从补阳还五汤治疗脑卒中谈中药复方药理学新模式及发展方向＊

沈剑刚

（香港大学中医药学院 香港）

脑卒中为人类疾病的第二大死亡疾病，在中国为第一大死亡原因。我国脑卒中发病率以每年8.7%的速度上升，其中缺血性卒中占80%[1]。脑卒中分为出血型和缺血型两种，由于治疗策略完全不一样，早期诊断和治疗非常重要。脑成像技术飞速发展为脑卒中诊断提供了有用的工具。抢救“半暗区”是拯救卒中存活脑细胞的关键治疗策略。1996年美国FDA批准的t-PA是有效治疗急性缺血性脑卒中的药物，但是它有一个非常狭隘的4.5 h时间窗，超过4.5 h有出血的危险和增加卒中死亡率[2,3]。另外，神经保护和神经康复药物的研发并不理想。动物实验中有效的神经保护药在临床观察却无效。

卒中是一个多靶点多系统参与的病理过程，特定单靶点药物的发展策略具有较大的局限性是其中重要原因，缺血性脑损伤修复过程不是单一分子参与，而是网络调控的结果。用几个单靶点治疗药物，或几个药物的联合用药是无法解决实际问题的。因为缺乏有效且安全的药物治疗方法，不少卒中患者遗留终身瘫痪。神经医学对卒中的治疗重点亦逐渐从卒中神经保护转入到神经再生。

1 脑卒中干细胞治疗现状及中医药的机遇与挑战

近年来，干细胞生物学取得重大进展，外源性神经干细胞移植及靶向性内源性神经干细胞增殖分化已经成为脑卒中治疗新方向。但是外源性神经干细胞移植费用昂贵，供体细胞来源及细胞移植后的免疫排异反应等问题，造成此技术目前在临床应用上存在一定的局限性，干细胞治疗用于临床还有很长一段时间。脑卒中后内源性神经再生是目前重要研究方向和治疗靶点，成年哺乳动物的大脑内只有嗅球，侧脑室管膜下区（Subventricular Zone，SVZ）和海马齿回的颗粒下区（Subgranular Zone，SGZ）等少数区域能发生神经再生[4,5]。研究表明，新生的神经元之间的连结能改善运动能力及学习记忆能力[6-8]。缺血缺氧能够刺激释放活性物质唤醒沉睡的干细胞，促进神经干细胞生长和神经再生，达到内源性神经修复。这种现象不仅在动物模型而且在脑卒中病人得到证实[9-11]。暴露于1-5%的O2下可以促进神经干细胞向多巴胺能神经元发展[12]。但是这种自发的神经干细胞的生长和脑修复过程并不能真正有效的恢复脑卒中后缺损的神经功能,从而造成病人终身瘫痪。如何刺激内源性的神经干细胞分化成为功能性神经元，使它们迁移到缺血的区域替代、修复损伤区域是一个重大研究课题。目前已有研究从非编码核糖核酸[13]、血清素[14]、趋化因子[15]等不同角度探讨脑缺血再灌注损伤后的神经再生的治疗策略。故针对内源性神经干细胞增殖分化的策略可能是新药研究的重要方向。由于干细胞修复过程中大量信号分子参与脑修复过程，发展多种药物联合治疗多靶点调控是关键，但是，实际操作调控多少成分以及调控多大程度非常困难。

中医药以其多成分、多靶点治疗体系在中风治疗上有独特优势，脑卒中属于中医药学“中风”病范畴，中医药积累了临床行之有效的方剂，用于治疗中风病证及中风后遗症病人。从现代药理学药代动力学角度而言，中草药是多成分多靶点治疗体系，不像西药纯化合物的血药浓度在12 h内达到峰值，每一个个体药物是相对低的血药浓度慢慢累积，经过长时间治疗以后，给自身调控留有了空间，这在逻辑角度讲，是一个非常合理的思路。这就引出了几个问题：如何寻找证据证明？是否有特异性的靶点？另一方面，由于其成分的多样性、作用靶点的复杂性、品质控制的困难性和缺乏系统的循证医学的研究，中医药在治疗中风方面的国际认受性受到挑战。

