基于Shotgun液相质谱联用技术研究膜蛋白组学的进展＊

孔德志，任雷鸣，张 炜

（河北医科大学中西医结合学院 石家庄 050017）

随着高分辨质谱技术的进步，用质谱对复杂蛋白样品进行检测时，也用到了人类基因组研究项目中用到的“鸟枪法”（Shotgun）策略[1]。随着电喷雾（ESI）高分辨串联质谱技术的成熟，测定蛋白经酶解后所形成多肽的质荷比（质量与电荷的比值，简称质荷比，m/z）和经质谱碰撞所产生的离子碎片，利用蛋白序列数据库的信息，计算机可以高通量快速地鉴定肽段并进行蛋白质的组装。与常规二维电泳（2-DE）相比，避免了对疏水性、低丰度、分子量极大极小蛋白的偏向性，短时间内可以鉴定上千种蛋白质。小于100个氨基酸的膜蛋白通常很难检测，而应用基于质谱的方法可以鉴定到很多小分子膜蛋白[2]。另外，质谱技术不仅能够检测蛋白质多肽的分子量和氨基酸序列，还能发现蛋白质被翻译后序列的修饰情况[3]。但是，由于膜蛋白的疏水性、低丰度等特点，在进行Shotgun质谱分析前仍需要对样品进行一些特殊的处理，本文针对膜蛋白样品的前处理及相关应用研究的进展做一综述。

1 膜蛋白的样品前处理

与常规Shotgun蛋白质组学相似，应用液质联用技术定性定量膜蛋白时同样需要提取蛋白并进行合适的酶切，以适应质谱的检测。由于膜蛋白的特殊性，在膜蛋白的提取和酶切时应该格外注意，对于膜蛋白样品的前处理本文主要关注膜蛋白的富集和提取、酶切过程。至于膜蛋白提取后的还原烷基化过程一般与常规蛋白质组学样品的处理相同：用DTT（二硫苏糖醇）或TCEP[三(2-羧乙基)膦]进行二硫键的还原，再用IAM（碘乙酰胺）进行烷基化处理[4]；为降低样品的复杂性，增加蛋白的鉴定数量，可以将富集后的膜蛋白进行预分离，如：依据等电点进行蛋白的预分离，也可以将酶切后的肽段利用高pH条件下的反相C18柱、或离子交换柱进行肽段的预分组；最后应用纳升液相（Nano LC）进行肽段的分离、高分辨质谱检测，最近有文献指出鉴于仪器灵敏度的提升，用微升液相（Micro LC）也能达到满意的蛋白定性效果，但是由于微升液相的稳健性更适合于蛋白的定量[5]。

1.1 膜蛋白的富集与提取

膜蛋白样品既可以是动植物或人体的不同组织，也可以是不同来源的培养细胞。但是，需要指出在体的细胞与培养的细胞在膜蛋白水平不能认为等同，二者存在差异[6]。不管是什么来源的样品，在提取膜蛋白之前，均需要一些处理，包括组织研磨、超声、低渗、反复冻融等手段以裂解细胞。

1.1.1 分离纯化细胞膜

利用细胞膜的特性，先将细胞膜与其它细胞器分离，再提取膜蛋白是经典的膜蛋白制备方法。离心制备的细胞膜粗提物，可进一步用传统的密度梯度离心或两相分离法纯化细胞膜，但该过程不可避免的会受到胞质蛋白的污染，故只能作为一种膜蛋白富集的手段[7]。Rui等介绍了一种用传统的蔗糖密度梯度离心和两相聚合物分离纯化肝细胞膜蛋白的详细方法[8]。细胞膜在破碎后会形成大片状、小囊泡的结构，大片状的细胞膜易于同细胞核或未破碎的细胞粘附在一起，若离心弃沉淀会造成膜蛋白的流失。用碱性溶液（如Na2CO3溶液）清洗细胞膜可以去掉其表面粘附的胞质蛋白，细胞膜此时易形成小囊泡状的膜结构，可减少初步离心弃沉淀所造成的损失，此时碱溶液的量要大于细胞体积的50倍以上[9]。既然用温和的方法破膜，有利于形成大片状的细胞膜，有文献报道用低渗溶液结合液氮冻融法破碎细胞膜、用低渗溶液多次离心清洗，弃去含有胞质等污染成分的上清，制备了包括细胞膜、核膜和线粒体膜的膜组分，用该法制备膜蛋白的重复性非常好，4次平行试验所提取的蛋白含量变异系数（CV）为7.7%，质谱非标定量（label-free quantification）法测定膜蛋白的含量，2次平行试验中99%的蛋白其CV值不大于30%[10]。

