青蒿素抗疟作用机制研究进展＊

王宇彤，邵钰柔，陈利娜，朱永平，王继刚

（1.南京中医药大学药学院 南京 210023；2.中国中医科学院青蒿素研究中心 北京 100700）

青蒿素是从黄花蒿中提取的一种倍半萜烯内脂化合物，在临床上长期被用于治疗疟疾[1,2]。自19世纪70年代被中国科学家屠呦呦发现以来，青蒿素已经拯救了成千上万人的生命，尤其是感染了早期疟疾、治疗药物奎宁耐药的恶性疟原虫的病人，屠呦呦也因此获得了2015年的诺贝尔医学或生理学奖。青蒿用于抗疟治疗在中国早有记载，东晋时期的葛洪在《肘后备急方》中首次提到青蒿对于疟疾有潜在的治疗作用，明朝的李时珍在《本草纲目》中也有提及。自二战以来，人们一直使用氯喹治疗疟疾[3]，在当时也取得了良好的效果，然而，随着氯喹耐药疟原虫株的出现，全世界的抗疟形式变得岌岌可危。在这种形势下，屠呦呦临危受命，其团队根据中国古方记载，在数万余种草药中筛选并发现青蒿中提取的青蒿素具有显著的抗疟效果[4,5]。为了增强疗效和预防青蒿素耐药，科学家们以青蒿素的分子结构为基础，开发了一系列青蒿素的衍生物，同样具有良好的抗疟效果[6,7]，包括二氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等。直至现在，青蒿素及其衍生物依然是临床上用于疟疾治疗的首选药物。

伴随着青蒿素的发现，大量的科学家开始研究青蒿素的作用机制，并以此为基础，优化青蒿素的抗疟效果和开发其它的抗疟药物，以防止出现耐药性的疟原虫株。令人意想不到的是，人们在青蒿素机制的研究上遇到了难题，迄今为止，对于青蒿素到底如何杀伤疟原虫这一问题，在学术界依然存在争议。然而，从2008年开始，陆续有报导表明出现了具有青蒿素耐药的耐药疟原虫株[8]，令青蒿素的药理机制研究变得异常紧迫，人们需要从青蒿素的作用机制中寻找到疟原虫的治疗靶点，从而去开发新型抗疟药物。

1 青蒿素的结构与功能

青蒿素是一种具有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物[9]，纯净的青蒿素味苦，为针状无色晶体。科学家们为了研究青蒿素结构与功能的关系，设计并合成了大量青蒿素的类似物[10,11]，通过对类似物抗疟活性的测定，发现青蒿素结构中的过氧桥对于青蒿素的抗疟活性至关重要，失去了过氧桥结构的类似物相应地失去了抗疟活性，而保留了过氧桥结构的类似物大多保留了青蒿素的抗疟活性。由于青蒿素既不溶于水，又不溶于有机溶剂，导致青蒿素难于被有机体利用，因此科学家们基于青蒿素的构效关系，开发了一系列青蒿素的衍生物其中二氢青蒿素和青蒿琥酯易溶于水，而蒿甲醚和青蒿乙醚易溶于有机溶剂。这些青蒿素衍生物同样作为临床抗疟药物的有效成分在抗疟斗争中起了巨大作用。

2 青蒿素的机制研究

虽然近年来很多科学家就青蒿素的抗疟机理进行了大量的研究，但是青蒿素具体如何作用于疟原虫仍存在争议，有两个关键问题亟待解决：1是用于激活青蒿素的铁源来自哪里；2是被激活的青蒿素到底有哪些蛋白靶点。近年来，陆续出现了青蒿素耐药的疟原虫株[12,13]，阐明青蒿素的作用机制并进一步研究产生青蒿素抗性的主要因素变得迫在眉睫。在本篇综述中，我们总结了在青蒿素机制研究中具有代表性的研究成果，包括青蒿素的激活剂研究、青蒿素的靶点研究以及青蒿素抗性机制研究，并基于这些研究成果提出了我们自己的看法。