我们长期致力于中风后氧化损伤修复的药物开发及神经再生研究。我们曾经对中医经典复方补阳还五汤从基础到临进行了系列研究，现以补阳还五汤的神经保护和促进脑修复为例谈谈中医药治疗中风及其后遗症的启示。

2 补阳还五汤治疗脑卒中经典认识与临床研究现状

脑卒中在中医药学中属于中风病范畴。《黄帝内经》认为中风病的发生与“正气不足，外受风邪”有关，其中《灵枢⋅刺节真邪》篇记载“虚邪偏客于身半，其入深，内居营卫，营卫稍衰，则真气去，邪气独留，发为偏枯”。《金匮要略》认为中风主要病因为络脉空虚，风邪入中。金元时期李东垣认为中风非外来风邪，乃正气自虚所致,明代张景岳指出中风为内伤积损所致,至清代王清任提出中风是由真阴亏损，元气虚脱所致。补阳还五汤是清代医学家王清任《医林改错》治疗“因虚致瘀”中风病证的传统中医名方，为补气行瘀、疏通经络的代表方剂。用“黄芪四两（生）、归尾二钱、赤芍钱半、地龙一钱（去土）、川芎一钱、桃仁一钱、红花一钱”。用于“因虚致瘀”的中风病证[16]。重用黄芪四两为君药,补益元气，去瘀通络。当归尾为臣药，活血通络。赤芍、川芎、桃仁、红花为佐药，协同当归尾以活血祛瘀；地龙通经活络，周行全身，以行药力。《医林改错》提出：“此方治半身不遂、口眼歪斜、语言蹇涩、口角流涎、大便干燥、小便频数、遗尿不禁。”本方以气虚为本，血瘀为标，所以，补阳还五汤之立意为“瘀血不去，新血不生”和“不破不立，瘀祛新生”[17,18]。

近年来，开展了大量补阳还五汤治疗中风病证及中风后遗症临床试验[19]，评价补阳还五汤治疗脑卒中及其后遗症的疗效，我们曾经就补阳还五汤治疗急性缺血性中风的疗效及其安全性作过系统评价[19]。从各种数据库1995-2012年期间记录的354个临床研究报道和观察中，寻找到354个国内外文献报道补阳还五汤治疗中风临床治疗有效，按照循证医学标准，最后纳入符合标准的19个临床疗效评价，在分析过程中又剔除了1个，最后18个临床试验进入了Meta分析体系。系统性评价纳入1580个病例，对补阳还五汤结合常规西医方法与单纯西医治疗方法作比较,中风治疗的金标准为治残率和治死率，但是，很遗憾所有的试验中没有提及治残率和治死率。而且临床疗效评价存在出版偏见。Meta分析显示，补阳还五汤的确有改善神经功能障碍的作用，未见明显副作用。但是，临床试验在严格循证医学标准意义上还有许多缺陷，其临床疗效有待进一步确认。目前临床研究存在的主要问题包括：缺乏终点事件的评价：只有1个研究观察了Barthel指数以评价补阳还五汤对致残率的作用，两组之间致残率无显着性差异（Peto OR,0.36.95%C1,0.12 to 1.07）[20]，未见有对死亡率的评价结果；研究同质型较差：补阳还五汤促进神经功能修复临床试验的异质性使结论审慎乐观；出版偏差，funnel plot分析显示了出版偏差可能影响有关结论。详细的系统性评价可以参考研究报告[19]。为确证中医药临床疗效，我们应当设计严格的临床试验。但是应当指出，补阳还五汤是气虚血瘀型中风治疗方剂，对于其他证型的中风病人不一定适当，目前的临床研究极少考虑这方面的问题，从而为临床疗效结论带来不确定性，如何对中医药治疗中风疗效进行科学和客观的评价值得深入研究。虽然如此，通过Meta分析，我们证明补阳还五汤临床治疗中风改善神经功能有效。

