基于肠道菌群探讨补脾益肾方改善5/6肾切除大鼠肠道屏障延缓慢性肾脏病进展的作用机制

莫业南 ，李 茵 ，揭西娜 ，王立新 ，吉春兰 ，卢钊宇 ＊＊，刘旭生 ＊＊

（1. 南方医科大学中西医结合医院 广州 510515；2. 广东省中医院 广州 510120；3. 广州中医药大学第二临床医学院 广州 510006）

慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）是指存在三个月或者更长时间的肾脏损害或肾功能下降，最终发展至终末期肾脏病而需要透析或肾脏移植。在2017年，CKD的全球患病率为9.1%，较1990年增长了29.3%，已成为全球重大公共卫生健康问题之一[1]，由此可见，当前我们迫切需要延缓CKD 进展的有效方法。在西医治疗中晚期CKD 方面，ACEI/ARB 因可能引起急性肾功能减退、高钾血症等不良反应而无法使用，而其他对症治疗如控制血压、纠正贫血、改善营养不良等措施对延缓CKD 进展疗效有限。近年来，越来越多的证据表明中药对CKD 患者[2-4]和CKD 动物[1-3]有益。广东省中医院肾内科刘旭生教授梳理了全国30家中医肾病重点专科方案，结合专科多年临床实践以及全国名老中医的经验传承，提出CKD 的核心病机为脾肾气虚为本，水湿瘀阻为标，脾肾气虚贯穿CKD 始终，确定了补脾益肾法，形成具有岭南特色的补脾益肾方（Bupi Yishen Formula, BYF）[4-5]。方中黄芪、菟丝子为君，补脾气、温脾阳；臣药有党参、白术、茯苓、山药、首乌，助黄芪健脾益气、协菟丝子固精益肾；佐以丹参活血通络，祛瘀水之结；薏苡仁补脾以化湿、化湿以健脾；整方呈现补脾益肾、活血利湿之效。随后在全国23 家三甲医院肾病专科开展多中心随机对照研究以评估补脾益肾方治疗CKD4期的疗效，结果表明，补脾益肾方延缓慢性肾脏病4期进展疗效优于阳性药氯沙坦且在不良反应方面无明显差异[6-7]，提示补脾益肾方治疗CKD4期疗效确切、安全可控。但是，补脾益肾方改善肾功能，延缓CKD 进展的分子作用机制尚不清晰，阻碍了补脾益肾方在临床上的进一步应用。

近年随着肠道菌群和全身疾病关系研究的深入，尤其从2011 年肠肾轴被提出以来[8]，研究肠道微生态和慢性肾脏病之间的关系也逐渐成为焦点。肠道功能障碍是CKD 常见的并发症之一，临床上常表现为厌食、呕吐、便秘、肠道粘膜出血糜烂等；并引起肠道菌群失调，导致肠道屏障受损[9]，内毒素和细菌代谢物易位至循环系统，引起尿毒症毒素积蓄、炎症、CKD 进展和心血管疾病[10]。肠道功能障碍的特点是肠道通透性异常增加，这是肠道屏障受损的指标[11]。已有研究发现5/6 肾切除小鼠模型中，CKD 进程伴随着血液中硫酸吲哚酚的积累，硫酸吲哚酚可抑制上皮细胞的跨膜电阻和紧密连接相关基因的表达[12]。由此可见，基于“肠肾轴”理论探索补脾益肾方延缓CKD 进展的机制，具有良好的理论和实践基础。《补脾益肾颗粒通过调整肠道微生态影响芳烃受体AHR 通路治疗慢性肾脏病的机制研究》为刘旭生教授在2018年获得国家自然科学基金面上项目资助，探索肠道菌群的调整以及肠道屏障的变化是其中的关键部分。

