喜马拉雅紫茉莉总多糖和总黄酮的提取与含量测定＊

俞越童，李 健，曹光昭，陈慧荣，邹慧琴＊＊，闫永红＊＊

（1.北京中医药大学中药学院 北京 102488；2.北京天健晟峰医学科技发展有限公司 北京 100000）

喜马拉雅紫茉莉为紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica(Edgew.)Heim.的干燥根[1]，具有引黄水、益肾滋补、利尿排石等多种功效，常用于肾寒浮肿、下腹痛、腰及关节痛、膀胱结石、各种性病及一些病毒性感染疾病[4-5]。该藏药历史悠久，在多种藏医成药中为主要药味。目前，国内外研究发现喜马拉雅紫茉莉中含有黄酮，多糖，苯丙酸衍生物，类固醇，类胡萝卜素，有机酸，木质素等化合物[6-8]，一些学者对其中某些化学成分进行了含量测定，如：李兰茹等[9]以没食子酸为对照品，用福林酚比色法测定了喜马拉雅紫茉莉总多酚的含量；李健等[10]对喜马拉雅紫茉莉中总皂苷类成分的提取工艺进行了优选;索朗其美等[11]采用紫外分光光度法测定了总黄酮的含量。

现有文献报道喜马拉雅紫茉莉乙醇提取物对肿瘤细胞株A549和HCT8具有强生长抑制作用[12]，Li Xue等[13]又分离出6种新的类黄酮类化合物，研究发现其中一种化合物对癌细胞有细胞毒性，表明喜马拉雅紫茉莉中黄酮类为有效成分。近些年来发现多糖类成分具有抗病毒，抗肿瘤，降血糖，降血脂，抗衰老，免疫调节等功效[14]，但当前还没有关于喜马拉雅紫茉莉总多糖含量测定的报道，因此，本文采用单因素及正交试验法优选总多糖和总黄酮的最佳提取工艺，紫外分光光度法测定喜马拉雅紫茉莉中总多糖和总黄酮的含量，旨在为评价喜马拉雅紫茉莉的药材质量提供科学依据。

1 材料

1.1 药材与试剂

喜马拉雅紫茉莉（采于拉萨夺底沟山坡下，海拔3 600 m，经北京中医药大学生药鉴定系闫永红教授鉴定为紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica(Edgew.)Heim.的根），D-葡萄糖标准品（购于中国食品药品检定研究院），芦丁标准品（批号：100080-200707，购于中国食品药品检定研究院），乙醇，苯酚，浓硫酸，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等试剂均为分析纯，水为双蒸水。

1.2 仪器

U-3010紫外分光光度计（日本日立）；BP211D型1/100电子分析天平（德国赛多利斯）；HH-2型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）、RE52CS旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（上海振捷实验设备有限公司），KQ-500DE型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 喜马拉雅紫茉莉总多糖的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取D-葡萄糖标准品13.64 mg，至25 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成0.5456 mg/mL的标准品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

称取2.0 g喜马拉雅紫茉莉药材粉末（过2号筛），用80%乙醇50 mL于60℃水浴回流1 h，过滤，弃去滤液，滤渣用80 mL蒸馏水100℃水浴回流2小时，提取2次。合并提取液，挥干溶剂，用蒸馏水定容至25 mL。

2.1.3 苯酚-浓硫酸比色法测定喜马拉雅紫茉莉总多糖含量[15]

精密吸取1.0 mL样品至25 mL容量瓶中，蒸馏水定容，制成样品溶液。吸取0.2 mL样品溶液至具塞试管，加水至1 mL，加入5%苯酚1 mL，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，置冷水浴中降至室温后，置沸水浴加热15 min，再置于冷水浴中降至室温，随行做空白对照，于490 nm测吸光度。

2.2 总多糖的方法学考察

2.2.1 线性关系考察

精密吸取对照品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。精密吸取 0.00、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL稀释后的对照品溶液于具塞试管中，按3.1.3项下自“加水至1 mL”后同法测定吸光度。计算得出回归方程：A=63.215C+0.038（r=0.9985）。结果显示，在0.003-0.011 mg/mL范围内，线性关系良好。

2.2.2 重复性考察

取样品6份，按“3.1.2”项下制备供试品溶液，测定总多糖含量，结果RSD为1.217%，表明本法重现性良好。

2.2.3 精密度考察

取供试品溶液，连续测定6次，测定吸光度，结果RSD为0.171%，表明本法精密度良好。

2.2.4 稳定性考察

取一份样品，按“3.1.2”项下制成供试品溶液，分别于0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h测定总多糖含量，结果RSD为1.972%。说明样品吸光度在8 h内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率考察