利用细胞膜的负电性，采用阳离子纳米颗粒包裹在细胞膜的表面，再用阴离子聚合物中和未与细胞膜结合的阳离子纳米颗粒，以防止阳离子纳米颗粒在细胞破碎后与其它膜组分结合。由于纳米颗粒的结合，极大的增加了细胞膜的密度，使得细胞膜比其他任何亚细胞器的密度都大，这样，细胞破碎后用较低的离心力离心，即可制备得到较为纯净的细胞膜，用这种方法也可以针对性的研究细胞的顶膜或基底膜。Choksawangkarn等考察了用3种不同密度的阳离子纳米颗粒（Al2O3、用Al2O3包裹的Fe3O4、用Al2O3包裹的SiO2）分离膜的效果，经过Shotgun质谱技术鉴定所得到的膜蛋白，结果表明密度最大的Fe3O4颗粒分离效果最好；另外，不同纳米颗粒具有不同的选择性，Al2O3颗粒倾向于富集碱性膜蛋白，而Fe3O4颗粒更倾向于富集疏水性的膜蛋白[11]。

针对感兴趣的膜蛋白，还可以用另一种策略，可把所关心的膜蛋白封装到一种人造纳米膜盘（nanodisc）中，然后用质谱技术分析人造纳米膜所封装的蛋白。用磷脂和骨架蛋白等组装材料形成nanodisc，依据组装材料的种类和比例不同可以封装不同的膜蛋白，且能保持蛋白的活性。文献报道以磷脂和His标记的MSP1E3D1骨架蛋白形成的nanodisc，封装了哺乳动物细胞的膜蛋白，形成了细胞膜蛋白的功能纳米膜盘库（functional nanodisc library），经过纯化、拆卸nanodisc后，用质谱进一步分析所封装的膜蛋白。需要指出的是，在进行质谱分析前须去除MSP1E3D1骨架蛋白，以防止其掩盖待分析目标蛋白的质谱信号[12]。

1.1.2 膜蛋白的抽提

由于膜蛋白的疏水性，为了增加膜蛋白的溶解，需要加入表面活性剂、有机溶剂、离液剂（chaotropes）等溶剂，如Sodium dodecyl sulfate（SDS）、NP-40、Tween-20、Triton X-100、sodiumdeoxycholate（SDC）、乙腈、尿素等，有文献[13，14]对这些膜蛋白提取剂的应用进行了综述。最近，Zhang等同时应用了两种膜蛋白复合提取剂DDM/CHS（n-dodecyl-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate）以提高膜蛋白的提取效率[15]。由于膜蛋白镶嵌在细胞膜的磷脂双分子层中，脱脂可以增加膜蛋白的提取率，但脱脂本身也会造成膜蛋白的损失。Raimondo等用14倍体积的冰冷tributyl phosphate（TBP）/acetone/methanol mixture（1∶12∶1）脱脂，优化后的方法可以使膜蛋白的鉴定数目增加50%[16]。文献[17]在分析McA-RH7777细胞膜蛋白时也用甲醇进行了脱脂处理。

尽管传统的表面活性剂（如：SDS）在膜蛋白的提取中应用非常广泛，但是这些表面活性剂与质谱的兼容性并不好，现在人们越来越关注研究新型质谱兼容性的高效膜蛋白提取剂。Zhao等用质谱兼容的离子液体 1-dodecyl-3-methylimidazolium chloride（C12Im-Cl）来提取膜蛋白，结果表明该离子液体比SDS、Rapigest、methanol提取后鉴定的膜蛋白数量要多，用该法研究大鼠脑组织的膜蛋白，所鉴定的内在膜蛋白比用SDS多了1.4倍（251 vs 178）；且C12Im-Cl对胰蛋白酶的酶解活性无影响，更有利于疏水性肽段的溶解[18]。Amphipols（APols）是另一种质谱兼容性的膜蛋白提取剂，亦不影响胰蛋白酶的活性，故酶解前无需去除，在质谱分析前仅需要一步酸化和离心即可沉淀APols，Ning等[19]用APols建立了One-Step快速抽提膜蛋白的前处理方法，避免了传统表面活性剂和离液剂的使用，减少了蛋白样品的损失。