因此，本研究以肠道菌群和肠道屏障为切入点，以5/6 肾切除大鼠构建CKD 动物模型，观察补脾益肾方对CKD 大鼠肠道菌群的调节作用以及对肠道粘膜屏障功能的影响，进一步探讨补脾益肾方延缓5/6 肾切除大鼠肾功能减退的可能机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级雄性 Sprague Dawley 大鼠，8 周龄，体质量范围在180-220 g，从南方医科大学动物实验中心购入。质量合格证号：440021000019963，在广东省中医药科学院动物实验中心进行饲养，12 h 明/12 h 暗周期，环境温度为20±2℃，相对湿度为50±5%，大鼠可自由摄食饮水。适应性喂养时间为1周，随后开始实验。广东省中医院动物实验伦理委员会已通过本实验的伦理审核（动物伦理批号：2019026）。

1.2 药物与试剂

补脾益肾方由黄芪、党参、菟丝子、白术、茯苓、山药、薏苡仁、何首乌、丹参等组成，购自康美药业。中药浸膏按以下方法进行制备：每次取上述饮片共1550 g 生药混合后，加入纯水（1:8（w/v））浸泡30 min，煮沸后煎煮1 h，共煎煮3 次；滤去药渣，将滤液合并后置于旋转蒸发仪中进行浓缩至500 mL 为补脾益肾方高剂量药液（含生药浓度为3.1 g·mL-1），冷却后密封冷藏保存备用。待使用时在补脾益肾方高剂量药液中加入等量纯水搅拌稀释为补脾益肾方低剂量溶液（含生药浓度为1.55 g·mL-1）。

1.3 动物分组、模型构建及药物干预

利用Excel 软件产生随机数字表，随机从40 只大鼠中抽取10 只作为假手术组（Sham 组），余30 只大鼠则行5/6 肾切除手术以构建CKD 模型：先采用腹腔注射2.0%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）对大鼠进行麻醉，备皮、消毒，于脊柱旁开1.5 cm、左肋骨下缘处做一纵向切口，使左侧肾脏充分暴露，剥离肾包膜及肾上腺，动脉夹夹闭左侧肾蒂，切除左肾上、下极2/3 肾实质，创面止血并确认无出血后，将残余肾组织还纳入腹腔，逐层缝合。一周后行右肾切除术，麻醉及手术过程与前相同，由此构建5/6肾切除CKD大鼠模型。4周后通过眼眶采血进行检测血肌酐和尿素氮，来评估是否造模成功。根据血肌酐水平将成功造模的5/6 肾切除大鼠随机分成3 组：补脾益肾方高剂量组（H-BYF 组）、补脾益肾方低剂量组（L-BYF 组）和模型对照组（5/6Nx 组），每组各 10 只。H-BYF 组和 L-BYF 组大鼠分别给予补脾益肾方高剂量药液和低剂量药液灌胃；假手术组和5/6 肾切除模型组分别予蒸馏水灌胃；一次灌胃量为1 mL/100 g体重，每天1次，连续4周。

1.4 标本采集

干预过程中，每周称重以及记录大鼠的一般情况。干预结束前收集大鼠24 h 尿液和粪便；干预结束后行腹主动脉采血，血液标本经离心机3000 rpm，15 min 离心后留取血清标本，以上尿液、粪便及血清标本储存在-80℃冰箱中备检；肾脏及结肠组织分为两部分标本，一部分置入4%甲醛溶液固定以作病理组织切片，另一部分放入冻存管后置入液氮中，再转移在-80℃冰箱中以行western-blot。

1.5 生化检测与酶联免疫吸附（ELISA）检测

使用罗氏Cobas C702 全自动生化分析仪检测大鼠血肌酐（SCR）、尿素氮（BUN）、血白蛋白（ALB）。尿蛋白通过使用BCA（Bicinchoninic acid）蛋白浓度测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）检测。根据大鼠硫酸吲哚酚 ELISA 试剂盒（Creative Diagnostics）说明书检测血清硫酸吲哚酚水平。根据大鼠二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）ELISA 试剂盒（华美）说明书测量血清DAO水平。

1.6 肾脏及肠道病理损伤的检测

肾脏及肠道组织标本在4%甲醛溶液浸泡固定24 h后修剪规整，随后进行脱水、包埋、切片，切片厚度为3um。切片先进行65℃烘烤2 h，再将切片依次进行脱蜡、复水、染色，肾脏行PAS/Masson 染色（南京建成）观察肾小管间质纤维化情况；结肠组织行HE 染色（博士德）观察结肠粘膜上皮层结构，最后行透明、封片等步骤。