精密称取已知总多糖含量为5.305%的喜马拉雅紫茉莉药材粉末6份，加入5 mg的D-葡萄糖标准品，按“3.1.2”项下制备供试品溶液，测定总多糖含量，计算回收率，结果平均加样回收率为99.393%，RSD为3.716%。

2.3 总多糖单因素试验考察

本实验分别考察了提取溶剂体积、提取温度、提取时间、提取次数对总多糖提取率的影响，选出单因素下的最优条件，为下一步正交试验奠定基础。

2.3.1 样品预处理

称取样品粉末2 g（过二号筛），用80%乙醇50 mL于60℃水浴回流1 h，过滤，取滤渣备用。

2.3.1 提取溶剂体积对总多糖的收率影响

按“3.3.1”项下处理样品，恒定提取次数2次，提取时间1.5 h，提取温度80℃，分别选取溶剂体积40 ml、60 ml、80 ml、100 mL提取滤渣，结果总多糖收率分别为6.858%、8.674%、11.867%、10.399%。结果表明溶剂体积80 ml时，总多糖收率最高，故选择溶剂体积为80 ml。

2.3.2 提取温度对总多糖提取率的影响

按“3.3.1”项下处理样品，恒定固液比（g：mL）1∶40，提取次数2次，提取时间1.5 h，分别在40℃、60℃、80℃、100℃下提取滤渣，结果总多糖收率依次为5.144%、5.959%、9.413%、11.280%。结果表明，总多糖收率在100℃时最高，故选择100℃为提取温度。

2.3.3 提取时间对总多糖提取率的影响

按“3.3.1”项下处理样品，恒定固液比（g：mL）1∶40，提取次数2次，提取温度100℃，依次考察提取时间0.5 h，1 h，2 h，3 h下总多糖收率，结果为5.013%、8.979%、8.446%、7.986%。结果表明，总多糖提取率在提取1 h时达到峰值，延长提取时间反而有下降趋势，故选择每次提取时间为1 h。

2.3.4 提取次数对总多糖提取率的影响

按“3.3.1”项下处理样品，恒定固液比（g：mL）1∶40，提取时间1 h，提取温度100℃，考察提取次数为1次、2次、3次、4次下总多糖收率，结果依次为6.060%、13.329%、11.075%、8.735%。结果表明，总多糖提取率在提取2次时达到峰值，故选择提取2次。

2.4 正交试验考察

通过单因素试验，最后固定提取次数2次，确定三因素三水平：提取温度A（80℃、90℃、100℃），提取时间B（1 h、1.5 h、2 h）和溶剂体积 C（60 mL、80 mL、100 mL）。采用L9(34)正交表考察最佳工艺条件，正交实验实验结果见表1，方差分析见表2。

由表1可知，各因素对总多糖收率的影响顺序为提取温度＞提取时间＞溶剂体积，提取工艺为A3B3C2时总皂苷的含量最高，为13.769，表2的方差分析结果表明提取温度对总多糖收率影响显著，其他因素无显著影响，所以，最佳工艺组合为A3B3C2，即提取温度100℃、每次提取2小时、溶剂体积为80 mL。测得总多糖含量为13.769%。

2.5 喜马拉雅紫茉莉总黄酮的含量测定

2.5.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品12.43 mg，至25 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成0.4971 mg/mL的标准品溶液。

2.5.2 供试品溶液的制备

称取1.0 g喜马拉雅紫茉莉药材粉末(过4号筛)，用60%乙醇20 mL超声提取30 min，过滤取续滤液，即得。

2.5.3 亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定喜马拉雅紫茉莉总黄酮显色方法

精密吸取1.0 mL样品溶液至25 ml容量瓶中，加水5 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，6 min后加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，6 min后加入10%NaOH溶液5 mL，蒸馏水定容，随行做空白对照，10 min后于510 nm测吸光度。

2.6 总黄酮的方法学考察

2.6.1 线性关系考察

精密吸取0.00、1.00、1.40、1.80、2.20、2.60、3.00 mL对照品溶液于25 mL容量瓶中，按“3.5.3”项下“自加水5 mL”后同法测定吸光度。计算得出回归方程：A=13.303C-0.007(r=0.9995)。结果显示，在 0.020-0.060mg⋅mL-1范围内，线性关系良好。

