通过分析个体遗传变异对药物应答的影响研究疾病的发生和药物作用的机制。转录组学是识别整个基因组转录情况和转录规律的方法。蛋白质组学可以从整体上直接研究基因组所表达的蛋白质和蛋白质功能[40]。代谢组学提供了代谢信息，这是转录组和蛋白质组的结果[41,42]。因此,多组学数据集的综合分析有可能为揭示系统范围的复杂生物过程和中药复方中多种化合物的功能提供新的视野。

6.1 基因组学和转录组学的联合应用

通过基因组的研究，能够发现点突变、拷贝数变异、插入及缺失和结构变异等疾病特异性突变以及药物对机体在基因水平的调控作用。转录组在基因组遗传信息和生物功能之间起到恰当的连接作用。基因组与转录组的联合应用，可为基因水平上揭示疾病发生发展和药物治疗机制、发现药物调控的关键靶标提供更为准确的信息。谭文乐[43]对食管鳞状细胞癌进行基因组和转录组联合分析，最终发现细胞周期、PI3K/AKT信号通路是食管鳞状细胞癌的重要通路，为疾病的预防和治疗提供了理论依据。陈玉皎等[44]应用单分子测序技术获得中药蛹虫草子实体基因组，并联合转录组进行蛹虫草药效单体代谢途径调控机制的研究。

6.2 转录组学和蛋白质组学的联合应用

转录组联合蛋白组的策略已被用于多种癌症的研究中，如直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、鼻咽癌等。李刚[45]应用多组学研究策略筛选肝癌候选标志物，通过分析细胞和组织转录组学数据、蛋白组学和细胞转录组学数据，并对得到相关候选标志物NEK2、HSP90a进行生存分析和诊断价值评价，结果发现NEK2、HSP90a可能和肝癌侵袭转移相关。魏威[46]通过对肝癌转移潜能细胞系进行转录组和蛋白组的研究，验证了肝癌转移潜能细胞系相关的多组学数据改变的方向性，并对相关变化基因进行了鉴定和生物学功能的研究。目前利用转录组结合蛋白组的策略在中药药理上的研究还较少，我们完全可以借鉴其在疾病上的应用，对药物干预的机体进行基因和蛋白质的联合分析，对药物作用的靶基因和靶点蛋白质进行识别，进而探讨作用机制。

6.3 蛋白质组学和代谢组学的联合应用

蛋白质是生命活动的功能执行体，蛋白质参与了绝大多数的调控过程和疾病原发过程并且是大多数药物的靶标[47]。蛋白质组学技术是进一步分析疾病发生过程和药物调控过程的有效工具。同时，中药发挥其功效有很大一部分是通过其代谢产物实现的，因此，蛋白组学结合代谢组学的策略在中医药研究中具有十分重要的应用意义。苑福生等[48]运用蛋白质组学和代谢组学联合应用的技术对兔脊髓缺血再灌注时间规律进行了相关研究，分别考察了新西兰大白兔缺血再灌注6 h、12 h、24 h和48 h的组学结果，分析表明缺血再灌注24 h是蛋白质表达水平和代谢水平的关键改变点。吴文娟[49]基于蛋白质组学和代谢组学方法探讨卵巢上皮癌多药耐药机制，代谢组学和蛋白质组学结果均表明卵巢上皮癌多药耐药与脂肪酸和谷胱甘肽的代谢相关。李新亚[50]通过两种组学技术对冠状动脉旁路移植术后新发房颤进行了相关研究，发现代谢组学相关通路和蛋白组学相关通路结果可以相互佐证，术后房颤的发生可能和PPAR信号通路以及谷胱甘肽代谢通路的改变密切相关。闫清华[51]利用Label free蛋白质组学和LC-Q-TOF-MS代谢组学对四君子汤干预脾虚证的机制进行研究，识别了四君子汤的主要代谢通路和涉及到机体内的主要营养物质的代谢过程，发现了四君子汤治疗脾虚证的靶标蛋白和潜在生物标志物,并建立了生物分子代谢通路和相互作用网络。

表1 组学技术在中药药理研究中的应用及主要技术

6.4 基因组学和代谢组学的联合应用

基因是遗传信息的载体，其在疾病发生发展过程中的重要作用是毋庸置疑的，而在疾病状态下细胞的环境状态却是通过代谢物反映的。研究者认为，单独从基因组或代谢组研究复杂疾病，都会遗漏疾病发生发展的重要内在信息，应当将二者结合，更有助于揭示疾病发生机制和发展规律[52]。汪梅姣[53]利用基因组学和代谢组学相关技术探究脾虚型痛风的生物学特征，研究结果显示基因组学检测到的相关差异基因的改变可以在代谢组学结果中得到体现，两种组学结果是相互联系、相互佐证的。汪洋[54]为了探究脾虚型类风湿关节炎患者的生物学特征，采用代谢组学和基因组学联合应用的方式进行了相关实验研究，两种组学研究结果表明，和正常人相比脾虚型类风湿关节炎患者在炎症、蛋白质代谢等通路上发生明显改变。