1.7 Western-blot评估肠道屏障功能

将蛋白酶抑制剂（碧云天）、磷酸酶抑制剂（碧云天）和蛋白酶抑制剂（碧云天）加入到RIPA 裂解液（Thermo Fisher Scientific），取结肠组织放入上述混合液中进行裂解后离心，通过BCA 蛋白试剂盒（Thermo Fisher Scientific）检测上清液的蛋白浓度。取50g 蛋白质样品与SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（CST）混合变性后再电泳，并通过Bio-Rad快速转印系统转印到PVDF膜（Millipore）上。膜在5%脱脂奶粉中封闭2 h，后予ZO-抗体（1:1000，abcam），Occludin（1:1000，abcam），Claudin-1（1:500，abcam），IL-22（1:1000，abcam）或βactin（1:2000,CST）在4℃过夜，次日复温后予TBST 洗涤3 次后在室温下使用辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG 抗体（1:3000,CST）孵育1.5h。继续予TBST 洗涤3次，加入ECL 化学发光液（Millipore），利用Bio-Rad 凝胶成像仪对信号进行捕获和分析。

1.8 肠道菌群分析

由华大基因公司对粪便标本进行处理，大鼠粪便DNA 的提取通过使用QIAGEN 粪便基因组DNA 提取试剂盒来完成，并进行DNA扩增和鉴定。DNA文库构建完成后，通过Illumina HiSeq/MiSeq 16S rDNA测序平台使用二代测序法进行测序，获得原始测序数据，对数据进行质量控制、组装、滤除低质量序列，得到高质量有效数据用于后续分析。为了探索粪便样品的物种组成多样性，对所有有效数据进行归类操作分析，将相似度在97%以上的序列聚类为操作分类单元（Operational Taxonomic Units, OTUs）。得到OUT 序列后，通过BLCA 软件比对注释数据库NCBI 对OTUs 的代表序列进行物种注释，得到相对应的物种信息及其丰度分布情况。基于门的水平分析差异菌群的相对丰度，以物种丰度柱状图呈现；行α-多样性分析以评估物种多样性；行β-多样性以评估物种丰富度。根据OTUs的物种注释结果，采用Lefse方法进行组间比较，分析微生物的组间差异，利用条形图显示LDA score＞2的物种为显著差异物种。

1.9 统计学分析

数据统计分析工具为SPSS19.0 软件。计量资料采用均数±标准误表示。分析时首先进行正态性检验，满足正态分布者采用单因素方差分析比较均值，单因素方差有统计学意义时则进行均值两两比较；不满足正态分布则应用Kruskal-Wallis 非参数检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 补脾益肾方有助于改善CKD相关指标

5/6Nx 组的血肌酐、尿素氮和24 h 蛋白尿及血清硫酸吲哚酚水平显著高于Sham 组，H-BYF 组大鼠的上述指标均明显下降（表1）。蛋白尿方面，与Sham 组大鼠相比，5/6Nx 组大鼠的24 h 蛋白尿有明显升高（151.3±14.0 vs 448.8±50.4，P=0.003）；与 5/6Nx 组 比较，H-BYF 组的24h 蛋白尿定量明显下降（448.8±50.4 vs 239.7±22.2，P=0.028）。血肌酐方面，与 Sham 组大鼠相比，5/6Nx组大鼠的血肌酐水平有明显升高（31.1±0.7 vs 66.8±5.6，P＜0.001）；与5/6Nx 组比较，H-BYF 组的血肌酐水平明显下降（66.8±5.6 vs 51.3±1.5，P=0.007）。血尿素氮方面，与Sham 组大鼠相比，5/6Nx组大鼠的尿素氮水平有明显升高（5.3±0.2 vs 10.1±0.6，P＜0.001）。与 5/6Nx 组比较，H-BYF 组的尿素氮水平明显下降（10.1±0.6 vs 7.5±0.3，P=0.002）。硫酸吲哚酚方面，与Sham 组大鼠相比，5/6Nx 组大鼠的硫酸吲哚酚水平有明显升高（5.8±0.6 vs 18.8±0.9，P＜0.001）。与5/6Nx 组比较，H-BYF 组的硫酸吲哚酚水平明显下降（18.8±0.9 vs 9.0±1.0，P＜0.001）

