牛磺酸通过调控miR-126对高糖诱导的大鼠内皮细胞凋亡的影响及其作用机制＊

谢雯雯，何志凌，招煦杰，罗 锐

（广州中医药大学第二临床医学院 广州 510000）

全球糖尿病发病率不断上升，中国有超过1.5 亿的糖尿病患者[1]。 糖尿病是由高血糖引起的慢性疾病，临床表现为高血糖,可出现多尿、多饮、多食、消瘦，即三多一少症状。糖尿病可分为1 型和2 型糖尿病，1型糖尿病主要是由β细胞破坏和胰岛素绝对缺乏引起的自身免疫性疾病，2 型糖尿病主要是胰岛素抵抗，伴随摄入过多糖分而导致胰岛素分泌不足[2-3]。血管内皮细胞是被覆于血管内膜的一群细胞，代谢活跃且可合成及分泌大量的血管活性物质，对维持血管正常生理功能具有重要作用[4-5]。糖尿病并发症与血管内皮功能损伤有关。糖尿病是全球性的重大公共卫生问题，严重威胁人类健康，因此，亟待研究糖尿病的致病机理，寻找更有效的治疗策略。牛磺酸又名牛胆酸、牛胆碱、牛胆素，是中药牛黄的活性成分。牛磺酸具有防止心血管病的作用，在循环系统中可抑制血小板凝集，降低血脂，保持人体正常血压和防止动脉硬化；对心肌细胞有保护作用，对降低血液中胆固醇含量有明显作用[6-8]。牛磺酸可显著降低糖尿病大鼠的血糖水平，减轻胰岛素抵抗，改善功能失调的神经传导[9]。miRNA 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。有研究表明，miRNA 在血管内皮细胞中有一定程度的表达，且对细胞的生长修复起到极其重要的调节作用[10-11]。miR-126 表达水平降低参与了胰岛素抵抗及2 型糖尿病的发生和发展[12]。miR-126 表达降低与妊娠期糖尿病患者的胰岛素抵抗相关[13]。1 型糖尿病患者血浆中miR-126 呈低表达，miR-126 参与了1 型糖尿病患者的炎症反应及脂质代谢异常，且其水平随年龄增长而下降[14]。过表达miR-126 可促进高糖诱导的人视网膜内皮细胞HREC 增殖，并抑制其凋亡[15]。尽管已有研究发现牛磺酸、miR-126 对糖尿病具有一定缓解作用，但牛磺酸是否可通过调控miR-126 表达缓解糖尿病细胞损伤还尚未可知。研究表明，急、慢性的高糖状态可抑制血管内皮细胞生长，并诱发内皮细胞的凋亡，从而加重血管内皮损伤[16-17]。本实验主要探讨牛磺酸通过调控miR-126对高糖诱导的大鼠内皮细胞凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

牛磺酸购自Sigma 公司；大鼠胸主动脉内皮细胞购自美国ATCC 细胞库；细胞培养DMEM 培养基购自HyClone 公司；miR-126 模拟物和抑制物购自北京华大基因公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）购自南京凯基公司；膜联蛋白V（Annexin-V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒购自美国Cell signaling technology 公司；Cleaved-caspase3、Procaspase3一抗及二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。逆转录试剂盒、SYBR Green master mix 购自北京宝日医生物技术公司。二氧化碳培养箱购自美国Thermo 公司；ABI7500 荧光定量 PCR 仪购自美国 ABI公司；酶标仪购自德国Eppendorf 公司；BG-sub MIDI型多用途水平电泳仪购自美国Baygene公司。

