代谢组学在中药复方研究中的应用＊

缪潇瑶，肖炳坤，孙云波，王翠芳，杨建云，黄荣清＊＊

（1.军事科学军事医学研究院辐射医学研究所 北京 100850；2.广州中医药大学 广州 510006）

中药复方集中体现了传统中药预防与治疗疾病的优点和特点，是中医临床用药的主要手段。建立符合中药复方自身特点的研究方法来系统的揭示其科学内涵将有助于中药复方的现代化发展和传承。代谢组学通过测定生物体系在内在、外在因素作用下其代谢产物的变化或其随时间的变化来研究该生物体代谢网络的变化，它最大的特点是建立了整体观来剖析生命现象本质，这与中医整体观理念十分契合[1,2]。代谢组学采用现代仪器分析结合化学计量学可进行系统性、整体性、客观性的分析，为中药复方研究提供了崭新的研究思路[3]。本文总结了本课题组近几年运用代谢组学技术开展的中药复方相关研究工作，同时回顾了其他学者的研究成果，对代谢组学技术应用概况及研究成果进行总结与分析，并对其研究前景进行展望。

1 代谢组学概论

代谢组学是20世纪90年代继基因组学、转录组学和蛋白质组学发展起来的一门新兴学科，是系统生物学的重要组成部分[4]。代谢组是某一时刻生物体所有内源性代谢物的集合，反映了其整体状况。代谢组学是在特定时间内系统的分析某一生物体或细胞内所有小分子内源性化合物（相对分子量＜1000）的差异性表达[5]。根据研究目的可以将代谢组学分为发现代谢组学和靶向代谢组学，发现代谢组学（非靶向代谢组学）主要分析对照组和模型组代谢谱差异表达，运用化学计量学方法寻找差异性代谢物并进行鉴定，解释代谢物与生物代谢途径或生理状态之间的联系[6]。靶向代谢组学一般通过分析大量天然和变异生物样本，对已确证的差异表达代谢物进行定量验证[7]。目前代谢组学常用的分析技术有核磁共振（NMR）和色谱-质谱联用，如 NMR[8]、HPLC-NMR-MS[9]、HPLC-MS[10]、UPLCMS[11]、GC-MS[12]、SFC-MS[13]、CE-MS[14]、ICP-MS[15]、IMMS[16]，此外还有 FT-ICR/MS[17]、FTIR[18]。目前，代谢组学运用以上现代分析技术在疾病研究[19,20]（生物标志物的寻找、治疗疗效监控、诊断）、药物研发[21,23]、安全性评价[24]、中医药[25,26]、农业[27,28]、营养学[29,30]、环境毒理学[31,32]、微生物[33,34]等领域得到了广泛的应用。

2 代谢组学在中药复方研究中的应用

2.1 中药复方的安全性评价

中药及其复方的安全性问题是其被广泛应用、走向国际所面临的主要障碍之一。代谢组学采用现代仪器分析结合化学计量学方法可以对正常和非正常的生物样本快速分析，对毒性靶器官进行定位，追溯毒性效应的轨迹。早期国外采用代谢组学研究内容之一就是药物安全性评价及相关的毒理研究[35,36]。代谢组学具有系统性、灵敏性、特异性、动态性等特点，将其应用到中药研究领域中可以全面的、客观的评价中药复方的安全性。近年来，国内对中药安全性评价的代谢组学的研究开展了大量的工作。本课题组沈淑洁[37]等采用基于液质联用的代谢组学研究了金铃子散对大鼠造成亚急性毒性损伤的机制，结果发现中、高剂量金铃子散组大鼠中与类固醇激素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸转换、赖氨酸代谢、谷胱甘肽代谢及抗血酸代谢等五条代谢通路相关的44个代谢物含量发生了显著性改变，进而对大鼠机体造成了明显的肝肾毒性。