1.1.3 基于膜蛋白表面的特质性进行膜蛋白的提取

膜蛋白氨基酸序列的糖基化修饰非常普遍，是膜蛋白实现功能的必要修饰。可以依据膜蛋白上的糖基修饰[20,21]，特别是N-glycosylation进行膜蛋白的富集，一方面利用糖结构中的醛基和酮基，硼酸可与邻近的两个羟基形成非可逆硼酸环状结构；另一面可利用凝集素或标记的凝集素与糖特异性的结合，凝集素的最大特点是可以识别糖蛋白和糖肽中复杂的碳水化合物结构（即细胞膜表面的碳水化合物决定簇）。另外，不同的凝集素对糖基的识别也具有一定的选择性，如刀豆凝集素易与α-D-吡喃糖基结合，麦芽凝集素易与N-乙酰糖胺结合，菜豆凝集素易与N-乙酰乳糖胺结合，而且凝集素具有多价态结合的能力，可以进一步与生物素、酶、胶体金、铁蛋白等结合，有利于下一步的分离与示踪[22]。Strassberger等用生物素（EZ-link sulfo-NHS-LC-biotin）富集了髓性白血病细胞表面的320个膜蛋白，并针对发现的CD166/ALCAM蛋白设计了抗体，具有较好的肿瘤杀灭作用[23]。Soulet等用在体生物素结合非标记蛋白定量的质谱方法，首次研究了鸡胚胎血管和基质的膜蛋白质组学[24]。关于糖蛋白的分离纯化策略可见文献[25]，基于凝集素的糖蛋白富集可进一步参考相关综述[26]，根据糖的性质也可以使用其它策略，比如酶切后用二氧化钛、HILIC材料富集糖肽[27]。

由于胞外区的蛋白序列具有信号传递、药物结合、与宿主细胞结合的重要意义，故可以直接富集这些胞外区的蛋白序列[28]，忽略其跨膜区域的蛋白序列。除了用免疫亲和的方法可以“剃去”（Shaving）细胞膜表面的蛋白，也可以用蛋白酶在细胞或细菌存活的状态下“剃去”其表面的蛋白，鉴定这些胞外区的蛋白序列，该法尤其适合于致病微生物表面蛋白的研究[29]。

而一些市售的膜蛋白提取试剂盒（如Novagen TM-PEK，Sigma ProteoPrep®Membrane Extraction Kit，PIERCE Mem-PER®）一般利用膜蛋白的疏水特性进行膜蛋白的提取，具有方便迅速的特点，但干扰蛋白也较多。

1.2 膜蛋白的酶解

胰蛋白酶（trypsin）是蛋白质组学中最常使用的消化酶，然而膜蛋白跨膜区域中可供trypsin酶切的位点（赖氨酸和精氨酸）较少，酶切后易产生许多疏水性的大片段，不易溶解且不利于质谱检测，从而降低了膜蛋白的序列覆盖度。进一步提高酶解效率、增加膜蛋白序列的覆盖度并减少酶切耗时是人们所关注的问题。

有人采用两步酶解法，首先用胰酶（1∶20）37℃酶解3.5 h，高速离心后将沉淀进一步用糜蛋白酶和Trypsin过夜酶解，终止酶解后，将两部分酶解后的肽段合并，以增加酶切位点，提高蛋白序列的覆盖度[30]。将Trypsin固定到惰性颗粒表面，可以缩短酶解耗时，Chao等将Trypsin固定到疏水性聚合物和亲水性聚合物的纳米颗粒表面，用这种双基质固定的Trypsin酶解膜蛋白，不仅缩短了酶解时间，而且与溶液酶解相比，鉴定到的肽段数增加约2倍，提高了蛋白序列的覆盖度[31]。双酶酶解反应器（bi-enzymatic reactor，糜蛋白酶和Trypsin均固定到硅胶纳米颗粒）在大鼠肝脏膜蛋白的鉴定试验中，双酶反应器比单独用糜蛋白酶或Trypsin反应器鉴定的膜蛋白数量多了1倍（单独用糜蛋白酶反应器鉴定出了1010个，单独Trypsin反应器鉴定出了1184个，而双酶组合反应器鉴定出了2891个膜蛋白），同时也增加了所鉴定蛋白的序列覆盖度，酶解时间也缩短到了1 min以内[32]。

