糖肾方改善糖脂代谢紊乱“肝肾同治”机制研究＊

赵婷婷，张浩军，严美花，李 平

（中日友好医院临床医学研究所免疫炎性疾病北京市重点实验室 北京 100029）

糖尿病已成为世界范围内严重危害人类健康的流行性疾病，其发病人数日益增长，其中II型糖尿病占90%以上。我国18岁以上人群糖尿病患病率已达11.6%，患病人口1.14亿，而糖尿病前期患者高达50.1%[1]。糖尿病并发症如糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病的主要死因，据国际糖尿病组织报道，2013年全球约509.7万人因糖尿病及其并发症而死亡，其中中国患者127.1万人[2]。因此，糖尿病并发症发病机制和药物防治已成为当前医学研究重点之一。

脂代谢紊乱是糖尿病及其并发症发生发展的重要机制。多项前瞻性研究已证实脂代谢紊乱是预测2型糖尿病发生的独立危险因素。糖尿病血脂异常的主要临床表现为血清甘油三酯升高和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）降低，可伴低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoproteincholesterol，LDL-C）升高[3]。糖尿病患者不能有效地利用葡萄糖，导致脂肪动员增加，血循环中游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）升高。过剩的FFA进入脂肪细胞合成为甘油三酯被储存起来，FFA在细胞内持续积聚导致脂毒性的产生。FFA在肝组织蓄积表现为非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD），在肾脏则导致DN。

糖尿病患者体内FFA水平升高激活炎症通路，肝脏一方面成为炎症因子作用的靶器官，同时也通过炎症因子释放加重了炎症反应，促进了脂肪肝[4,5]和DN的病理进程[6]。NAFLD患者微量蛋白尿患病率显著高于无脂肪肝患者，且独立于一些潜在的混杂变量[7]，提示NAFLD和DN有着密切联系。因此，纠正与改善脂代谢紊乱在糖尿病肝肾损害的防治中具有重要意义。

本团队在国家科技部“973”计划课题、国家自然科学基金委员会国际合作重点项目等支持下，对近三十年来中医药治疗糖尿病肾病1646篇文献进行了系统的梳理，继承前人经验，结合自身临床实践，创新性提出“从肝论治”糖尿病肾病，以“益气柔肝、活血通络”立法，组方糖肾方。下文将从糖肾方治疗糖尿病肾病临床研究和体内外基础实验研究和化学成分研究等方面进行描述。

1 糖肾方治疗DN改善脂代谢的临床试验研究

2007年4 月至2009年12月间，团队在北京、上海、河北唐山等地6家三甲医院开展了多中心、随机双盲、安慰剂平行对照临床试验（注册号：ChiCTR-TRC-10000843，中日友好医院伦理号：2006-059）。共纳入180例气虚血瘀证2型糖尿病肾病（符合微量白蛋白尿期和显性蛋白尿期）患者，在ACEI或ARB基础治疗上，受试者按2:1的比例随机分为糖肾方组或安慰剂组。其中糖尿病微量白蛋白尿患者98例（糖肾方组66 vs安慰剂组32），大量白蛋白尿患者82例（糖肾方组56 vs安慰剂组26），给药治疗24周。

研究结果[8]显示：糖肾方改善了显性蛋白尿期患者倦怠乏力、肢体麻木等气虚血瘀相关症状，与安慰剂比较差异显著（P=0.0371）。在微量白蛋白尿期，糖肾方治疗组在减少尿蛋白排泄和改善肾小球滤过率方面与国际公认的一线用药ACEI/ARB疗效一致，在延缓肾功能进展方面更具优势；在显性蛋白尿期，尿蛋白排泄增加，肾小球滤过率呈进行性下降，此时ACEI/ARB加安慰剂治疗无法阻止疾病进展，在此阶段糖肾方明显起到了降低24 h尿蛋白定量，提高肾小球滤过率的治疗作用。同时发现，糖肾方显著降低DN患者总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride）、LDL水平，升高HDL水平，改善脂代谢紊乱[9,10]。两组不良事件发生率比较差异无统计学意义。几年来，我们在全国多家三级甲等医院推广使用糖肾方治疗DN（气阴两虚夹瘀型），收到良好的效果。