1.2 细胞培养和实验分组

大鼠胸主动脉内皮细胞在DMEM 培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素）和细胞培养箱（37℃、5%CO2）中培养和传代。待细胞贴壁生长至约80%融合时，更换培养基对细胞做12 h 的饥饿处理（培养液中的血清浓度从10%降到无血清或2%，使培养液因缺乏血清中的生长因子而不能使细胞分裂），之后加药干预。细胞分组和处理如下：NC 组（用5.5 mmol·L-1葡萄糖培养基培养）、HG 组（用含30.0 mmol·L-1葡萄糖培养基培养24 h）、HG+低浓度牛磺酸组、HG+中浓度牛磺酸组和HG+高浓度牛磺酸组（分别用含5.0、10.0、20.0 μmol·L-1牛磺酸和含30.0 mmol·L-1葡萄糖的培养基培养24 h）。miR-NC+HG 组、miR-126+HG 组、anti-miR-NC+HG 组、anti-miR-126+HG 组分别将 miR-NC、miR-126 mimics、anti-miR-NC、antimiR-126 转染至大鼠胸主动脉内皮细胞（用含30.0 mmol·L-1葡萄糖培养基转染细胞24 h）；牛磺酸+antimiR-NC+HG 组、牛磺酸+anti-miR-126+HG 组分别将anti-miR-NC、anti-miR-126 转染大鼠胸主动脉内皮细胞（用含30.0 mmol·L-1葡萄糖和20.0 μmol·L-1牛磺酸培养液转染细胞24 h）。

1.3 CCK-8法检测细胞活力

将各组细胞培养24 h 后，每组取100 μL 密度为5×103/mL 的大鼠胸主动脉内皮细胞，每孔加入10 μL的CCK-8 溶液，二氧化碳培养箱孵育2 h 后。用酶标仪测定各孔在450 nm 处吸光度（A）值，各实验组设置3 个复孔，细胞活性( %) =（A对照组-A实验组）)/ A对照组×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

取各组大鼠胸主动脉内皮细胞加入预冷PBS 洗涤，4 ℃条件下经3000 r·min-1离心6 min，弃上清，收集细胞沉淀，向细胞沉淀中加入500 μL 结合缓冲液，加入 5 μL Annexin V-FITC 与 5 μL PI，室温振荡孵育 10 min，应用 FACS Calibur 流式细胞仪及应用 Cellauest 软件检测各组细胞凋亡率。

1.5 RT-qPCR检测miR-126的表达水平

各组细胞培养48 h，提取总RNA，使用逆转录试剂盒降RNA 合成cDNA，按照SYBR Green master mix试剂盒说明进行PCR，反应条件为95℃2 min，95℃15 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共 40 个循环。相对表达量用2-△△Ct法计算。miR-126分别U6为内参，miR-126上游引物：5’-TACTTTTGGTACGCGCTGTG-3’，下游引物：5’-GCTAGCTACGATCACACTACG-3’；U6 上游引物：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.6 Western blot 检测 Cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白表达

各组大鼠胸主动脉内皮细胞中加入400 μL RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，采用BCA 法检测蛋白浓度，蛋白变性，采用SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转膜、封闭2 h，分别孵育一抗稀释液（稀释比1:1000，条件：4℃孵育24 h）与二抗稀释液（稀释比1:2000，条件：室温孵育1 h），滴加ECL，暗室内曝光显影，应用ImageJ 软件分析各条带灰度值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0 进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞活性的影响

由表1可知，与NC组比较，HG组大鼠胸主动脉内皮细胞活性显著降低（P＜0.05）；与HG 组比较，HG+低浓度牛磺酸组、HG+中浓度牛磺酸组、HG+高浓度牛磺酸组大鼠胸主动脉内皮细胞活性显著升高（P＜0.05）。

表1 牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞活性的影响（，n=9）

表1 牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞活性的影响（，n=9）

注：与NC比较，*P＜0.05；与HG比较，#P＜0.05。

吸光度（A）值0.982±0.08 0.387±0.03*0.632±0.06#0.766±0.07#0.856±0.08#组别NC HG HG+低浓度牛磺酸组HG+中浓度牛磺酸组HG+高浓度牛磺酸组药物浓度5.0 μmol·L-1 10.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1细胞活性99.88±10.65 36.58±3.68*68.96±5.58#76.98±6.31#85.62±8.80#

2.2 牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡的影响

由表 2 和图 1、2 可知，与 NC 组比较，HG 组大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达显著上升，Pro-caspase3 蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与HG 组比较，HG+低浓度牛磺酸组、HG+中浓度牛磺酸组、HG+高浓度牛磺酸组大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达显著降低，Pro-caspase3蛋白表达显著升高（P＜0.05）。