由于膜蛋白的疏水性，在酶解过程中可能形成沉淀，在酶解过程中加入含1.0%脱氧胆汁酸钠（SDC）的NH4HCO3溶液，虽然没有增加膜蛋白的鉴定数目，但增加了多肽的匹配数目[33]。在FASP（Filter-aided sample preparation）法中，Andrew[34]等认为在含SDC的溶液中酶切，不能增加蛋白的鉴定数量，仅仅是对肽段有略微的选择性差异，这与Erde[35]认为SDC可以增加蛋白序列的覆盖度和蛋白定量的回收率不相一致。Metthew等考察了8种商品化质谱兼容性的表面活性剂[Invitrosol、PPS Silent Surfactant、Progenta anionic acidlabile surfactant(AALS)I、Progenta AALS II、Progenta cationicacid labile surfactant(CALS)I、Progenta CALS II、ProteaseMax、RapiGest SF]、甲醇乙腈两种有机溶剂、尿素和盐酸胍两种离液剂对膜蛋白的酶解效率，结果发现单独使用Progenta阴离子表面活性剂时酶解效果较好，但当用乙腈（20%）、盐酸胍（1 mol·L-1）和表面活性剂（0.1%）组成复合试剂时，可最大化的增加酶解的特异性（＞90%），增加肽段的鉴定数目，增加蛋白序列的平均覆盖度以及蛋白跨膜区域的覆盖度[36]。

另外由于膜蛋白表面的糖基化修饰，不利于酶切，也不利于质谱在正离子模式下的检测，因此在酶切前，可用糖基肽酶（PNGase F）等去除膜蛋白表面的糖基化修饰。Jedrychowski在用质谱测定irisin时，用Deglycosylation Mix去除其糖基化修饰，以增加irisin酶切后肽段的定量效果[37]。

不同的酶切方式也影响着膜蛋白的鉴定，Waeowalee等比较了胶内酶切、溶液酶切及FASP酶切对骨髓瘤细胞膜蛋白的鉴定情况，采用胶内酶切可以鉴定出106个至少包含一个跨膜区域的膜蛋白，而溶液酶切仅能鉴定出33个膜蛋白，FASP酶切仅能鉴定出37个膜蛋白，认为胶内酶切的方式更适合膜蛋白的鉴定[38]。

2 膜蛋白质组学的应用

2.1 与中枢神经系统相关的膜蛋白质组学研究

神经系统对机体生理功能活动的调节十分重要，其细胞膜表面的蛋白发挥着重要的生理功能。Melo-Braga等用膜蛋白组学的方法比较了胚胎干细胞与神经干细胞的区别，鉴定出了2910个具有跨膜区域或信号肽的膜蛋白，指出Crumbs 2可能为神经干细胞的标志物[39]。Dagley等研究了小鼠中枢神经系统的髓鞘膜蛋白质组，采用18O标记同时定性定量了超过1000种髓鞘蛋白，并发现了髓鞘中的标志性蛋白[40]。

突触体是由神经细胞末梢的突触前、突触间隙、突触后膜所组成的囊性结构，能够发挥突触的基本功能，广泛应用于神经系统功能及其疾病的研究。Bosch等通过研究背侧纹状体的突触蛋白质组学，发现冰毒可使神经保护（neuroprotection）、神经可塑性（neuroplasticity）、细胞骨架（cell cytoskeleton）、能量调节（energy regulation）等相关的84个蛋白发生改变，确定amphiphysin与成瘾相关[41]。Györffy等通过脂多糖来激活孕期母体的免疫反应，通过研究子代的突触体蛋白的变化，结果发现突触前的囊泡转运蛋白（vesicle trafficking），突触后的骨架蛋白（cytoskeleton）、参与信号转导（signal transduction）的蛋白也发生了改变，而这些蛋白均参与了精神分裂症和自闭症相关通路的调节，该研究证实了母体免疫激活（MIA）可能会增加子代患精神疾病的概率[42]。文献[43]研究了抑郁小鼠突触后致密层（PSD）的蛋白质组学，共发现1500多个蛋白，其中74个膜蛋白与对照组相比表达量显著增加，进一步分析显示这些致密层的膜蛋白参与了信号传导及突触功能的调节，发现了一系列与抑郁相关的包括NMDA受体亚单位NR2A在内的膜蛋白，这些膜蛋白可能成为治疗抑郁的新靶点。在突触体的制备过程中，常常伴随着神经胶质体（gliosomes）的产生，通过密度梯度离心可以进一步纯化神经胶质体，神经胶质体的蛋白质组学[44]发现其富含不同种类的星形胶质细胞蛋白（如VAMP3、Ezrin、Basigin）和G-蛋白介导的信号蛋白。