2.1 青蒿素的激活

青蒿素的结构中存在过氧桥结构，而青蒿素要发挥抗疟活性又必须通过还原剂打破过氧桥结构，从而使青蒿素分子内电子重组形成自由基，进而导致疟原虫蛋白的烷基化，最终实现疟原虫死亡[14]。由于Fe2+可以催化过氧化物产生自由基，而且疟原虫中富含丰富的Fe2+，所以科学家一直认为具有抗疟活性的青蒿素是通过Fe2+催化激活的。然而，铁元素的来源也多种多样，包括氯高铁血红素、亚铁血红素、游离的铁离子等等，到底用于激活青蒿素的铁来源于哪里，在青蒿素的研究过程中存在过巨大的争议。

最早期的研究认为，游离的非血红素铁是青蒿素的激活剂[15,16]。Meshnick等人在1993年发现铁离子螯合剂可以抑制青蒿素的类似物蒿乙醚对于疟原虫的杀伤作用。进一步研究发现，铁离子的螯合剂可以显著抑制青蒿素产生自由基，所以研究者得出结论，游离的铁离子对于青蒿素杀伤疟原虫至关重要。但是，该实验无法排除血红素铁激活青蒿素的可能性。Meshnick研究小组在随后的研究中推翻了他们之前的结论，他们发现只有在亚铁血红素存在的情况下，青蒿素才能结合其靶点蛋白，表明亚铁血红素可能是青蒿素的激活剂[17]。Paul等人发现，青蒿素在疟原虫中通过游离的铁离子激活，从而介导疟原虫中靶标蛋白的烷基化，其研究结果表明青蒿素的激活是通过游离的铁离子介导的[18]。

在随后的研究中，人们开始将目光转移到血红素对于青蒿素的激活作用上来，更多的研究成果表明血红素来源的铁才是青蒿素的激活剂[19-21]。Cheng等人通过分子对接模拟技术发现氯高铁血红素有着与青蒿素及其类似物结合的潜在位点[22]。Messori研究小组通过液相色谱-质谱联用技术检测了氯高铁血红素和青蒿素以及青蒿素类似物（包括二氢青蒿素、青蒿素甲醚以及青蒿琥酯）的结合能力[23]。结果发现，青蒿素的类似物和青蒿素一样，都可以和氯高铁血红素1∶1形成配合物，并导致化合物中过氧桥结构的破坏。基于此，研究者认为青蒿素的激活是由氯高铁血红素导致的。然而，研究者忽略了一个问题，本实验中，青蒿素和氯高铁血红素的结合是在70℃的条件下检测的，而非生理条件的37℃，而且根据实验结果，青蒿素和氯高铁血红素在37℃下结合能力较弱，这使得人们对于氯高铁血色红素激活青蒿素这个结论仍持怀疑态度。

Zhang等人比较了氯高铁血红素、亚铁血红素、无机的铁离子以及血红蛋白对于青蒿素的激活效率[14]，结果表明，亚铁血红素相比于其它几种潜在的激活剂具有更高的激活效率，暗示亚铁血红素可能是青蒿素的首要激活剂。然而，通过该实验我们可以发现，氯高铁血红素虽然激活效率不如亚铁血红素，但是仍然可以激活青蒿素对于疟原虫的杀伤作用，所以该研究并不能充分说明亚铁血红素就是青蒿素的激活剂。

2015年，Wang研究小组利用化学生物学的方法明确了激活青蒿素的铁来源，他们认为氯高铁血红素以及亚铁血红素对于青蒿素的激活至关重要，都是青蒿素的激活剂[24]。氯高铁血红素中的三价铁可以被体内的还原剂例如谷胱甘肽、维生素C等还原为亚铁血红素，继而破坏青蒿素中的过氧桥结构产生自由基，从而杀伤疟原虫。Wang等人首次基于青蒿素的活性结构合成了青蒿素探针，利用化学蛋白组学研究手段，通过该探针筛选青蒿素在疟原虫中的蛋白靶点，通过青蒿素探针和靶点蛋白结合的强弱判断不同来源的铁对于青蒿素是否有激活作用。研究发现，氯高铁血红素在有还原剂维生素C存在的情况下可以明显加强青蒿素与其靶点蛋白的结合，而游离的无机铁离子无此效应，且游离的铁离子螯合剂对于青蒿素与靶点蛋白的结合基本没有影响。以上结果表明，血红素（包括氯高铁血红素和亚铁血红素）而不是游离的无机铁在青蒿素的激活中起关键作用。