表1 喜马拉雅紫茉莉总多糖提取工艺正交试验结果

表2 喜马拉雅紫茉莉总多糖方差分析

2.6.2 重复性考察

取样品6份，按“3.5.2”项下制备供试品溶液，测定总黄酮含量，结果RSD为1.009%，表明本法重现性良好。

2.6.3 精密度考察

取供试品溶液，连续测定6次，测定吸光度，结果RSD为0.126%，表明本法精密度良好。

2.6.4 稳定性考察

取一份样品，按“3.5.2”项下制备供试品溶液，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h测定总黄酮含量，结果RSD为1.635%。说明样品吸光度在12 h内稳定性良好。

2.6.5 加样回收率考察

精密称取已知总皂苷含量为3.522%的喜马拉雅紫茉莉药材6份，加入3.5 mg的芦丁标准品，按“3.5.2”项下制备供试品溶液，测定总黄酮含量，计算回收率，结果平均加样回收率为99.047%，RSD为2.656%。

表3 喜马拉雅紫茉莉总黄酮提取工艺正交试验结果

表4 喜马拉雅紫茉莉总黄酮方差分析

2.7 总黄酮单因素试验的考察

本实验考察了提取溶剂浓度、提取溶剂体积、提取时间对总黄酮提取率的影响，选出单因素下的最优条件，为下一步正交试验奠定基础。

2.7.1 提取溶剂浓度对总黄酮收率的影响

称取样品粉末1 g（过2号筛）5份，恒定溶剂体积为20倍量，分别用40%、50%、60%、75%、90%乙醇超声提取30 min，计算总黄酮收率，结果分别为1.256%、1.456%、1.333%、1.239%、1.073%。结果表明，总黄酮收率在提取乙醇浓度为50%时达到峰值，故选择50%乙醇为提取溶剂。

2.7.2 提取溶剂体积对总黄酮收率的影响

称取样品粉末1 g（过2号筛）5份，分别用10 mL、20 mL、30 mL、40 mL的50%乙醇进行超声提取30 min，结果总黄酮收率分别为1.248%、1.345%、1.296%、1.278%。结果表明，总黄酮收率在提取乙醇体积为20 mL时达到峰值，故选择提取溶剂体积为20 mL。

2.7.3 提取时间对总黄酮收率的影响

称取样品粉末1 g（过2号筛）5份，用50%乙醇20 mL，分别超声提取30、60、90、120 min，计算总黄酮收率，结果分别为1.422%、1.460%、1.401%、1.328%。

结果表明，总黄酮收率在提取时间为60 min时达到峰值，故选择提取时间为60 min。

2.8 总黄酮正交试验考察

综合单因素试验结果，固定溶剂体积为20 ml，确定三因素三水平：乙醇浓度A（40%、50%、60%），提取时间B（30 min、45 min、60 min），样品粒度C（2号筛、3号筛、4号筛）。采用L9(34)正交表考察最佳提取工艺。正交实验实验结果见表3，方差分析见表4。

由表3可知，各因素对总黄酮收率的影响顺序为样品粒度＞乙醇溶度＞提取时间，表4的方差分析结果表明三个因素对总黄酮收率影响均无显著性差异。因此，出于提高收率和节省时间两方面考虑，选择最佳工艺组合为A3B1C3，即提取乙醇浓度60%，提取时间30 min，样品粉碎过4号筛。测得总黄酮含量为2.048%。

3 讨论

本实验采用水浴回流方法提取经80%乙醇提取过的喜马拉雅紫茉莉粉末滤渣，苯酚-浓硫酸比色法测定总多糖含量，优选出最佳提取工艺为40倍量蒸馏水，100℃热回流2小时，提取两次。此方法测定喜马拉雅紫茉莉总多糖含量简便易行，结果稳定可靠，优选出的提取工艺稳定可行。已有文献报道采用乙醇超声提取总黄酮，优选出最佳工艺为45%乙醇、料液比1∶25、每次提取55 min、提取3次[16]，本实验固定提取次数2次，考察了样品粒度，溶剂浓度，提取时间对总黄酮含量的影响，优选出最佳提取工艺为样品粉碎过4号筛、加入20倍量60%乙醇超声提取30 min。缩小了粉末的粒度，使黄酮类成分更容易溶出，缩短了提取时间，方法简便易行，节省成本，省时省力。

本文建立了喜马拉雅紫茉莉总多糖和总黄酮的含量测定方法和提取工艺，为喜马拉雅紫茉莉药材的进一步开发，使用提供可参考的质量标准。