表1 各组大鼠血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量的比较

与大鼠血肌酐和尿素氮的变化相一致，低剂量和高剂量补脾益肾方可改善CKD 大鼠的肾脏病组织病理损伤（图1）。根据Masson染色所显示肾脏纤维化结果，假手术组未见纤维沉积；5/6 肾切除模型组可见胶原纤维大量沉积于肾间质中，而低剂量组和高剂量组大鼠肾脏组织中胶原纤维沉积减少，其中高剂量组的减少尤为明显。PAS 染色显示，假手术组未见明显病理改变，符合正常肾脏的病理切片表现；模型组大鼠出现肾小管腔增大、间质纤维化、肾小管萎缩、系膜细胞及基质增生，伴有大量单核淋巴细胞浸润；肾切除大鼠接受低剂量和高剂量补脾益肾方治疗后，肾脏病理损伤减轻，其中以高剂量补脾益肾方治疗后肾损伤缓解最为明显。

图1 各组大鼠肾脏病理Masson（A）和PAS（B）染色结果（X200）

2.2 补脾益肾方可修复肠道屏障功能

假手术组大鼠的结肠黏膜组织紧密、未见明显炎症细胞浸润；CKD 模型组大鼠的固有层组织疏松、结肠黏膜层水肿、炎症细胞浸润严重。与5/6 肾切除大鼠模型组相比，补脾益肾方治疗组大鼠粘膜层和固有层的水肿均得到明显改善，炎性细胞的浸润明显减少（图2A）。

图2 各组大鼠结肠病理HE染色结果(X200，A)及血清DAO水平（B）

如图 2B 所示，与 Sham 组相比，5/6Nx 组血清 DAO水平显着升高（6.0±0.8 vs 18.7±4.1，P=0.016），而经高剂量补脾益肾方治疗后血清DAO 水平显着降低（18.7±4.1 vs 7.3±1.4，P=0.034）。

与Sham 组大鼠比较，5/6Nx 组大鼠的结肠组织紧密连接蛋白（ZO-1 和Claudin-1）以及IL-22 表达水平明显下降，具有显著性差异；与5/6Nx 组比较，H-BYF组则均有升高，具有显著性差异。肠道组织紧密连接蛋白Occludin 的表达水平在各组间均无显著性差异，但是与假手术组比较，5/6Nx 组大鼠的肠组织紧密连接蛋白Occludin的表达水平具有升高的趋势，与5/6Nx组比较，L-BYF 组与H-BYF 组的结肠Occludin表达水平具有下降趋势（图3）。

图3 各组大鼠结肠紧密连接蛋白和IL-22的表达水平

上述结果共同表明CKD 大鼠的肠道屏障功能损伤，补脾益肾方可以保护肠道屏障，修复肠道屏障功能，维护肠道屏障的完整性。

2.3 补脾益肾方可调整CKD大鼠的肠道菌群

2.3.1 测序结果质量分析

物种累积曲线是用于衡量和预测群落物种组成和丰富度的有效工具，被广泛用于判断抽样量的充分性以及估计物种的丰富度。在本研究中，物种累计曲线图的曲线末端上升趋势趋于平缓，提示采样率足够，可进行后续数据分析（图4A）。

2.3.2 肠道菌群的多样性分析

（1） α-多样性分析 基于OUT 水平的分析，在Shannon指数上，Sham组和H-BYF组较5/6Nx模型组低；在Simpson 指数上，Sham 组和 H-BYF 组较 5/6Nx 模型组高。根据Wilcoxon Rank-Sum 检验结果，提示模型组和高剂量组之间Shannon 指数和Simpson 指数存在显著统计学差异（P=0.0011和0.0006）（图4B）。

