沉香线香燃香吸入助睡眠作用及机制探究＊

弓 宝 ，王灿红 ，王新腾 ，吴玉兰 ，魏建和 ，2＊＊

（1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所海南分所/海南省南药资源保护与开发重点实验室&国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室 海口 570311；2. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所/中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室&濒危药材繁育国家工程实验室 北京 10019）

失眠多由内在情志或外在工作压力等因素引起，目前失眠或入睡困难已经成为临床常见疾病之一，越来越多的人在睡眠及睡眠质量方面得不到保障[1]。临床常用的镇静催眠药品不良反应较多，人们长期服用均会出现不同程度的停药反跳、耐受性，甚至产生药物依赖症等等不良反应[2-3]，因此医药学家们一直在寻找安全有效的替代药物。

沉香在我国香料界及传统医药领域拥有上千年的使用历史[5]，当白木香树的树干或枝条受到外界伤害刺激后会自发产生的一种树脂类物质，那么含有这种树脂的木材便是沉香[4]。沉香传统的使用方法以直接熏点吸入的方式居多，具有镇静安神、改善睡眠的功效[6]，但是其吸入助睡眠药效和作用机制尚未阐释清楚。随着通体结香技术的广泛应用和推广，国内外种植沉香的面积逐年扩大，沉香资源问题得到了解决[7]，沉香市场上相关产品也日益增多，沉香线香作为沉香主要的产品形式之一，因其使用和携带方便，备受消费者的重视和欢迎[6]。已有报道显示，沉香香粉和挥发油熏香吸入具有镇静抑制自主活动及促睡眠作用[8-11]。但是，有关线香以传统燃烧熏香吸入的镇静催眠作用及作用机理一直未见相关报道。

本研究采用自制熏香仪，应用传统熏点沉香线香的方法，观察其对失眠模型小鼠协同戊巴比妥钠睡眠状况以及行为学的影响，此外检测沉香线香熏点吸入后，失眠模型小鼠体内5-HT 等神经递质水平变化以及与Glu 能系统代谢和转运相关蛋白如GluR1 及VGluT1表达的影响，初次探究以传统熏点沉香方式吸入给药后，其镇静安神作用及其可能的机制，为沉香线香等熏香类医药产品临床应用及后期沉香大健康产业的优化升级提供重要的参考依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器与试剂

自制熏香仪（50 cm × 50 cm× 40 cm 正方体，其内部放置1 个20 cm×20 cm×20 cm 镂空的圆柱体结构，中间可放置熏香香插）；自主活动仪（Shanghai Xinsoft Information Technology Co.,Ltd.,Serial:(RD-1118-COM4)；沉香线香（沉香加工中心制备）；戊巴比妥钠（LOT NO: top2017012301, Merck, USA）；地西泮片（LOT NO: 20200921, Taiyuan Zhenxing Pharmaceutical Co., Ltd.,）；5-HT 试剂盒（LOT NO: DRE30136, Beijing Bosheng Jingwei Technology Co., Ltd.,）、GABAA试剂盒（LOT NO: DRE31429, Beijing Bosheng Jingwei Technology Co., Ltd.,）、Glu 试 剂 盒（LOT NO:DRE31214, Beijing Bosheng Jingwei Technology Co.,Ltd.,）、SDS-PAGE 凝 胶 制 备 试 剂 盒（LOT NO:HP201501, Wuhan Servicebio Technology Co, Ltd.,）、腺苷 试 剂 盒 :（LOT NO: DRE31229, Beijing Bosheng Jingwei Technology Co.,Ltd.,）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（LOT NO: BL522A, Beijing Labgic Technology Co,Ltd.,）、GluR1 一 抗（LOT NO: AF2473, BiYuntian Biotechnology Co., Ltd.,）、VGluT1 一 抗（LOT NO: bs-11267R, Beijing Boosen Biotechnology Co., Ltd.,）、山羊抗兔二抗（LOT NO: A0208, BiYuntian Biotechnology Co.,Ltd.,）。