Xiao研究课题组在人宫颈癌Hela细胞株中的实验结果也得到了与Wang课题组类似的结论[25]。Xiao组同样利用化学生物学的方法设计并合成了青蒿素的分子探针。利用该探针，他们在Hela细胞中筛选青蒿素的蛋白靶点。他们发现，在氯高铁血红素存在的情况下，青蒿素探针可以结合更多的蛋白靶点，表明氯高铁血红素可以激活青蒿素。然而，他们认为亚铁血红素才是青蒿素的直接激活剂，氯高铁血红素之所以可以用于激活青蒿素是因为肿瘤细胞中丰富的巯基可以将氯高铁血红素还原为亚铁血红素，继而激活青蒿素。虽然该结果是在肿瘤细胞中获得的，但是青蒿素在疟原虫中的激活过程实际上和它在肿瘤中的激活过程是类似的，所以我们也能从这个结果中获得青蒿素激活剂来源的启发。

总结科学家们前期对于青蒿素激活剂的研究成果，多方面证据都表明血红素（包括氯高铁血红素和亚铁血红素）是青蒿素发挥抗疟作用的激活剂，而游离的无机铁离子与青蒿素的激活无关。

2.2 青蒿素的靶点

自1971年发现青蒿素的抗疟活性以来，科学家们做了大量的研究工作去探究青蒿素的作用机理，然而迄今为止，青蒿素到底如何有选择性地杀死疟原虫的作用机制却并不明确[4,8,26]。究其原因，主要是由于青蒿素复杂的分子结构以及多靶点的药理特性，导致人们很难去明确青蒿素在疟原虫中的蛋白靶点，即使能够发现某一靶点蛋白，也很难确定此靶点蛋白在青蒿素抗疟活性中是否起关键作用。

翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）是最早被确认的靶点蛋白之一[27,28]。Bhisutthibhan等人发现，青蒿素的衍生物二氢青蒿素可以浓度梯度依赖性地与TCTP结合，并最终达到1∶1的比例[29]。研究者通过斯卡查德分析，确定了TCTP蛋白上有两个可以与血红素结合的位点，并基于此得出结论，TCTP在有血红素存在的情况下可以和青蒿素结合并且自身也可以和血红素结合。Bhisutthibhan等人的发现为青蒿素的机制研究奠定了一定的基础。同样的，Eichhorn等人运用结构生物学的方法首先确定了TCTP蛋白的分子结构，并通过质谱、生物信息学、表面等离子共振等技术发现TCTP上存在青蒿素的结合位点，而且这些结合位点与TCTP的生物学功能息息相关，猜测青蒿素可能是通过TCTP蛋白起作用杀死疟原虫的[30]。然而，后续的研究成果并没有发现TCTP蛋白与疟原虫死亡之间的联系，青蒿素和TCTP的结合似乎更像是一种偶然[8]。

相比较而言，心肌肌浆网Ca2+-ATP酶（PfATP6）的发现则让人们对于青蒿素机制的研究更近了一步。2003年，Eckstein-Ludwig等人在Nature上发表论文，发现青蒿素可以显著抑制PfATP6的活性[19]。进一步研究表明，PfATP6的特异性抑制剂毒胡萝卜素也具有杀伤疟原虫的效果，而且不具有青蒿素抗疟活性的一种青蒿素衍生物（失去了过氧桥结构）无法抑制PfATP6的活性。另一方面，在没有铁激活的情况下，青蒿素失去了抗疟活性，同时也失去了抑制PfATP6的活性。以上种种结果都表明青蒿素通过抑制PfATP6的活性达到杀伤疟原虫的效果。另一个研究成果同样也证明了PfATP6和青蒿素的结合[31]。Shandilya等人通过密度泛函理论计算、分子对接、分子动态模拟等方法发现青蒿素通过抑制PfATP6的磷酸化、核苷酸结合导致PfATP6活性的丧失，从而杀死疟原虫。然而，Arnou等人通过异源表达并纯化了PfATP6蛋白[32]，通过体外结合实验发现，异源表达的PfATP6与毒胡萝卜素有着较低的亲和性，PfATP6并不能结合青蒿素，而且青蒿素对于PfATP6也没有抑制活性，这表明PfATP6作为青蒿素的蛋白靶点在青蒿素抗疟活性中起关键作用还存在疑虑。