（2） β-多样性分析 基于非加权的距离的主坐标分析，5/6 肾切除模型组大鼠与高剂量组大鼠的物种明显分开，各聚成一簇，而低剂量组大鼠则处于模型组和高剂量组二者之间，由此可知CKD 大鼠经高剂量补脾益肾方治疗后肠道微生物多样性发生改变（图4C）。

图4 补脾益肾方调整CKD大鼠的肠道菌群

2.3.3 物种组成分析

为分析各组间物种的变化情况，通过与注释数据库NCBI 比对，对OUT 进行物种分类，并通过物种丰度柱状图直观展示在门的水平上各组物种组成及比例。在门的水平上，各组大鼠肠道相对丰度最高的菌群均为拟杆菌门和厚壁菌门，其相对丰度分别为假手术组36.7%和58.2%，5/6Nx 模型组31.6%和62.2%，低剂量组27.5%和66.2%，高剂量组41.1%和47.9%（图4D）。与正常组相比，5/6Nx 模型组的拟杆菌门和厚壁菌门数值比值（Bacteroidetes/Firmicutes, B/F）降低；与模型组相比，高剂量组的B/F值升高。

高剂量组和5/6Nx 模型组大鼠之间的肠道菌群多样性存在差异，进一步使用Lefse分析以筛选组间差异物种，结果显示：与5/6Nx 组比较，高剂量组大鼠粪便Prevotella（普氏菌属）、Phascolarctobacterium（考拉杆菌属）和Megamona（巨单胞菌属）的相对丰度显著升高，Clostridiaceae（梭菌科）、Haloplasmataceae（盐扁菌科）、Micrococcaceae（微球菌科）、Pseudomonadaceae（假单胞菌科）和Ruminococcus（瘤胃球菌）的相对丰度显著降低（图4E）。

3 讨论

在本研究中，我们发现补脾益肾方可有效降低5/6 肾切除CKD 大鼠的血肌酐、尿素氮和硫酸吲哚酚水平，降低24 h 蛋白尿定量水平，改善肾脏病理损伤；同时，经过补脾益肾方治疗后，肠道菌群中益生菌增加，致病菌减少，肠道组织IL-22 及紧密连接蛋白的表达增加，肠道屏障功能修复。因而，我们认为，补脾益肾方可能是通过调整肠道菌群，保护肠道屏障功能，减少尿毒症毒素入血，发挥延缓CKD 进展的肾保护作用。

5/6 肾切除大鼠模型制作较简单、重复性好，是研究肾纤维化发生发展机制及相关治疗方法的理想模型，其典型病理改变是肾小球硬化和肾间质纤维化，与人类肾脏纤维化病理过程相一致。在我们的研究中，与假手术组相比，5/6 肾切除模型组大鼠出现了明显的系膜细胞及基质增生、肾小球硬化、肾小管萎缩、肾间质纤维化、炎性细胞浸润等病理改变。与5/6 肾切除模型组相比，低剂量和高剂量补脾益肾方组的肾脏病理损伤均能得到缓解。

肠道不仅是消化食物和吸收营养的重要器官，所形成的屏障还能防止内毒素、尿毒症毒素等肠腔内有害物质穿过肠道粘膜进入体内循环。在本研究中，我们发现补脾益肾方可有效改善CKD 大鼠的肠道屏障功能。按照结构和功能的不同，肠道屏障包括四个部分：肠道生物屏障、肠道机械屏障、肠道免疫屏障和肠道化学屏障，共同维持着肠道乃至整个机体内环境的稳态。肠道组织紧密连接蛋白如ZO-1、Occludin 和Claudin-1等表达减少提示着肠道黏膜结构受损，可能引起肠上皮通透性增加，导致细菌易位，并伴随血清DAO 水平升高[13]。DAO 在血液中的含量通常较低，主要表达在肠黏膜中，并与肠道屏障的通透性呈正相关[14]。而IL-22 可促进上皮细胞的再生和抗菌肽的产生，已被证明在粘膜防御中起关键作用[15]。我们的研究表明，补脾益肾方有助于改善肠道机械屏障和免疫屏障，前者是通过调节粘膜结构和上调紧密连接蛋白的表达来改善，从而降低从结肠到血清的DAO 水平；后者则是通过促进IL-22的产生来改善肠道免疫屏障功能。