2 糖肾方减轻糖尿病肝肾组织损害的作用研究

本团队先后利用4种糖尿病肾病模型针对糖肾方开展了系列实验研究，证实了糖肾方在降低24 h尿蛋白排泄、改善肾脏组织病理损伤方面均显著优于阳性对照药蒙诺/安博维，为临床试验结论提供了强有力的实验支撑依据。

我们从日本引进了与人类糖尿病进展特点和病理特征比较相似的自发性2型糖尿病动物模型—OLETF大鼠，该鼠早期以胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱为主，以后逐渐出现胰腺功能减退，晚期合并糖尿病肾脏病变。研究发现，糖肾方对肥胖OLETF大鼠能减轻体重，降低血糖，减少24 h尿蛋白排泄，改善肾小球硬化及小管间质间质纤维化损害[11]，降低血清中白介素-10（interleukin-10，IL-10）和肿瘤坏死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）等炎症介质[12]，改善TC水平和磷脂水平[13]，减轻肝脏损伤[14]，表明糖肾方在改善糖尿病肝肾损害的同时，也在一定程度上纠正了其脂代谢的紊乱。

采用高脂饮食合并小剂量链尿佐菌素成功诱导了类似于2型糖尿病伴脂代谢紊乱的大鼠模型，基于此模型给予糖肾方治疗20周观察其对大鼠肝肾损害的影响。结果表明：糖肾方也降低了模型大鼠的尿白蛋白排泄和减轻了肾组织病理损害，抑制了肾脏炎症因子IL-1β及TNF-α mRNA及蛋白的表达[15]。而且，糖肾方对谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT又称 ALT）、谷 草 转 氨 酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT又称AST）异常升高也有明显降低作用，明显减轻模型大鼠肝组织病理改变[16]。

团队继而采用10周龄自发性2型糖尿病db/db小鼠为模型组，同周龄db/m小鼠为对照组，连续给予糖肾方12周。结果显示[17]，糖肾方治疗组db/db小鼠血清ALT和AST水平显著低于非治疗组，说明糖肾方对糖尿病引起的肝功能损害具有保护作用。肝脏HE染色结果表明，db/db非治疗组肝细胞索排列紊乱，肝细胞肿胀，体积较正常增大，严重者胞质疏松，且汇管区及中央静脉周围脂肪变性明显。糖肾方治疗组肝小叶结构完整，肝细胞排列尚整齐，肝细胞无明显脂肪变性，脂肪病变程度评分显著减少。油红O染色结果发现，db/db小鼠肝组织大量油红沉积，而糖肾方治疗后脂滴变小，数量变少，进一步验证糖肾方能够显著减少肝脏脂质沉积。

3 糖肾方改善糖尿病脂代谢紊乱防治肝肾损害的分子机制研究

图1 糖肾方改善糖脂代谢“肝肾同治”研究思路图

脂代谢紊乱与胰岛素抵抗、多种细胞因子异常分泌、糖原沉积、氧化应激、AMPK活化等诸多因素密切相关。最近的研究显示，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的激活在上述因素介导的脂代谢紊乱中发挥着核心作用，是导致糖尿病脂代谢紊乱的关键环节[18]。核转录因子κB（nuclear factor-κB）信号通路驱动的炎症反应在肾脏病发生发展中具有重要作用，而mTOR一方面通过激活Akt启动NF-κB信号通路，另一方面通过激活IKK激酶，降解IκB从而激活NF-κB。同时NF-κB激活释放的炎症介质CRP、IL-6及TNF-α等能够激活mTOR，从而进一步加剧脂代谢紊乱。肝肾纤维化是糖尿病脂代谢紊乱介导肝肾损害的主要病理特征。众所周知TGF-β1/Smad3信号通路是肝肾纤维化的关键机制。TGF-β1通过促进Smad3转录入核从而促进胶原沉积。最新研究发现mTORC1在这一过程中扮演重要作用。雷帕霉素能够有效阻断Smad3引起的胶原沉积[18]和TGF-β1诱导的纤维化。此外，在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中，阻断mTOR能够显著降低肾脏TGF-β1表达，减少肾小球细胞外基质积聚，提示mTOR是其关键环节[19]。基于上述理论以及糖肾方有效改善肝肾炎症和纤维化的疗效特点，本团队提出科学假说：糖肾方改善糖尿病脂代谢紊乱防治肝肾损害的一个主要分子机制是通过调控mTOR信号通路，抑制NF-κB驱动的炎症反应和TGF-β1/Smad3通路介导的纤维化实现（图1）。