6.5 网络药理学和代谢组学的联合应用

中药治疗疾病主要是通过其所含有的多化学成分同时调节机体中多个代谢通路而发挥的综合治疗作用[55]。因此，代谢组学技术联合生物信息学对中药干预的机体代谢组群进行整合分析，更有益于揭示中药的作用模式和药理机制。韩森[56]将网络药理学和代谢组学技术应用于中药寒热属性分类相关分子机制的研究，分析实验结果得出寒热药物作用靶点存在特异性，但是大部分靶标相同，之所以寒热药物会呈现不同的作用结果是由于这些共享的靶标在作用方向和强度上存在明显差异。

6.6 三种及三种以上组学的联合应用

Li等[57]结合转录组学、蛋白组学和代谢组学研究补肺益肾方治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制，通过多组学的联合分析识别了补肺益肾方显著调控的基因、蛋白质和代谢物，并发现补肺益肾方可能通过调节系统水平的脂质代谢，氧化应激，细胞连接和炎症反应途径对慢性阻塞性肺疾病发挥长期治疗作用。李庆辉[58]采取多组学整合分析的方法分别获取相应组学的差异基因，通过差异基因找到四类组学共有的前列腺癌相关的重要通路，KEGG富集结果得到ECM-受体相互作用和癌症通路，GeneGo富集结果得到了130条调控通路，其中既有ECM相关通路也有一些新的调控通路。通过多组学数据分析，结果发现不同数据集基因水平相似性差异要大于系统水平上的分子特征相似性。刘京铭[59]应用基因组学、转录组学和蛋白组学数据联合分析的方法找到了结核病发病相关分子机制的核心网络并构建了结核病预测诊断模型，为研究复杂疾病多组学提供了思路。高越[60]采用蛋白质组学和代谢组的方法研究养心氏片治疗心衰的作用机制，并进一步应用网络药理学的方法获取养心氏片治疗心衰的作用靶标，组学研究结果和网络药理学预测结果具有很好的相关性，养心氏片治疗心衰是通过调控能量代谢、调节免疫反应和增加心肌细胞活力起作用的。谌卫[61]分别运用基因组学、蛋白组学和代谢组学技术研究血脂异常如何加重结晶肾损伤患者病情，组学研究结果表明LLDR基因和疾病发生具有相关性，并且这一过程与MAPK、mTOR通路活化以及氨基酸代谢、能量代谢等变化相关。李冰涛[62]通过网络药理学、转录组学和代谢组学三种组学技术对葛根芩连汤治疗2型糖尿病的作用机制进行了研究。整合组学研究结果得知葛根芩连汤中的黄酮类和生物碱类化学成分是其治疗2型糖尿病的有效成分，相关化学成分能够调节PPARγ与PPARα的表达上调，进而影响糖脂代谢对2型糖尿病起治疗作用。

7 总结

组学概念的提出以及组学技术的应用，开辟了中医药研究的新方向，同时也产生了许多新的研究分支[63]。组学是一个由整体理念产生的概念，它与中医药的内涵相吻合，组学的性质也与中医药的整体思路是一致的，符合中医药的整体概念和实践，有助于理解和揭示中医药的机制[64]。近年来，组学概念和系统分析已经被大多数学者所接受。然而，从目前的研究结果来看，我们对中药多组分、多靶点、多途径的理解仍然很有限。过去认为mRNA的水平可以反映出蛋白质的表达，但后来的研究证明，细胞中蛋白质的表达水平与其mRNA水平并没有保持严格的一致性，所以仅通过mRNA不能准确的推测出蛋白质的表达水平[65]。因此，组学的研究不仅要强调一般水平或仅限于单一方面，多组学间应该结合起来，合理整合、科学分析将更有助于系统深入地揭示中药功效的物质基础和作用机制。目前，多组学联合应用对中医药进行的研究虽已开展，但总的来说研究深度不够，仅仅是表面结果和现象的结合，还未达到真正的融合，对中药作用机制的研究也正处于起步阶段，大部分研究仅是检测中药调控相关基因和蛋白质表达的变化，进而预测所涉及的生物过程和代谢途径，并没有更加深入的对机理的研究[66]。如何把多组学技术进行合理的融合和恰当的对接，共同为揭示中医药的科学含义服务，是一项值得深入思考的课题。

随着现代科学的发展，特别是组学技术的迅速发展以及多学科的交叉、融合，为中医药研究提供了新的平台，给了我们更多研究复杂疾病和中医证候的思路。多组学联合也由理论在向实践不断发展，许多探索在一层一层揭开多组学联合应用的面纱，这也为我们研究中药药理及其相关作用机制提供了诸多便利和途径。多组学联合应用是时代发展的趋势，运用多种研究技术探索未知，将会带来无限可能。而网络药理学可以把这些高通量的组学信息与中药复方的化学成分相结合，构建生物系统的相互作用网络。多组学技术联合网络药理学和生物信息学的方法来阐释中药多组分在分子水平的协同作用，再结合整体水平中药作用机制的研究，能够帮助我们更精确地挖掘中药复杂体系中的有效成分，寻找中药核心的基因和蛋白靶标，探索中药发挥作用的生物途径，揭示中药的药理学机制。