表2 牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡的影响（，n=9）

注：与NC比较，*P＜0.05；与HG比较，#P＜0.05。

Pro-caspase3 蛋白0.89±0.09 0.29±0.02*0.41±0.04#0.53±0.05#0.67±0.07#组别NC HG HG+低浓度牛磺酸组HG+中浓度牛磺酸组HG+高浓度牛磺酸组药物浓度5.0 μmol·L-1 10.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1凋亡率（%）7.44±0.69 35.61±5.80*20.37±2.89#13.85±1.94#10.69±1.07#Cleaved-caspase3 蛋白0.25±0.03 0.85±0.08*0.66±0.06#0.51±0.05#0.43±0.04#

图1 牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡的影响凋亡图

2.3 牛磺酸对miR-126表达的影响

由表3可知，与NC组比较，HG组大鼠胸主动脉内皮细胞中miR-126 表达显著降低（P＜0.05）；与HG 组比较，HG+低浓度牛磺酸组、HG+中浓度牛磺酸组、HG+高浓度牛磺酸组大鼠胸主动脉内皮细胞中miR-126表达显著升高（P＜0.05）。

表3 牛磺酸对miR-126表达的影响（，n=9）

表3 牛磺酸对miR-126表达的影响（，n=9）

注：与NC比较，*P＜0.05；与HG比较，#P＜0.05。

miR-126表达水平1.01±0.09 0.36±0.03*0.64±0.06#0.77±0.07#0.86±0.08#组别NC HG HG+低浓度牛磺酸组HG+中浓度牛磺酸组HG+高浓度牛磺酸组药物浓度5.0 μmol·L-1 10.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1

2.4 过表达miR-126对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞活性、凋亡的影响

图2 牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡的影响蛋白图

由表 4 和图 3 可知，与 HG+miR-NC 组比较，HG+miR-126组大鼠胸主动脉内皮细胞中miR-126表达显著升高，细胞活性、Pro-caspase3 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；凋亡率、Cleaved-caspase3 蛋白表达显著降低（P＜0.05）。

表4 过表达miR-126对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞活性、凋亡的影响（，n=9）

表4 过表达miR-126对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞活性、凋亡的影响（，n=9）

注：与HG+miR-NC比较，*P＜0.05。

Pro-caspase3蛋白0.30±0.03 0.88±0.08*108.643 0.000组别HG+miR-NC HG+miR-126 t P miR-126表达水平1.00±0.10 2.29±0.18*98.324 0.000细胞活性（%）34.61±2.81 81.07±7.20*112.084 0.000吸光度（A）值0.392±0.03 0.841±0.09*101.965 0.000凋亡率（%）37.51±4.22 11.39±1.25*85.641 0.000 Cleaved-caspase3蛋白0.91±0.09 0.45±0.04*82.014 0.000

图3 过表达miR-126对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡相关蛋白表达的影响

2.5 低表达miR-126可以逆转牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞活性、凋亡影响

由表5 和图4 可知，与HG+牛磺酸组和HG+牛磺酸+ anti-miR-NC 组比较，HG+牛磺酸+ anti-miR-126组大鼠胸主动脉内皮细胞中miR-126 表达显著降低，细胞活性、Pro-caspase3 蛋白表达显著降低，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达显著升高（P＜0.05）。

图4 低表达miR-126 可以逆转牛磺酸对HG 处理的大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡相关蛋白表达的影响

表5 低表达miR-126可以逆转牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞活性、凋亡的影响（，n=9）

表5 低表达miR-126可以逆转牛磺酸对HG处理的大鼠胸主动脉内皮细胞活性、凋亡的影响（，n=9）

注：与HG+牛磺酸比较，*P＜0.05；与anti-miR-NC+HG+牛磺酸，#P＜0.05。

Pro-caspase3蛋白0.89±0.09 0.88±0.08 0.31±0.04*#组别HG+牛磺酸HG+牛磺酸+anti-miR-NC HG+牛磺酸+anti-miR-126药物浓度20.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1 20.0 μmol·L-1 miR-126表达水平1.03±0.10 0.99±0.09 0.37±0.03*#细胞活性（%）85.21±9.20 84.28±5.55 34.28±2.16*#吸光度（A）值0.851±0.08 0.388±0.03 0.393±0.04*#凋亡率（%）10.62±0.82 11.29±1.00 36.54±3.85*#Cleaved-caspase3蛋白0.42±0.04 0.43±0.03 0.89±0.08*#