与此同时，补脾益肾方还对肠道菌群的结构和代谢产生影响。生物屏障是由寄生于肠腔表面的大量细菌、病毒等构成的。在本研究中，CKD 大鼠经补脾益肾方治疗后，肠道菌群获得一定的调整。首先体现在菌群多样性的改变，与假手术组比较，CKD 模型组的 α 多样性指数如 Shannon 升高，Simpson 下降，提示CKD 大鼠肠道菌群多样性增加，这可能由于CKD 的疾病状态下，与尿毒症毒素代谢有关的致病菌过度生长[16]，而补脾益肾方的治疗可有效调整肠道菌群。我们发现，在门的水平上在各组中相对丰度最高的细菌均为拟杆菌门和厚壁菌门，二者在调节宿主炎症及免疫平衡中具有重要作用。已有研究发现拟杆菌门和厚壁菌门的比值（F/B）与肠道通透性关系密切，二者呈正相关[17]。在本研究中，模型组的F/B 比值比假手术组高，高剂量组的F/B 比值较模型组下降，此变化趋势与高血压患者和糖尿病动物的肠道菌群F/B 值相一致[18-19]。

在科的水平上，补脾益肾方干预组降低了Clostridiaceae（梭菌科）、Haloplasmataceae（盐扁菌科）、Micrococcaceae（微球菌科）、Pseudomonadaceae（假单胞菌科）的相对丰度。已有研究发现，上述四种菌科可促进脲酶和尿酸酶等产尿毒症毒素特定酶的产生[20]。在属的水平上，补脾益肾方有助于提高了CKD 大鼠的Prevotella（普氏菌属）、Phascolarctobacterium（考拉杆菌属）和Megamonas（巨单胞菌属）的相对丰度，降低了Ruminococcus（瘤胃球菌）的相对丰度。在轻度肾功能受损的成人中，Ruminococcus的丰度与硫酸吲哚酚水平呈正相关，与肾功能呈负相关[21]。在本研究中，与5/6 肾切除组大鼠相比，低剂量和高剂量补脾益肾方组的血肌酐、尿素氮以及硫酸吲哚酚均明显下降，并呈剂量依赖性，考虑与补脾益肾方减少产尿毒症毒素特定酶的菌属相关。

已有研究证明肠道菌群失调，致病菌增多促进尿毒症毒素的产生，破坏肠道粘膜屏障功能，使毒素进入全身循环系统，加速CKD 发展[12]。补脾益肾方降低产尿毒症毒素特定酶的肠道菌群，包括Clostridiaceae（ 梭 菌 科 ）、Haloplasmataceae（ 盐 扁 菌 科 ）、Micrococcaceae（微球菌科）和Pseudomonadaceae（假单胞菌科）的相对丰度，因而我们可检测出补脾益肾方组的大鼠血清硫酸吲哚酚明显减少。一些肠道微生物来源的尿毒症毒素，包括苯乙酰谷氨酰胺、硫酸吲哚酚、硫酸对甲酚和氧化三甲胺，在CKD 和终末期肾脏病患者血清中升高，并与CKD 的发展、心血管事件、死亡等临床终点呈正相关。已有实验证明硫酸吲哚酚、硫酸对甲酚等尿毒症毒素能促进CKD 大鼠肾间质纤维化。上述研究发现支持了肠源性尿毒症毒素的增加可促进肾脏疾病进展。终末期肾脏病患者的肠道屏障功能受损，促进尿毒症毒素进入全身循环系统，是尿毒症患者普遍存在的全身炎症的潜在原因。尿毒症患者即使接受规律血液透析治疗，硫酸吲哚酚等肠道微生物来源的尿毒症毒素不能被有效清除，毒素蓄积引起的尿毒症综合症，严重降低了患者的生活质量和缩短了预期寿命。因此，我们认为，补脾益肾方调节肠道菌群可以缓解尿毒症的毒素蓄积症状，提高生活质量，延缓CKD 进展，或可推迟进入肾脏替代治疗的时机。

