基于代谢组学的中药质量及机制研究＊

贾志鑫，徐文娟，马恺悦，肖红斌

（1.北京中医药大学北京中医药研究院 北京 100029；2.北京中医药大学中药分析与转化研究中心 北京 100029；3.北京中医药大学生命科学学院 北京 100029；4.北京中医药大学中药学院 北京 100029）

中药是中医临床应用的重要形式，是辨证论治的集中体现，其多药物、多成分的组方原则决定了其药理作用机制的多靶点、多途径等特点。中药的活性并不是简单多成分药理指标的叠加，而是不同活性成分相互作用（药效上的协同或拮抗、毒性上的降低或增强），最终以网络形式表达的整体药效作用。中药的多组分特征增加了研究的复杂性，使其质量控制、药效物质基础及作用机制研究缓慢，成为制约中医药现代化和国际化发展的瓶颈。建立符合中药特征的研究模式，有效控制中药质量，系统阐释中药的科学内涵，是中药现代化的关键科学问题之一。

系统生物学于1998年由美国的Leory Hood教授系统提出[1]，它是研究生物系统组成成分的构成与相互关系的结构、动态与发生，以系统论和实验、计算方法整合研究为特征的生物学。代谢组学是系统生物学的重要组成部分，它兴起于上世纪90年代中期且发展极为迅速。代谢组学把机体作为一个完整的系统来研究，具有整体性、系统性的特点，其研究思路与中医药的整体观和辨证论治特点吻合，在中药物质基础研究、质量控制、药效作用机制、毒性机制、安全性评价等多个领域展现出了广阔前景，为中药复杂系统研究和新药研发提供了有力手段。

传统中药研究多基于“还原论”进行。这种方法虽然能研究的较为全面，但耗费时间较长、成本较高，且针对中药的研究最后往往都变成了中药零部件研究或单体成分药研究，不符合中药“系统性、整体性”的特点。随着组学技术的发展和人们对中药系统性认识的不断加深，研究思路正从还原性研究转化为系统性研究，实现从描述到预测的飞跃。基于“系统论”的中药研究可借助代谢组学方法重点从药物作用的通路、网络入手进行整合研究，以阐明中药作用机制，把控中药质量，推动中药组合药等新药研发。

1 代谢组研究进展

代谢组学（metabonomics/metabolomics）于1999年由Nicholson[2]首次提出，是研究生物体系受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后）其内源代谢物种类、数量及其变化规律的科学。代谢组学是系统生物学的一个重要组成部分。系统生物学主要由基因组学（genomics）、转录组学（transcriptomics）、蛋白质组学（proteomics）和代谢组学等构成。虽然基因组和蛋白质组体现了生物功能代谢的上游信息，但二者的功能缺失可由其它基因或蛋白质的存在而得到补偿，其结果不一定会反映在生物体表型上。而小分子物质的产生和代谢才是机体复杂代谢反应的最终结果，它们能更直接、更准确、无歧视的反映生物体的生理病理状态。代谢组学在多种领域都有较好的应用，其中以生物医学领域最为广泛，常被用于发现疾病标志物、研究发病机理、及评价药物疗效等。

国外有学者把代谢组学分为4个层次，即代谢靶标分析（Target Analysis）、代谢轮廓分析（Metabolic Profiling）、代谢指纹分析（Metabolic Fingerprint-ing）和代谢组学[3,4]。这4个层次由单一靶目标定量到多目标定量，由结构或性质相关的一类化合物的轮廓分析到全局化合物的轮廓分析，体现了代谢组学技术的发展及研究理念的提升。代谢组学的研究策略主要包括代谢指纹谱分析和代谢靶标分析。其中代谢指纹分析旨在对生物样本中所有代谢物进行分析，从整体的角度观测生物体系对外界刺激的代谢变化响应，进而溯源上游的蛋白质组乃至转录组的调控机制。而代谢靶标分析则聚焦特定的代谢通路，一次完成多种化合物定量分析。早期代谢组学研究以疾病标志物发现为主要应用方向，而代谢指纹谱分析“俯瞰”生物体系代谢物整体变化，是早期最主要的研究方式。随着对复杂机体逐步深入的认识，代谢组学研究从疾病标志物发现转移到代谢机制研究，代谢靶标分析以其在定量方面的优势，成为目前代谢组学研究的主流方式。