3 补阳还五汤治疗脑卒中神经保护和促进脑修复实验研究现状

我们早期研究显示，补阳还五汤含药血清抑制体外培养大鼠皮层神经元p53和p21基因表达，减少缺氧神经元凋亡[21,22]。补阳还五汤调节大鼠脑缺血后一氧化氮合酶活性，减少氧化损伤，保护缺血后脑组织[23]。补阳还五汤及不同配伍组方促进缺血性脑中风后大鼠神经增殖[24]。补阳还五汤能改善显着线栓大鼠大脑中动脉阻塞模型神经功能障碍症状，减少中性粒细胞浸润和ICAM-1表达，增加缺血皮层周边区存活神经元数[25]。下调脑缺血模型大鼠TNF-α、IL-6、C反应蛋白(CRP)水平[26]，降低线栓法大脑中动脉阻断（MCAO）大鼠模型血清及脑组织IL-6、NF-κB等炎症因子水平[27]，改善脑缺血再灌注大鼠海马CA1区阳性神经元细胞的损伤，降低脑卒中指数评分，增加海马内5-HT的含量[28]，减少脑组织梗死面积，下调血清中CD63、CD62P因子表达[29]。进而减少血管内皮细胞的炎性免疫反应。我们研究发现NO/caveolin-1/MMP-9信号通路是脑缺血再灌注损伤过程中血脑屏障破坏的重要治疗靶点[30]。Caveolin-1也是神经炎症损伤中淋巴细胞通过血脑屏障的重要靶分子[31]。补阳还五汤组显着提高caveolin-1,-2的表达，在3，7天时模型组与补阳还五汤组差异有统计学意义（P＜0.01)[32]。说明补阳还五汤能够保护脑缺血再灌注损伤过程中血脑屏障的完整性。以上实验证据提示补阳还五汤的神经保护机制与抗炎症因子、抗氧化、调节细胞信号及凋亡相关基因有密切关系。

我们早期研究显示，补阳还五汤能促进大鼠脑皮层神经元生长[33]。含补阳还五汤血清药物成份促进常规培养及缺氧神经元生长作用[33]。补阳还五汤含药血清对体外培养的神经干细胞缺氧性损伤具有明显保护作用，可促进缺氧环境下神经干细胞的增殖和分化，还可促使低糖低氧损伤的神经干细胞迁出数量增多，迁移距离增加[34]。我们观察了大鼠缺血性脑卒后遗症模型补阳还五汤促进神经元增殖作用。补阳还五汤水煎液增加了缺血性脑卒后遗症大鼠脑组织中5-溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）的表达，显示具有促进神经增殖作用[35]。补阳还五汤能促进血管内皮生长因子（VEGF）和其受体Flk1的表达，刺激神经干细胞增殖，减少梗塞面积和促进神经功能的修复[35]。补阳还五汤促进神经干细胞的增殖、分化及迁移，改善实验性脑梗死大鼠神经功能缺损作用[36]。最近研究显示，补阳还五汤通过促进神经再生和神经保护机制而减轻脑卒中后抑郁症的发生[37]。