2.2 与肿瘤相关的膜蛋白质组学研究

肿瘤的早期诊断及治疗是世界性难题，目前发现的肿瘤标志物（maker）很多属于蛋白质，如甲胎蛋白（AFP）、血清癌胚抗原（CEA）、前列腺特异抗原（PSA）等，由于细胞膜表面存在特异性的抗原，针对特定肿瘤的靶向治疗收到人们的广泛关注，而基于质谱的膜蛋白质组学是促进该研究的有力手段[45]。

Martinez-Pinna等比较了腹主动脉瘤患者和正常人体内红细胞膜蛋白的差异，质谱检测发现，有39个膜蛋白发生了显著改变，包括膜的结构蛋白（spectrins、ankyrin）、氧化应激相关蛋白（catalase、peroxiredoxin-2）等[46]。为表征胶质母细胞瘤的侵蚀性，Izabela等通过研究9种胶质母细胞瘤的膜蛋白质组学，发现了49种与肿瘤侵蚀密切相关的膜蛋白，包括与预后密切相关的 ITGA5（integrin alpha5）、CD97、ANXA1（annexin A1）[47]。通过提取大肠息肉组织、未转移的大肠癌组织及转移的大肠癌组织的膜组分，应用Shotgun蛋白质组学技术，发现其中的1567个蛋白至少含有一个跨膜区域，息肉与癌组织相比差异表达的膜蛋白有159个；而转移与非转移的癌组织相比，差异表达的膜蛋白有32个[48]。Gao等研究了胃癌组织及其癌旁组织的膜蛋白质组学，用TMT标记技术同时定性定量了135个细胞膜或膜相关蛋白，其中的82个膜蛋白发生了显著变化，包括已知的annexin A6、caveolin 1、epidermal growth factor receptor、integrin beta 4等胃癌标志物，指出flotillin 1可能是另一个潜在的胃癌标志物[49]。采用两相提取法提取ErbB2过表达的乳腺癌细胞、3种ErbB2阴性癌细胞及良性乳腺细胞的膜蛋白，经过Shotgun蛋白质组学研究，发现肿瘤细胞与酪氨酸激酶、细胞粘附分子等相关蛋白的异常表达密切相关，是造成乳腺肿瘤细胞无限制生长的重要原因[50]。Yan等比较了头颈部鳞状细胞肿瘤与周围组织的膜蛋白差异，发现有123个膜蛋白上调或下调1.5倍以上，主要涉及CD166和CD44，而CD166更合适作为该肿瘤的marker[51]。Mermelekas[52]和Shukla[53]针对从膜蛋白中找到肿瘤标志物的技术要点及存在的问题进行了进一步的综述。

恶性胶质瘤，约占52%的原发性脑部恶性肿瘤，特别是胶质母细胞瘤肿瘤干细胞（GSCs）对放疗或化疗均不敏感，且易于复发，而基于膜蛋白质组学的研究发现了其表面的抗原或治疗靶点，为GSCs的治疗提供了新的放向[54]。对于染色体复杂易位的多发性骨髓瘤，t（4,14）异常的比例约占该类肿瘤的10～20%，针对该位点发现其细胞膜表面的标志物，随后可有目的的设计小分子药物或抗体，Zhi等研究了骨髓瘤细胞KMS11和敲低该基因的KMS11细胞的膜蛋白质组学，发现了50个差异表达的膜蛋白，其中SLAMF7可以作为治疗该肿瘤的药物设计靶点[55]。通过比较人正常粒细胞与5种骨髓性白血病瘤细胞系膜蛋白的差异，在320个膜蛋白中，CD166/ALCAM蛋白在这5种肿瘤细胞系中的表达明显增加，据此将多米卡新（duocarmycin）作为治疗药物，取得了较好的抗肿瘤效果[23]。

2.3 关于膜蛋白质组学的其它应用研究

外泌体是由多数细胞（包括细菌、真核生物等）所分泌的，一般为纳米尺寸的微型囊泡膜结构，发挥免疫调控、血管生成、细胞遗传物质和功能蛋白的转移等功能，特别是其表面的膜蛋白参与了多种病理生理过程，是疾病检测及治疗的重要靶点[56]。Choi等研究了由铜绿假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440所产生的外泌体的蛋白质组学，鉴定出了其表面的膜蛋白（OprC、OprD、OprE、OprF、OprH、OprG、OprW），该外泌体对培养的人来源肺细胞无明显的毒性作用，可以作为治疗药物或抗体的载体以治疗某些人类疾病[57]。