1.1 代谢组学标准化研究

完整的代谢组学包括样本准备、数据获取、标志物分析和网络分析这几个步骤。代谢组学技术和操作条件多种多样，而大量样本经过前处理等环节所产生的误差以及在数据获取和分析中所引入的不确定性使研究者越来越意识到分析流程标准化的重要性。Zeper A等[5]进行了代谢组学样品稳定性研究，发现不同储存条件下有36个代谢物差异显著（P＜0.05），甚至有代谢物在-80℃保存5年后变化超过100倍，证明代谢组学标准化势在必行。Lindon JC等[6,7]对代谢组学规范化研究进行了详细的总结，并制订和发布了有关代谢组分析方法的标准化报告的详细草案。Bino RJ等[8]提出了MIAMET的代谢物组学数据模式，除样品收集、处理外，还涉及数据分析等各环节。Xu GW等长期致力于样品标准化获取及处理的研究，考察了不同采血管、冻融次数、放置时间等因素对结果的影响[9]，比较了血浆、血清所获得结果的区别[10]，为样本标准化采集提供了参考方案。随着研究的不断深入，越来越多的研究者发现生物标志物具有难以重现甚至趋势相反等现象。Xu GF和Zhang ZJ等[11]对这一现象进行了深入研究，系统比较了归一化数据预处理方法对生物标志物筛选的影响，初步揭示了“代谢组学标志物筛不对”、“实验室间可比性差”的原因，对于组学数据分析标准化具有积极贡献。

1.2 高覆盖度的数据获取

样品数据获取是代谢组学的核心关键技术，现阶段技术手段以LC/MS、GC/MS以及NMR应用最为广泛。因各种技术均有相应的适用范围，且内源性化合物种类繁多特点各异，并不能真正完全的表征全部内源性代谢物。如何开发高覆盖度的数据获取策略成为研究的难点与热点。整合多种技术的代谢组学分析平台（如靶向与非靶向技术结合），多种分析方法整合应用以及计算机辅助文献挖掘等方法成为新的发展趋势。Xu GW等[12]结合UHPLC-HRMS和UHPLC-MS/MS的优势开发了一种高覆盖度的伪靶向脂质组学分析方法，通过3377个靶向脂质离子对测定了超过7000种脂质化合物，为代谢组学高覆盖度数据获取提供了有力借鉴。如何囊括低丰度、高活性的代谢物信息也是代谢组学高覆盖度数据获取的发展方向。Zhang JL等[13]针对脂肪酸类化合物建立了衍生化方法，使该类化合物的质谱检测灵敏度提升了2-3个数量级。Li L等[14]建立了化学同位素标记液质联用方法用于人尿液中羟基化代谢物的高通量表征，可初步鉴定3093个峰中的2304个代谢物。以上方法提高了检测灵敏度，扩充了代谢组学所覆盖化合物的广度，以期尽可能更多、更完整的表征生物样品中的内源性代谢物信息。

1.3 标志物识别及网络分析

代谢组学数据分析通过化学计量学与多元统计学分析方法相结合，对机体内代谢物进行全面分析，表征差异性生物标志物，探索其与生物体产生的生理、病理变化或药物治疗下生物体整体状态改变的相关性[15]。

标志物判别常采用主成分分析（PCA）、层次聚类分析（HCA）、非线性影射（NLM）等非监督分类方法，以及偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）、神经网络（NN）等监督分类方法，其中PCA和PLS-DA应用较为广泛。刘昌孝等[16]对化学计量学在代谢组学中的应用进行了系统性的研究。标志物的鉴定仍是目前的最具有挑战的工作之一，研究者为此开展了多方面研究，建立起系列数据库用于精确分子量比对鉴定，如METLIN（www.metlin.scripps.edu）、MassBank（www.massbank.eu/MassBank/）、HMDB（www.hmdb.ca）等。Brüschweile R等[17]建立了MS/NMR联用的代谢产物快速鉴定策略，鉴定了大肠杆菌提取物中氨基酸、核酸、核苷酸等化合物。Xu GW等[18]成功的将高分辨质谱、微分离制备和色谱技术相结合，解析了能够表征糖尿病的代谢产物的同分异构体。后续在此基础上不断完善，形成标准操作规程并建立起约2000个化合物的实验室代谢产物数据库，成功应用于血浆中202个代谢产物的鉴定[19]。