近期，有科学家发现磷脂酰肌醇-3激酶（PfPI3K）也是青蒿素在疟原虫中的靶点之一[33]。Mbengue等人发现青蒿素以及它的衍生物二氢青蒿素可以显著快速地抑制PfPI3K的活性。而且通过对于PfPI3K蛋白晶体结构的分子模拟，他们发现二氢青蒿素可以与Pf-PI3K分子上的疏水区域结合。进一步研究发现，在青蒿素耐药的疟原虫中，PfPI3K的上调与一种青蒿素耐药标志物的基因突变相关。综合以上结果，研究者认为PfPI3K是青蒿素杀灭疟原虫的关键靶标蛋白。

此外，清华大学的周兵研究组多年来以酵母作为模型，研究青蒿素和线粒体之间的关系[34,35]。他们发现，青蒿素可以导致线粒体去极化，线粒体既是青蒿素的靶标，也是青蒿素的激活剂。他们的发现将青蒿素的靶标和生理学效应相关联，在一定程度上解释了青蒿素的特异性以及作用机制。

随着生物技术的发展，出现了一些用于鉴定化合物蛋白靶点的新方法。例如，Wang组和Xiao组都采用了化学生物学的手段分别在疟原虫中和肿瘤细胞中筛选了青蒿素的蛋白靶点[24,25]。Wang等人采用了一种无偏见的化学蛋白组学方法，在疟原虫中筛选青蒿素的蛋白靶点，通过靶点的分析，推测青蒿素可能的作用机制。其主要流程可概括如下：首先，基于青蒿素的分子结构以及活性基团，他们设计并合成了青蒿素的分子探针，该探针相较于青蒿素多了一个炔基标签，用于后续的点击化学反应及靶点蛋白的富集。待探针在疟原虫中与靶点蛋白充分结合后，通过“点击化学反应”在探针-蛋白复合物修饰上生物素标签。接着，通过亲和富集的方式富集连接在探针上的靶点蛋白。最后通过液质联用鉴定出了124种疟原虫中的青蒿素靶标蛋白，其中包括前面提到的PfATP6以及其它32种与抗疟相关的蛋白。通过蛋白组学分析发现，这124种青蒿素靶点蛋白与疟原虫中一些关键生物进程相关，所以可以认为青蒿素通过与这些靶点蛋白结合干扰了疟原虫中的关键生理过程，进而导致疟原虫死亡。与Wang组类似的是，英国利物浦大学的Ismail等人也合成了类似的青蒿素分子探针，也筛选到了60多种青蒿素蛋白靶点（其中大多数靶点蛋白与Wang组的结果一致）[36]。

2.3 青蒿素的耐药

耐药是药物在长期使用后常见的现象，关于疟原虫出现青蒿素耐药的报导近年来开始出现。2009年，Dondorp等人在《新英格兰医学杂志》上发表文章，明确提出了某些地区的疟原虫开始出现青蒿素耐药现象[12]。他们比较了青蒿素的衍生物青蒿琥酯对于柬埔寨和泰国不同地区的恶性疟原虫的清除效率，发现柬埔寨西部的疟原虫对于青蒿琥酯的敏感性明显降低，而且青蒿琥酯对于疟原虫的清除效率也有明显的下降。考虑到青蒿素及其衍生物在现代临床抗疟中的关键作用以及疟疾治疗对于青蒿素的依赖性，这种青蒿素耐药疟原虫的出现和传播必然会导致严重后果。因此，探究青蒿素耐药的分子机制并基于此进一步优化临床抗疟药物的分子结构变得至关重要。

青蒿素耐药现象从一开始就被认为与疟原虫的基因突变相关[37]，根据前期对于耐药现象以及青蒿素机制的研究，Pfmdr1（与多种药物耐药相关的转运体）和PfATP6（被确认为青蒿素的蛋白靶点）在早期曾被认为可能与青蒿素耐药相关。然而，Imwong等人的研究结果表明这两个基因似乎与青蒿素耐药没有联系[38]。Cheeseman等人利用单核苷酸多态性分析比较了91种从柬埔寨、泰国和老挝不同地区获得的疟原虫基因组，发现有33段基因组序列可能与耐药性相关[39]。接着，他们用了同样的技术在从泰国获得的715种疟原虫株中比较这33段基因组序列，最终发现13号染色体突变与青蒿素耐药关系密切。Ariey等人更进一步通过全基因组测序技术发现Kelch13（K13）基因的突变是青蒿素耐药的标志[40]。以上研究为青蒿素耐药的机制探索奠定了基础，但是如何将K13突变与青蒿素耐药联系起来仍然是个难题。