1.2 实验动物

购买雄性昆明小鼠进行实验，体质量区间为18-22 g，由海南省药物研究所有限公司提供（SCXK[琼]2019-0004）；SPF级动物饲养室中常规饲养，环境温度维持25±1℃，环境湿度维持50±5%，日夜光照时间为12 h:12 h，3天适应期后开始实验。

2 实验方法

2.1 实验动物分组造模及给药

将动物按照随机法分成：空白对照组，氯苯丙氨酸模型组，地西泮对照组（2.5 mg·kg-1），低、中、高剂量线香熏香组：0.25 g 线香（相当于100 mg·kg-1沉香醇提物），0.5 g 线香（相当于200 mg·kg-1沉香醇提物）、1 g线香（相当于400 mg·kg-1沉香醇提物），共设6组，每组10 只小鼠。空白对照组与氯苯丙氨酸模型组不作相应处理；地西泮对照组采用腹腔注射方法给予地西泮；低、中、高剂量线香熏香组动物置薰香仪中进行熏香，分别称重0.25，0.5，1.0 g沉香线香放置到熏香仪中的香插上点燃，将小鼠放入薰香仪，薰香1 h/次，连续给药7天。第1次和第2次给药后，模型组及给药组均按照300 mg·kg-1剂量注射给予对氯苯丙氨酸，连续2天，制备失眠模型。参照文献[12-14]，如小鼠表现为体重减轻、毛发凌乱、光泽消失且具有一定强攻击性等情况发生，则判断为造模成功。

2.2 沉香线香熏点吸入对失眠模型小鼠的睡眠观察

实验动物按2.1 法分组后进行造模并给药，模型组及熏香各组腹腔注射给予戊巴比妥钠（50 mg·kg-1），用计时器记录动物入睡时间以及睡眠时长，记录时间精确到秒（S）。

2.3 沉香线香熏点吸入对失眠模型小鼠自主活动的观察

实验动物按2.1 法分组后进行造模及给药，放置在动物自主活动仪内进行行为学观察，分析记录各组小鼠10 min 内在活动中央区域的停留时间、整个活动区域动物运动的总路程以及动物运动的平均速度，每组观察实验间隔，使用消毒酒精擦拭场箱，并清洁箱底粪便。测试时保持周围环境安静。

2.4 ELISA 法对沉香线香熏点吸入各组小鼠脑内神经递质水平测定

选取2.3 实验检测后的小鼠，用乙醚麻醉后，将小鼠处死并在冰块上取出脑组织，用医用NaCl 溶液洗净，滤纸擦干称取重量。将脑中海马组织剥离出来，冰浴条件下加入温度为4℃的医用NaCl冷冻溶液混合进行匀浆后，低温条件下，在每分钟3000 转的转速下离心15 min，离心液保存于-20℃低温冰箱内。依据试剂盒测定的方法要求制作相应的标准曲线，将测定样品中5-HT、Glu、AD、GABAA的 OD 值带入，计算各组小鼠脑组织内5-HT等递质的水平变化。

2.5 Western blot 法对脑内海马体相关蛋白表达的测定

将小鼠海马体脑组织从全脑中分离，加入0.9%NaCl 溶液匀浆，离心，弃去上清液，加入RIPA 裂解液后进行蛋白定量，采用试剂盒的方法，应用酶标仪对海马体脑组织中的蛋白进行浓度检测，进行配胶后加上样量电泳至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h后，加 1:2000 的一抗 β-actin，1:1000 的 GluR1 以及 1:1000的VGluT1。样本置40℃温度下过夜，二抗置于室温条件下孵育后，采用凝胶成像仪成像的方法测定。