补阳还五汤促进中风后脑修复和重建神经功能信号通路和相关机制也有很好的进展。补阳还五汤可上调缺血脑组织中神经生长因子、神经胶质细胞源性神经营养因子，增加生长相关蛋白GAP-43和PSD-95的表达，促进脑缺血后大鼠神经元突触重塑[38]。加减补阳还五汤增加脑缺血后神经元内脑源性神经营养因子和神经生长因子的含量[39]。含补阳还五汤血清可以促进神经突生长，并明显降低细胞内钙离子浓度[40]。补阳还五汤升高细胞外信号调节激酶E表达，促进缺血区域神经元的生长和分化[41]。补阳还五汤补气药和活血药能协同促进脑缺血后神经发生和恢复神经功能，可能是通过改善局部神经生长微环境，促进表达神经再生中神经营养因子（NTFs），诱导神经干细胞的增殖、迁移及定向分化，进而降低神经抑制因子的表达，减轻继发性损伤[42]。因此，补阳还五汤能调节多种细胞信号通路，促进内源性神经干细胞增殖、分化、迁移和新生神经元整合到反射环路以修复神经功能，达到中风后脑修复和重建神经功能的效果。有关其对多种细胞信号通路的调节作用已得到蛋白质组学研究证实[43,44]。补阳还五汤的有效成分包括：Ferulic acid，calycosin，formononetin，astrapterocarpan-3-O-β-D-glucoside，paeonol，calycosin-7-O-β-D-glucoside，astraisofla-van-7-O-β-D-glucoside，ligustrazine和propyl gallate能够抑制 concanavalin A(Con A)所致淋巴细胞增殖；Propyl gallate，calycosin-7-O-β-D-glucoside，paeonol和ferulic acid抑制脂多糖所致淋巴细胞凋亡；Propyl gallate and formononetin抑制脂多糖所致淋巴细胞释放一氧化氮；Hydroxysafflor yellow A和inosine保护谷胺酰胺所致PC12细胞损伤Formononetin,astragaloside IV，astraisoflavan-7-O-α-D-glucoside，inosine，paeoniflorin，ononin，paeonol，propyl gallate，ligustrazine和ferulic acid抑制氯化钾引起的胸主动脉收缩；说明补阳还五汤通过多种成分作用于多种途径起到保护缺血脑组织的作用[43]。另有研究运用蛋白质组学分析了小鼠脑组织1310条基因，结果显示，对脑组织877条基因定量分析发现，缺血再灌注造10.26%（90/877）基因发生改变，t-PA溶栓治疗组减少到2.62%（23/877）基因发生改变，而补阳还五汤治疗组只有1.71%（15/877）基因发生改变，功能分析发现，补阳还五汤能调节血脑屏障完整性（Alb，Fga，and Trf），抑制兴奋性毒性（Grm5，Gnai and Gdi），增强能量代谢（Bdh），抑制glycogen synthase kinase 3（GSK-3）和Tau蛋白和促进神经再生能力[44]。生物信息学研究显示，补阳还五汤所含411个成分中所对应调节的82个靶分子中，分子对接计算显示，超过80%的分子和靶点有很好的直接作用亲和性[45]。因此，补阳还五汤通过调节多信号通路保护神经细胞和促神经再生。此外，补阳还五汤还可以使大鼠脑缺血后7-14天血管生成基因如血管内皮生长因子（VEGF）和其受体Flk1的表达上调[46]。

4 总结与启示

综上研究，补阳还五汤既可以保护神经细胞，又可以促进神经干细胞脑修复。还有调控血管新生靶点信号，促进脑缺血后血管新生的作用。最近研究发现进一步支持这个观点。这不是单点调控，而是系统调控，发挥其保护神经细胞促进脑修复作用。不同的有效成分作用不同的靶点,在复方治疗体系中,可能存在与单一化学药物不同的药理学模式。比如，这种多成分复方治疗体系的量效关系，可能是不同于单一化合物，它可能存在一种接力赛的关系，相互之间存在协调效应。对于中药活性复方将是未来中医药发展的方向。什么是活性复方？活性复方必须符合2个要素：在中医理论指导下的有大量临床研究证据说明其有效性的中药复方；在质量控制上达到现代药物标准，活性成分相对清楚，作用靶点明确的中药复方。严格而言，要达到这个标准是不容易的。用多学科技术和方法研究中药复方，不仅为阐明中药复方的治疗原理提供希望，而且为中风新药研究奠定基础。

随着中医药全球化和广泛传播，中医药对许多疾病的疗效受到西方主流医学界关注，在中医师报道的一些西医认为没有办法治疗的临床病例中,用中医药治疗完全治愈。但是国际主流医学杂志的有关临床研究报告的结论却多数显示无效，令人感到很困惑。这可能是中西医研究方法学上不同而产生的问题。中医药临床研究存在自身的内在规律。中医药是一个动态治疗体系，不是固定一个方对某种疾病单一的调节，这就很难用传统的统计学方法进行分析。因此如何发展有效方法去理解这样一个复杂治疗体系，对于今后中医药的发展至关重要。随着新的化学分析技术和各种组学技术和人工智能发展和运用于中医中药的研究，我们将有机会打开中医复方治疗疾病的宝库，使中医中药更好的用于人类健康和疾病治疗。