虽然在本研究中未能以数据明确说明短链脂肪酸在各组间的差异，但是Prevotella（普氏菌属），Phascolarctobacterium（考拉杆菌属）和Megamonas（巨单胞菌属）可促进肠道中短链脂肪酸的产生，为产短链脂肪酸菌[22-24]。当前已有研究发现短链脂肪酸作为肠道上皮特殊营养和能量组分，发挥着保护肠道黏膜屏障、降低人体炎症水平和促进胃肠道运动机能等作用，对维持人体健康至关重要。肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸可通过抑制组蛋白去乙酰化酶，激活GPR41以促进缺氧诱导因子1α及芳香烃受体的表达，从而促进CD4+ T 细胞及固有免疫细胞中白介素-22（IL-22）的表达，以维持肠道免疫屏障稳态[15]。IL-22是IL-10 家族成员，通过促进上皮屏障功能和诱导抗菌肽来保护宿主以免受到肠道炎症的损伤[25]。IL-22敲除的基因小鼠，肠道屏障功能受损、抗菌肽减少，致病菌增加、益生菌减少、菌群失调，导致血液中菌群产物脂多糖和氧化三甲胺增多，活化巨噬细胞和单核细胞，启动动脉粥样硬化的发生，而补充IL-22可抑制小鼠促动脉粥样硬化的菌群增殖，从而对动脉粥样硬化起抑制作用[26]。另一方面，短链脂肪酸本身具有一定的肾保护作用，譬如补充短链脂肪可有效抑制高糖条件下肾小管上皮细胞和足细胞的炎症，降低小鼠糖尿病肾病的发生[22]。对于终末期肾病患者而言，肠源性尿毒症毒素可加剧全身炎症和氧化应激，可促进并发症的发生发展和提高患者死亡风险。根据一项初步临床研究结果可知，维持性血液透析患者补充丙酸钠可降低维持性血液透析患者的炎症参数，抑制氧化应激[27]。在本研究中，经补脾益肾方治疗后的CKD 大鼠肠道病理改善、肠道组织紧密连接蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin-1 增多，可能是补脾益肾方治疗通过增加产短链脂肪酸的菌群，促进IL-22的表达，增加短链脂肪酸的产生，保护肠道屏障，维持肠道稳态。

《金匮要略》有“四季脾旺不受邪”之说；中医学认为脾居中焦，为气血生化之源；脾的这种抗邪能力和运化水谷与肠道菌群的机体免疫功能和营养物质代谢具有类比之处。当肠道菌群失调时,可出现脾虚症状如腹胀、纳呆、腹胀、乏力、便溏等,肠道菌群失调或许是中医脾虚证的重要生物学机制之一[28]。在补脾益肾方中，黄芪、党参、山药、白术、薏苡仁、茯苓均具健脾功效，生物活性成分有黄酮类、多糖类、生物碱等，具有促进益生菌生长、抑制致病菌生长、抑制炎症因子、保护肠黏膜、调节机体免疫力等作用[29]。肾为先天之本，脾为后天之本，水谷精微的培育和充养，才能使肾的精气得到不断充盈和成熟。因此，我们考虑：肠道菌群保持相对稳态—脾胃化生水谷精微功能正常—以后天养先天，肾的精气得到充盈；肠道菌群紊乱—脾失健运,产生湿、毒、瘀等邪实——肾的精气受损。

综上，补脾益肾方在减少致病菌生长的同时增加益生菌的相对丰度，调节肠道菌群，减少尿毒症毒素的产生，促进肠道紧密连接蛋白和免疫因子IL-22 的产生，修复肠道粘膜屏障功能，减少毒素入血进入全身循环，从而延缓CKD 的进展。本研究的创新之处在于基于肠肾轴理论模型，从肠道菌群与肠道屏障相关的新角度，证实补脾益肾方可能通过调整肠道菌群，保护肠道屏障，延缓慢性肾脏病，构成补脾益肾方-肠道菌群-肠道屏障-尿毒组毒素-CKD 的潜在作用机制。本研究的不足之处在于探讨补脾益肾方与肠道菌群和肾脏病的相关关系同时，未能对其因果关系进行确认，亦未能排除中药对肾功能的直接作用，待日后进一步研究。