经过近二十年的发展，代谢组学已由最初的差异代谢物发现、潜在标志物筛选进入到更深层次的相关代谢通路分析，且随着生物大数据时代的来临，代谢组学后期数据处理正逐步深入，尝试与网络药理学相结合，探讨生物病理、药物治疗的机制研究，构建标志物与标志物、标志物与靶点以及靶点之间相互作用的网络，触及探究生命的本质。基于以上理念，本课题组[20]探索性的通过代谢组学获得丹红注射液针对巨噬细胞泡沫化模型差异代谢物，结合网络药理学构建“活性单体药效靶点－疾病通路蛋白”相互作用网络，研究丹红注射液的药效传递特征途径。Zhang ZJ等[21]利用代谢组学进行雄黄毒性标志物研究，在整合LC-MS、GCMS、NMR技术后得到50个生物标志物，并构建了受其影响的代谢网络，指征到三羧酸循环、色氨酸代谢、能量代谢三个通路。Yao L、Wang XJ和Lu HT等[22]定义了精准修饰代谢组学这一策略，靶向关注目标代谢通路化合物，同时利用质谱进行同位素示踪，然后分析关键调控基因和相关酶，深入研究致病性大肠杆菌引起尿路感染的诊断、病源机理，并助力创新药物的发现。

随着仪器灵敏度的不断提升、高通量组学技术的不断进步、计算方法与能力的迅速发展、开源数据的不断积累，代谢组学进入了全新的生物信息时代，其在中药相关领域的研究也迎来了更好的发展契机。而如何实现代谢组学在中药质量标准及机制研究中的应用是所面临的关键问题。本课题组为解决上述关键问题进行了一系列的研究和探索，以期推动代谢组学在中药研究中的应用，助力中药新药研发，推动中药国际化现代化进程。

2 代谢组学在中药研究中的应用

2.1 中医药整体评价

中医证候研究是指将中医整体观和中医辨证施治观相结合，综合性的评价中医诊治疾病的本质与作用规律，是中医基础研究中的核心研究内容，也是中医学对疾病的一种特殊的研究和处理方法[23]。代谢组学反映的是人体整体代谢网络对所有扰动因素进行整体回应的结果，可能更接近于中医“证”的内涵[24]。Wang GJ等[25]开展了临床高血压病人中医辩证分型（包括肝火亢盛、痰湿雍盛及阴虚阳亢三型）的血清代谢组学研究，利用PCA和马氏距离法可明显区分3种不同证型的高血压病人，且后者可在一定程度上显示3种证型的发展关系，符合中医辨证分型的理论。此项研究证明了利用代谢组学研究技术揭示中医“证”本质的可能性。本课题组[26-28]基于代谢组学进行糖尿病中医证候研究。将氨基酸代谢轮廓谱与脂肪酸代谢轮廓谱作为研究对象，通过对这两类代谢成分的定量及关联研究，寻找糖尿病及其中医证候的物质基础，以期促进糖尿病中医诊断科学化、规范化。

中药则是在中医辨证施治、辨病理论基础上，施以根据一定组方原则组成的多味中药方剂或单味药，是中医临床治疗疾病的主要形式。基于代谢组学对中药进行整体性评价，既符合中药多靶点、多途径的复杂作用特点，又契合中医证候整体观、辨证治疗的理论。Wang XJ等[29]运用UPLC-MS技术研究温心方治疗心气虚证的药效物质基础，结合多变量统计学分析方法表征了17个特异性生物标志物及其代谢网络，包括硬脂酸、尿酸、左旋肉碱、3-羟基犬尿氨酸等。结果显示温心方治疗心气虚证的作用途径主要与生物体内糖酵解、不饱和脂肪酸的合成代谢、糖异生代谢和嘌呤代谢密切相关，科学阐释了中药辨证施治的作用机理。本课题组[30]进行了基于代谢组学的择时合用中药抗肾虚衰老研究。设立正常组、肾衰老模型对照组、肾衰老模型给药组（不同时间给予不同中药组合，共4组），创新性的结合GIOS变量筛选并进行疗效评价，发现可显著区分对照、模型及给药组，且不同药物干预组变化趋势不同，体现了代谢组学对中药的整体性评价。