基础研究证实，糖肾方显著下调DN模型动物肾组织NF-κB p65磷酸化水平，减少单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和 IL-1β表达，显著降低模型大鼠肾组织TGF-b1/Smad3信号通路以及I型胶原和IV型胶原水平，上调db/db小鼠肾脏中过氧化物酶体增殖剂激活受体ɑ（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARɑ）及其辅助激活因子-1α（PPARγcoactivator-1α，PGC-1α）、肝X 受体（liver X-activated receptor，LXR）和ATP结合盒转运体A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）蛋白和mRNA水平，减少肾脏脂质沉积[20]。

糖肾方可显著上调db/db小鼠肝组织腺苷一磷酸激活蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）的磷酸化水平及抑制转录因子胆固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding protein 1，SREBP1）的表达及入核，从而显著下调其下游脂肪酸从头合成靶分子和胆固醇合成关键酶蛋白及基因水平；进一步发现，糖肾方可显著增加db/db小鼠肝组织PI3K/Akt蛋白水平和减少p-mTOR水平，提示糖肾方可一定程度改善肝组织胰岛素抵抗与mTOR介导的脂质沉积。从而系统揭示了糖肾方改善脂代谢紊乱肝肾同治的科学内涵[17]。

4 糖肾方化学成分分析与鉴定研究

为了进一步挖掘糖肾方的物质基础，团队利用化学物质组学方法建立了建立了糖肾方整体化学物质指纹图谱，运用现代色谱及色谱质谱联用技术对糖肾方进行了系统的化学成分研究，通过HPLC-DAD-TOFMS等色谱分析手段，结合相关文献，鉴定出糖肾方中的51个成分，主要为皂苷类、有机酸类、黄酮类等成分，各类成分在药材中的分布具体为：15个来源于山茱萸的有机酸及黄酮类成分、10个来源于三七的皂苷类成分、12个来源于鬼箭羽的黄酮类及有机酸类等成分、4个来源于枳壳的黄酮苷类成分、10个来源于黄芪的黄酮类及皂苷类成分。

5 讨论

具有“益气柔肝、活血通络”功效的糖肾方改善脂代谢保护肝肾功能的机制研究是中医基础理论、现代文献研究、临床RCT研究和分子生物学研究综合运用的成果，体现了“病-症-方-效-理”研究思路，实现了临床-实验室-临床的转化，为中医药现代化研究提供了良好示范。

目前西医对NAFLD和DN均采用综合治疗方法，都要求调整基本生活方式如合理饮食适当运动，减轻体重。该治疗措施对疾病早期有一定的疗效，可以延缓疾病的进展，然而，对中晚期病变，特别是脏器出现硬化和纤维化阶段尚无有效的治疗药物。同时，多种、大剂量药物的服用，给肝肾本身带来了极大的负担及损害。糖肾方的优势特色在于系统改善机体脂代谢紊乱，同时发挥保护肝肾功能的功效，而且副作用较小。

本团队已经从糖脂代谢紊乱、炎症和纤维化三个层面揭示了糖肾方。然而，糖肾方调控上述通路的具体分子靶点是什么？能否采用RNA-seq的方法，进一步挖掘糖肾方新的分子靶点以及上述三条通路之间发生联系的潜在分子。上述科学问题的解决将进一步阐明肾方肝肾同治的科学依据，丰富中医肝肾同源理论的科学内涵。