Mok等人通过转录组学的方法分析了从病人身上提取了1043种疟原虫的分离株[41]，发现青蒿素耐药与未折叠蛋白应答（UPR）通路相关，主要包含两种复合物，分别是活性氧化应激复合物（PROSC）和TCP-1环装复合体（TRiC）。这两种复合物的mRNA水平不仅相互影响，而且与青蒿素耐药相关。另外，上调UPR水平可以明显提高疟原虫对于青蒿素的耐药程度，并且同时损伤K13蛋白的功能。Mok等人的发现将K13突变与青蒿素耐药联系了起来，然而还是缺乏一些中间环节，而且无法确定是否有其它因素与K13突变及青蒿素耐药相关。

另一方面，Mbengue等人发现青蒿素耐药与青蒿素的靶点PfPI3K有关[33]。他们首先通过生物化学方法发现PfPI3K是青蒿素的靶点之一，接着对于耐药疟原虫的研究发现，PfPI3K的上调与疟原虫中K13基因的C580Y位的突变相关。K13基因的突变阻止PfPI3K的多聚泛素化和与PfK13蛋白的结合，继而限制了Pf-PI3K的水解以及其脂化产物PI3P的上调。他们还发现，PI3P的上调可以作为青蒿素耐药的标志，而且PI3P导致的青蒿素耐药并不依赖于K13基因的突变，但受K13突变的调控。以上结果表明，PI3P是青蒿素耐药的关键调控因子，而PfPI3K是青蒿素与青蒿素耐药相关的重要靶点。Mbengue等人的发现说明K13突变并不是青蒿素耐药的唯一因素，青蒿素耐药可能是多种因素或者多个基因突变共同造成的。

3 总结与展望

青蒿素自19世纪70年代发现以来，作为治疗疟疾的首选药物已有近50年的历史。迄今为止，大多数治疗疟疾的治疗方法仍然以青蒿素或其衍生物作为基础，可以说，青蒿素的发现拯救了千万人的生命。虽然青蒿素自发现以来就获得了大量的关注，人们对于青蒿素的作用机制也开展了大量的研究，然而对于青蒿素到底如何作用于疟原虫、为何青蒿素可以高效选择性地杀伤疟原虫这些问题仍然存在争议。由于青蒿素本身是原药，必须经过激活后才能与蛋白结合，所以若要研究青蒿素的作用机制首要的问题就是用于激活青蒿素的铁到底来源于哪里。关于这个问题，有的报导表明铁来源于游离的铁离子，有的报导表明铁来源于血红素，而且都提供了明确的证据。第二个核心问题是青蒿素在疟原虫中的作用靶点。早期科学家通过生物化学的方法发现了青蒿素的一些蛋白靶点，例如TCTP、PfATP6等，但是人们无法证明这些靶点与青蒿素的抗疟活性相关，或者说无法将这些蛋白靶点与青蒿素杀伤疟原虫联系起来。随着生物技术的发展，出现了一些新型的技术手段，比如化学蛋白质组学手段，Wang研究团队利用该方法不仅证明了血红素是激活青蒿素的铁来源，还在疟原虫中无差别地筛选到了124种青蒿素靶点蛋白，初步阐明了青蒿素的分子作用机制，为青蒿素的机制研究奠定了靶点基础。随着青蒿素的大量使用，不可避免地出现了一些青蒿素耐药的疟原虫株，一旦传播将会严重危害到了人类的健康。青蒿素作用机制的不明确给青蒿素耐药的研究带来了很大的困难，但是并不是毫无进展，科学家已经基本确定Kelch13（K13）基因的突变是青蒿素耐药的标志，至于K13突变如何和青蒿素耐药联系起来仍然是一个难题。而根据上述的青蒿素多靶点作用理论，单个基因突变并不足以引起青蒿素耐药，这种传统耐药机制似乎不能用于解释青蒿素耐药机制。因此，我们期待有更先进的新技术、新方法能够运用到青蒿素机制研究中来，尽快揭秘青蒿素抗疟及抗药问题。