2.2 中药质量标志物筛选

图1 基于代谢组学的中药质量标志物筛选策略

传统的中药质量标准的研究手段通常选择含量高、有一定特征性的成分作为质控指标，但缺乏专属性、溯源性和功能属性相关性。代谢组学反映有机体整体代谢网络对所有扰动因素的完整、无歧视回应的结果，全面考虑影响中药材质量的主要因素诸如品种、气候、产地、采集季节以及炮制方法等。应用该技术进行专属性质量标志物的筛选，可得到更加专属稳定、功能属性相关、遵循组方配伍理论的指标成分。中药质量标志物这一概念由刘昌孝院士[31]提出并获得国内外众多学者认可，意在针对目前中药质量标准存在的不足，形成针对反映中药安全性和有效性的标示性物质进行质量控制的重要新手段。

本课题组在前期研究工作的基础上，结合代谢组学、网络药理学的分析特点以及质量标志物的内在属性，提出了基于代谢组学的质量标志物筛选策略（图1）。首先，借助本课题组前期建立的高灵敏的检测分析技术，对样品进行全成分分析，随后进行标志物的筛选，该部分作为本策略的核心板块，分别从稳定性、专属性、功效相关性和代表性四部分对质量标志物进行筛选研究，最后通过定量分析、聚类及主成分分析等验证所筛选的质量标志物。

基于以上研究策略本课题组开展了人参的质量标志物筛选研究[32]。目前药典中规定的人参的质控指标为人参皂苷Rg和Re，而与人参相同种属的三七、西洋参和珠子参药材所含化学成分相近，在药典质控指标近似的情况下无法准确区分。因此以人参为例借助代谢组学筛选其特征质量标志物。首先，采用高灵敏采集方法对42个样品进行全成分分析，共解析出1634个成分。然后，借助代谢组学处理技术排除冗余成分，并通过分子离子排重、成分等操作，保留并确定人参分别区别于三七、西洋参、珠子参的关键专属性成分。进而，分别对保留的关键化合物进行相关性分析，重点关注丰度较高并且与其它大部分专属性成分含量呈正相关的成分作为人参的候选指标成分。综合考虑指标成分稳定性、含量等问题，分别选择竹节参皂苷Iva、人参皂苷Rf和人参皂苷Rc作为人参区别三七、西洋参和珠子参的指标性成分。为了验证所选择指标成分的合理性，用人参的上述3个指标成分对人参和西洋参、珠子参、三七这四种相似药材进行PCA分析和聚类分析，结果显示四种药材各自划为一类，验证了借助代谢组学技术所选择指标成分具有合理性。

中医临床常以中药材炮制品入药，但炮制前后化学成分往往会发生改变，从而导致药性药效的变化。因此，炮制前后质量标志物的确定对于临床用药疗效和安全至关重要。本课题组以生、熟大黄为例，运用代谢组学方法寻找炮制前后的质量标志物[33]。一方面通过靶向代谢组学，测定大黄炮制前后药典指标含量的变化情况；另一方面基于非靶向代谢组学，进行全谱数据差异性分析，从大黄化学成分中找寻受炮制影响显著的化学成分。靶向数据表明药典中4个指标性成分在炮制后含量下降幅度微小；非靶向数据表明模式识别可发现大黄炮制后有126个特征峰显著变化，其中124个峰显著下降，2个峰显著升高。大黄炮制前后变化最显著的化合物为原矢车菊素B5（或为其异构体），炮制前后含量下降显著的蒽醌类化合物为大黄素-8-O-（6'-O-丙二酰基）葡萄糖苷（或为其异构体）。该结果提示，代谢组学可助力于药材炮制前后质量标志物的筛选，为炮制药材质量标准的建立提供科学依据。

图2 基于细胞代谢组学的中药活性成分肝毒性机制探讨

2.3 中药作用机制研究

2.3.1 药效作用机制研究

中药作用机制的研究是阐明中医辨证论治原理和推进中医药现代化的重要部分，不仅为中医临床合理使用方药提供理论支撑，而且为新药研发提供科学依据[34]。刘昌孝等[35]从代谢物组成分和量的经时变化发现钩藤等多味中药的疗效生物标记物，认为药物的整体作用所产生的生物化学物质（神经递质）是其药效的物质基础，证明多动合剂的作用机制可能与DA受体变化有关，开创性的探索了中药方剂作用机制的研究。