人们应用膜蛋白质组学发现了很多有趣的现象，Van等研究不同肠段的膜蛋白差异，结果显示多数膜蛋白在整个肠段的表达较稳定，一些与细菌感应（bacterial sensing）、阳离子转运（cation transport）、O-糖基化（O-glycosylation）相关的蛋白的表达量从肠的近端至远端逐渐降低，而与微生物防御（microbial defense）和阴离子转运（anion transport）相关蛋白的表达量却逐渐增加[58]。通过研究分化和未分化HepaGR细胞的膜蛋白质组学，发现了一些与乙肝病毒（HBV）感染相关的膜蛋白，为防止HBV感染提供了新的治疗靶点[59]。Waeowalee等研究了小鼠嗅觉上皮细胞的纤毛膜蛋白，鉴定出了62个嗅觉受体蛋白，首次在嗅球纤毛中发现了NCKX2蛋白，进一步研究指出4个膜联蛋白ANXA1、ANXA2、ANXA5、S100A5参与了嗅觉的信号传导[60]。Wang等研究了人晶状体纤维细胞的膜蛋白及膜磷酸化蛋白，鉴定出的951个蛋白中有379个蛋白为跨膜蛋白或膜相关蛋白，这些蛋白参与了物质代谢、信号转导及肌动蛋白的调节；在TiO2富集的膜磷酸化蛋白中，在271个膜蛋白中找到了855个磷酸化位点，有455个磷酸化位点属于首次被发现，PKA、PKC、CKII、p38MAPK、RSK为主要的磷酸化激酶[61]。

Liu等研究了肾脏血管内皮的膜蛋白质组学，他们先用灌流液灌流动物肾脏，再注入二氧化硅纳米颗粒的胶体溶液，从而富集到肾血管内皮的细胞膜蛋白，此法共鉴定出了582个肾血管内皮细胞的膜蛋白及1205个肾降解蛋白，包括16个内皮标志性蛋白（asintegrin beta-1、intercellular adhesion molecule-2(ICAM-2)等），8个新的内皮标志性蛋白（如Deltex 3-like protein、PICALM等）[62]。针对关节软骨细胞的膜蛋白，Matta等以Triton X-114为溶剂进行不同温度下的两相膜蛋白提取，结果指出，CD276、S100-A6、VDAC异构体蛋白是该细胞的标志性膜蛋白[63]。

3 展望与不足

近年来，为了增加膜蛋白的鉴定数目、增加定量的可靠性、缩短样品的前处理时间，人们开发了一些新的方法。被文献称之为Short GeLC-SWATH的方法，与胶内裂解相比，处理时间大大缩短，但鉴定出的膜蛋白数目并不少，与SWATH数据采集方式相结合，提高了膜蛋白定量的重复性[64]。Zhou等采用了一种集膜蛋白提取、酶解、分组为一体的“Centrifugal Proteomic Reactor”，将该装置用到大鼠肝细胞内质网和高尔基体膜蛋白的鉴定中，发现了至少800种以往很难被鉴定到的膜蛋白[17]。Christoforou报道了一种被称为hyperLOPIT的方法，该法基于蛋白的TMT标记，肽段被碎裂后再同时选择10个该肽段的二级碎片离子进一步碎裂，用MS3的TMT标签进行定量，与传统的TMT MS2定量相比，可以达到传统MS2定量的灵敏度，但消除了离子的抑制效应，定量的准确度大幅提高[65]。

基于质谱的非依赖性数据采集（DIA）、多反应监测或选择粒子监测（MRM/SRM）、平行反应监测（PRM）等蛋白的定量方法同样适用于膜蛋白的定量[66,67]，如用SRM质谱数据采集的方式研究细胞膜转运体的含量变化，Qiu等概述了该法的详细流程及要点[68]，随着质谱的广泛应用，基于质谱的蛋白定量技术有望成为Western Blot检测蛋白的替代技术。

基于质谱的Shotgun膜蛋白质组学还存在一些问题，如非膜成分的污染、富集过程相对复杂、蛋白覆盖度低、实验室间定量结果的可重复性差；还需要额外的手段（如：进一步的富集）才能同时研究膜蛋白的糖基化、磷酸化等翻译后修饰；另外，由于存在一定的假阳性率，鉴定出的膜蛋白还需采用免疫共沉淀、Western Blot等手段进行佐证。相信随着仪器分析技术、生物信息学、计算机技术、化学生物学等学科的发展，基于质谱的膜蛋白质组学技术也会进一步纵向发展，解决更多的与膜蛋白相关的生命难题。