由于中药复方是多味中药配伍组成的，这使得中药复方安全评价需要研究各味中药[38]。刘妍如[39]等采用基于NMR的代谢组学研究了黄药子致大鼠肝损伤的动态变化，通过分析0-72 h内的尿液发现三羧酸循环中的柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸的含量在给药组大鼠中呈显著下降的趋势，而甘氨酸的含量呈显著上升的趋势。王小娟[40]等采用基于NMR的代谢组学对川楝子毒性的时效、量效关系以及3个极性部位的毒性进行了研究，结果显示随着剂量的加大与给药时间的延长，机体在得分轨迹图上代谢轨迹偏离对照组越多，与空白组比较，高剂量组中柠檬酸、琥珀酸、2-OG、牛磺酸、甜菜碱、甘氨酸水平下降，乳酸、TMAO、肌酸/肌酐水平升高；川楝子各极性部位组代谢物变化相似，乙酸乙酯部位导致转氨酶显著升高、体重显著下降，是毒性集中部位。Tan[41]等基于LC-Q-TOF-MS的代谢组学研究了不同剂量的白附片对大鼠的毒性作用，结果表明不同剂量的白附片可以导致大鼠体内内源性代谢物产生不同程度的变化，其中甜菜碱浓度在不同剂量的白附片给药组中呈上升趋势，卵磷脂在不同剂量的白附片给药组中呈下降趋势，并且二者呈剂量依赖性，从而说明甜菜碱和卵磷脂可能是白附片产生毒性作用的敏感生物标志物；IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析结果显示RhoA信号、胆碱代谢和自由基清除的扰动可能是白附片产生毒性作用的机制。Wang[42]等人采用基于LC-MS的代谢组学对不同剂量狼毒致大鼠毒性损伤进行研究，结果显示18种氨基酸、有机酸、脂肪酸类的内源性化合物的含量在给药组中产生了显著的变化，并呈剂量依赖性；对代谢物富集后进行通路分析，结果显示狼毒可能扰乱了大鼠体内的脂质代谢和氨基酸代谢，并结合组织病理学结果揭示了狼毒的肝毒性作用，为其致毒机制提供了研究基础。

2.2 中药复方的配伍规律研究

配伍是中药复方的核心关系，也是中医智慧的凝聚。然而“君臣佐使”、“升降沉浮”等配伍理论难以用现代科学语言全面诠释清楚，所以中药复方的配伍规律研究成为了中医现代化亟需解决的重大问题之一。中药复方发挥治疗对应证候的效果绝不是单味药物之间的简单加和，而是取决于质与量的关系，不同的质与量的组合发挥的治疗效果是不尽相同的。代谢组学具有高通量、高灵敏等优势，可以客观的、无歧视的反映机体内源性代谢物的代谢轮廓从而反映出其生理状况，对于研究中药复方中复杂的“量效关系”与“组效关系”是最有效的分析手段[43,44]。

近年来很多学者采用代谢组学研究中药复方的配伍规律并取得了一定的成果。本课题组王小娟[40]等基于NMR的代谢组学研究了白芍配伍川楝子减毒作用，通过分析比较川楝子组与川白配伍组大鼠尿液代谢轮廓，发现与川楝子组相比，配伍组减少了尿液中甲酸、葡萄糖、柠檬酸、琥珀酸、2-OG、肌酸/肌酐、乳酸、谷氨酰胺、TMAO等代谢物的变化；从生化指标上看，配伍组与对照组相比转氨酶升高但无统计学意义，少量肝细胞、肾小管上皮细胞变性。为白芍配伍川楝子减毒机制提供了参考依据。Wang[45]等运用基于UPLC/ESISYNAPT-HDMS代谢组学研究方法，探讨了六味地黄丸其全方、三泄方（泽泻、茯苓、丹皮）及三补方（熟地、山药、山茱萸）对肾虚大鼠内源性化合物的影响，结果显示三泄组几乎没有疗效，三补组有疗效但弱于全方组，为其配伍规律研究提供科学依据。Li[46]等采用基于UPLC-QTOF/MS的代谢组学研究了血虚大鼠在当归、川芎和归芎药对干预下的血液和尿液代谢变化，结果发现与正常大鼠比较血虚大鼠中溶血性磷脂酰胆碱类、鞘胺醇、神经酰胺、植物鞘胺醇和甘油磷酸胆碱有上调趋势，油酸、8,11,14-二十碳三稀酸和经孕稀醇酮有下调趋势；以上代谢紊乱的内源性化合物在当归、川芎、归芎组大鼠中均向正常状态调转，但川芎药对的疗效要优于两味单味药。梁琦[47]等采用基于NMR的代谢组学研究了广防己与黄芪配伍后缓解广防己肾毒性的作用，在给予广防己、广防己配伍黄芪4周后测定大鼠尿液中的内源性代谢物，结果显示广防己组尿液中柠檬酸、2-酮戊二酸、葡萄糖、马尿酸盐、TMAO、肌酸、肌酐的水平发生了显著的变化，而配伍组中这些化合物的水平变化呈不同程度的减小；同时肾组织病理检查结果显示配伍组的病变范围及程度轻于广防己组，为广防已配伍黄芪缓解其肾毒性作用提供了病理形态及分子层面的解释。