动脉粥样硬化是众多缺血性心脑血管疾病的重要生理病理基础。近年来本课题组基于代谢组学系统揭示动脉粥样硬化及脑中风的代谢异常情况，并以此为基础开展丹红药效靶点发现及量效调控机制研究，对于指导临床诊断以及新药研发都具有重要意义。以巨噬细胞泡沫化作为动脉粥样硬化早期病理模型开展代谢组学研究，实现了胞内163个代谢物的分析，最终筛选出9个重要的生物标志物及6条代谢通路。其中花生四烯酸代谢的贡献最大，其关键代谢物AEA的含量上调，它的代谢产物均呈现明显的下调趋势，结合Western blot结果证明AEA代谢受阻是巨噬细胞泡沫化的主要特征[36]。结合网络药理学构建蛋白互作网络，发现并验证PTGS2（前列腺素内过氧化物酶2）为疾病关键通路蛋白，Tan IIA-EDN1-PTGS2-AEA为Tan IIA药效传递特征途径。此外课题组采用MCAO大鼠模型，基于代谢组学系统阐释脑缺血代谢异常状况[37]以及丹红注射液（DHI）治疗脑缺血的量效调控机制。选择脑缺血特征网络中41个关键代谢物开展靶向代谢组学研究，筛选出DHI不同剂量的特征代谢标志物。评估剂量相关药理模块中节点重要性明确Gly和Glu是剂量相关模块网络中最重要的节点。进而发现并验证Glu-GLT-1/Gly-GlyRα是DHI调控的核心模块单元[20]。

2.3.2 毒性作用机制研究

随着中药研发的现代化和国际化，其安全性倍受关注。与中药药效具有多靶点的特点相类似，中药毒性作用也具有该特点，应用反映整体思想的代谢组学评价中药的毒性，对中药毒性进行系统、全面、整体的评价研究，对于建立现代中药毒理评价体系，确保中药的合理、安全、有效用药，指导临床用药剂量和时间具有积极的意义。如针对传统有毒中药雷公藤，Su MX等[38]通过NMR技术发现内源性代谢物柠檬酸、α-酮戊二酸、牛磺酸、氮氧、三甲胺(TMAO)和葡萄糖等发生了明显变化。推测其毒性机制可能是其损伤了肝线粒体功能及干扰了能量代谢中的三羧酸循环，并导致葡萄糖代谢的紊乱。

本课题组[39]用大黄蒽醌单体干预制备肝损伤细胞模型，进行非靶向代谢组学分析，对显著变化的潜在生物标志物及其代谢通路进行研究，探讨可能的肝损伤机制。对正常组细胞和大黄素干预组细胞模型进行代谢物模式识别，鉴定得到26个与大黄素潜在肝损伤密切相关的代谢物，可明显分为2类：以谷胱甘肽（GSH）为代表的氧化还原相关代谢物和与十八碳脂肪酸代谢相关的脂质及长链脂肪酸氧化产物。在此研究中，我们首次发现了大黄素与半胱氨酸形成的加和物，该加合物具有时间依赖、剂量依赖性。半胱氨酸与肽GSH代谢密切相关，数据表明，谷氨酰半胱氨酸合成酶γ-GCS在低浓度大黄素干扰时活升高，而中、高浓度时活性显著下降。同时，半胱氨酸的代谢物是牛磺酸，而牛磺酸是合成胆汁酸的主要成分，其含量随着大黄素浓度的增加呈现显著性下降。因此我们推测，大黄素-半胱氨酸加和物的生成是肝毒性发生的重要触发点。

3 讨论及展望

代谢组学技术正处于蓬勃发展的时期，但仍面临着诸多不足，如不能完全鉴定生物有机体的全部小分子化合物、无法完成所有目标化合物的定量测定工作、不同实验室之间仍然存在测定结果和分析结果偏差等。科研工作者已经意识到相关不足并向着这些方向不断努力，相信定会逐步提升检测灵敏度和化合物覆盖范围，也势必会迅速扩充现有资源，不短突破新的认知。而现代医药研究所贯彻的“单靶标、单疾病、单药物”研究模式正面临耗费巨大、成功率低的困境，这为中药的发展提供了新的契机和挑战。如何将中药用科学的、现代的语言进行阐释，完善其质量标准，弄清其作用机制，是中医药现代化、国际化所亟待解决的问题。将代谢组学系统性、整体性的特点应用于中药研究，在科学技术创新的基础上又能融合中医药辨证施治、整体调节、阴阳调和等传统特点，将大力推进中药现代化发展，形成一条具有特色的中药新药研发之路。