3 讨论

牛磺酸具有多种生理活性。研究表明，牛磺酸可缓解多种细胞损伤。如牛磺酸可通过调控Keap1-Nrf2 通路关键基因的表达和抑制氧化应激来减轻棕榈酸诱导的胰岛素抵抗细胞模型损伤[18]。牛磺酸可通过抑制内质网应激活化显著改善胡萝卜素诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 损伤[19]。牛磺酸预处理可显著降低脂多糖引起的奶牛肝脏原代细胞BHEC炎症反应[20]。牛磺酸处理对百草枯诱导的帕金森小鼠模型损伤具有缓解作用[21]。牛磺酸可抑制白介素诱导的大鼠椎间盘退变模型髓核细胞的凋亡、炎症和氧化应激[22]。糖尿病的病理机制非常复杂，受高血压、非酶糖化、血脂异常、肾血流动力学改变、氧化应激和细胞因子等多种因素影响[23]。糖尿病发病时糖脂代谢紊乱，血管紧张素Ⅱ释放增加，均可刺激活性氧产生而损伤血管内膜，引起内皮细胞凋亡，进而促进血管病变的发生[24-25]。牛磺酸不仅参与维持机体内环境的稳态，而且对多种组织细胞有明显的保护作用。研究显示，牛磺酸能预防高糖诱导的内皮细胞凋亡，其抗凋亡效应与降低细胞内活性氧簇和稳定细胞内钙水平相关[26]。miRNAs 广泛参与了机体多种生理病理过程的调控，miRNAs已成为生命科学研究领域的热点[27-28]。

细胞凋亡是程序性细胞死亡，是为维持内环境稳定由基因控制的细胞自主死亡。Caspase 蛋白家族广泛存在于细胞质中，参与调控细胞凋亡过程，Caspase 3 的激活标志着细胞凋亡进入不可逆阶段[29]。本实验研究发现，高糖诱导的大鼠胸主动脉内皮细胞活性显著降低；但牛磺酸显著升高高糖诱导组大鼠胸主动脉内皮细胞活性。高糖诱导的大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡率、Cleaved-caspase3 蛋白表达显著上升，Procaspase3 蛋白表达显著降低；但牛磺酸显著降低糖诱导的大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达，显著升高Pro-caspase3 蛋白表达。说明，牛磺酸提高高糖诱导的大鼠内皮细胞活性，并促进凋亡。有类似的研究表明，牛磺酸能抑制内皮细胞氧化应激，减少细胞凋亡，对防治糖尿病并发血管疾病具有重要临床意义[30]。梁栋等[31]研究表明，牛磺酸通过激活PI3K/Akt 信号通路抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡。

本研究发现，高糖诱导的大鼠胸主动脉内皮细胞中miR-126 表达显著降低；但牛磺酸显著升高大鼠胸主动脉内皮细胞中miR-126 表达。说明，牛磺酸提升了高糖诱导的大鼠内皮细胞miR-126 表达。有类似研究发现，miR-96-5p 在高糖诱导的脉络膜视网膜内皮细胞应激中表达显著下调[32]。miR-126 可通过NF-κB 信号通路减轻脓毒症大鼠脑损伤[33]。miR-126 通过促进归巢和维持晚期生长内皮祖细胞的干性来缓解血管损伤[34]。外泌体来源的miR-126可降低急性心肌梗塞缺血/再灌注损伤引起的氧化应激和凋亡[35]。miR-126-3p 在小鼠纤维化肾脏和心脏组织中下调，miR-126-3p 过表达可抑制内皮细胞向间充质细胞转化[36]。

本实验研究显示，HG+miR-126 组大鼠胸主动脉内皮细胞中miR-126 表达显著升高，细胞活性、Procaspase3 蛋白表达显著升高；凋亡率、Cleavedcaspase3 蛋白表达显著降低。HG+牛磺酸+anti-miR-126 组大鼠胸主动脉内皮细胞中miR-126 表达显著降低，细胞活性、Pro-caspase3 蛋白表达显著降低，凋亡率、Cleaved-caspase3 蛋白表达显著升高。说明，牛磺酸通过上调miR-126 表达促进高糖诱导的大鼠内皮细胞凋亡。

综上所述，牛磺酸通过上调miR-126 抑制了高糖诱导的大鼠内皮细胞凋亡，为治疗糖尿病提供了理论依据。本论文的创新点主要在中药通过调控非编码RNA的表达来促进细胞凋亡，抑制增殖。