2.3 中药复方的作用机制研究

中药复方由多味中药配伍组成，每味中药含复杂的化学成分，这就决定了中药复方具有多组分、多靶点、多途径等特点。如何阐明中药复方药效物质基础和作用机制是中药复方现代化研究的又一关键问题。代谢组学属于系统生物学研究方法，它把机体作为一个整体来研究，与中医整体观、辨证施治理念十分契合[48]。代谢组学从内、外因素对生物代谢网络影响的角度出发，具有系统性和动态性，对中药复方的整体疗效的评价是十分有效的研究方法。李晶晶[49]等采用基于高效液相-质谱联用的代谢组学技术，观察半夏厚朴汤对抑郁大鼠尿液中代谢物的影响，结果显示空白组、模型组与给药组的代谢轮廓均有差异；相对于空白组，模型组中参与能量代谢的柠檬酸、乳酸、2-酮戊二酸含量减少以及马尿酸、肌酐酸水平升高，而给药组在一定程度上可以逆转这种异常改变，表明半夏厚朴汤可能通过调节以上内源性化合物发挥抗抑郁作用，对其抗抑郁机制提供了分子层面的解释。沈淑洁[50]等基于1H-NMR代谢组学技术研究了半夏厚朴汤镇静催眠作用，结果发现半夏厚朴汤可能通过调节巴比妥诱导睡眠模型大鼠中的谷氨酰胺、磷酸肌酸、2-酮戊二酸的含量，减轻脑内神经兴奋性从而起到调节睡眠的作用。Shui[51]等运用基于LC-MS的代谢组学研究了一贯煎干预角叉菜胶致炎症反应，生化分析结果显示给药组大鼠血清中的IL-1b、TNF-a、IL-6的水平明显降低，代谢组学分析结果显示血清中的胆碱、乙酰胆碱、组氨酸和花生四烯酸等含量显著下调以及牛磺酸、色氨酸、马尿酸和黄尿酸等含量显著上调，推测一贯煎通过调节色氨酸代谢、脂质代谢、氧化应激、乙醛酸-二酸酸代谢及牛磺酸-亚牛磺酸代谢发挥抗炎作用机制。蔡小蓉[52]等采用GC-MS代谢组学方法研究了a-萘异硫氰酸酯致大鼠黄疸型肝损伤生物标志物，并探讨了茵陈五苓散治疗黄疸型肝损伤的作用机制，结果表明模型组大鼠血液中14个代谢物含量发生了显著变化；与空白组比较，高剂量给药组中琥珀酸、柠檬酸、亚油酸、甘油酸、肌醇的含量无显著性差异；高剂量给药组中丝氨酸、苏氨酸、花生四烯酸虽未恢复正常水平，但与模型组呈显著性差异；推测茵陈五苓散可能通过调节氧化应激、三羧酸循环及氨基酸代谢等途径发挥干预大鼠黄疸型肝损伤作用。Tian[53]等采用基于GC-MS的代谢组学对健康自愿者与抑郁症患者以及抑郁症患者给予逍遥丸前后尿液中的差异性代谢物进行了定性、定量分析，结果显示与健康者比较，给药前抑郁症患者尿液中丙氨酸、马尿酸、柠檬酸的含量显著上升，苯丙氨基酸、络氨酸的含量显著下降；而抑郁患者在给予逍遥丸6周后，其尿液中丙氨酸、马尿酸、柠檬酸的含量均显著下降，苯丙氨酸、络氨酸的含量显著上调，推测逍遥丸可以调节机体的神经递质、氨基酸、能量代谢发挥治疗抑郁作用。Song[54]等采用基于NMR的代谢组学研究了血府逐瘀汤治疗高脂饮食致高血脂症的作用，结果显示血府逐瘀汤可以减少机体内的酮体和乙酰糖蛋白的累积，提高谷胱甘肽合成，同时还可以调节能量代谢、脂质代谢，为其发挥治疗高血脂症作用机制研究奠定了基础。

3 展望

中药复方是中华民族的瑰宝，如何用科学语言来阐明中医理论和中药复方的科学性是当前要致力解决的问题。代谢组学是新兴的一门系统生物学学科，具有系统性、灵敏性、特异性和动态性等特点，是一种与中医理论不谋而合的现代研究方法，它为中药现代化研究提供了崭新的思路。代谢组学应用到中药复方领域中来可以评价其整体药效，将有利于系统地深刻地揭示中药复方的内涵。近年来，利用现代分析技术NMR、LC-MS、GC-MS等代谢组学技术已取得了一定的成果，但是代谢组学是处于发展的阶段的新兴学科，仪器分析技术、样品处理方法、数据分析的手段等仍需要进一步完善。但是笔者相信在随着各技术不断地完善，代谢组学在中药复方研究领域中会有更加广阔的应用前景，也必将推动中药复方现代化进程，使我们更加深刻地理解中药复方的科学内涵，更好的传承和发展中医药事业。

以基因、mRNA、蛋白质、代谢产物为研究对象的基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学同是系统生物学的重要组成部分。体内小分子内源性化合物是基因表达的最终产物，因此代谢组学可以获得与机体病理状态或药物作用的直接相关代谢信息。但是要进一步验证生物标志物、阐明疾病发生机制与药物作用机理还需结合基因组学、转录组学、蛋白质组学研究，通过对各个组学的数据进行整合，才能将数据转化为知识。