2.6 统计学处理及数据分析

应用SPSS18.0 统计软件进行数据分析，结果以“均数±标准差”（）的形式呈现，并使用 GraphPad Prism 软件绘制成柱形图展示。

3 实验结果

3.1 沉香线香熏香吸入对小鼠睡眠的影响

观察沉香线香熏点吸入后，观察戊巴比妥钠协同作用下对小鼠睡眠的影响情况，评价熏香吸入对睡眠作用的影响[15-22]，课题组在小鼠不死亡，而翻正反应消失的前提下，参考前期实验研究使用剂量[12]，统计小鼠入眠时间及睡眠时长（图1）。从结果可以看出，模型组睡眠观察指标与空白组睡眠观察指标比较，模型组小鼠入睡时间相对延长（P＜0.01）且睡眠时长减少（P＜0.05），体现造模方法可行；熏点线香组与模型组的睡眠观察指标相比较可以看出，熏香吸入高、中、低剂量组均能显著减少失眠小鼠的入眠时间（P＜0.05或P＜0.01），说明沉香线香熏点吸入可以促进小鼠进入睡眠状态；与模型组比较发现，熏香吸入中剂量组能显著增加小鼠睡眠时长（P＜0.05），说明熏点吸入沉香线香可提高失眠小鼠的睡眠质量；而熏香吸入的低剂量组和高剂量组则影响不显著，可能与初始剂量不足，而加大剂量后出现先扬后抑的抛物线反应；临床上应用镇静安神类药物时也发现，低剂量时有镇静促睡眠作用，随着剂量加大反而出现兴奋样的反转效应。可见随着剂量加大，药效不是一直随之增强，到达一定程度可能会出现反作用，这也提示沉香熏香可能有“双向调节作用”，需进一步研究阐释。

图1 沉香线香熏点吸入对失眠小鼠睡眠状况的观察

3.2 沉香线香熏点吸入对失眠模型小鼠自主活动的观察

实验动物处于新环境下，其自主活动的表现、探索行为以及紧张程度都会发生变化，而旷场实验是评价这些变化常用的方法之一，一般作为评价动物行为变化、动物是否出现焦虑或抑郁行为等方面被广泛使用[23]。除空白对照组外，其余各组小鼠熏点吸入沉香线香后，放入旷场中进行自主活动观察实验，应用计算机统计软件考察小鼠总运动路程（mm）、运动平均速度（mm·s-1）及静止时间（s）等指标（图2）。从结果看出，造模后模型小鼠的运动路程和运动速度变化不明显，而小鼠静止的时间减少（P＜0.05）；而熏点吸入沉香线香后，低、中剂量熏点线香组的自主活动均显著减少（P＜0.05），而高剂量熏点线香组的变化反而不显著；低、中、高剂量组的动物在静止时间指标上均显著增加（P＜0.01），说明沉香线香熏点吸入可以增加动物安静状态；其与地西泮对照组观测指标相比无差异性（P ＞0.05），说明熏点沉香线香和阳性对照药作用无显著差异。

图2 沉香线香熏香吸入对小鼠自主活动的影响

3.3 沉香线香熏香后小鼠脑组织中Glu、GABAA、GABAA/Glu、5-HT、AD的含量变化

现代研究表明Glu、GABA、5-HT、AD 等神经递质的水平高低以及GABA/Glu 的平衡均在睡眠—觉醒节律中起到重要的作用，观察其含量的高低对睡眠状况起到一定的指导意义[24]（图3）。从结果可以看出，失眠模型小鼠的Glu 的水平增加比较明显（P＜0.05），而5-HT 的含量和GABAa的含量均有所降低和减少（P＜0.05），与此同时GABA/Glu 平衡值与AD 含量值则显著降低和减少（P＜0.05），结果说明通过造模，小鼠脑内神经递质的水平与未造模相比有很大差异；地西泮对照组的小鼠体内Glu 的水平明显下降（P＜0.05），沉香线香熏点吸入后有一定程度的增加（P＜0.05）；另外地西泮对照组与沉香线香熏点吸入各组的GABA水平均有所升高（P＜ 0.05），且GABA/Glu 的平衡值与AD 水平值显著升高（P＜ 0.01）；熏香吸入低剂量和中剂量组小鼠的5-HT 含量水平明显升高（P＜0.01），反而高剂量组有下降趋势（P＜0.05），以上总体说明熏点沉香后对影响睡眠的主要神经递质有调控作用。

图3 沉香线香熏香后小鼠脑组织中Glu、GABAA、GABAA/Glu、5-HT、AD的含量变化

3.4 沉香线香熏点吸入对脑内海马体GluR1和GluT1蛋白表达的影响

文献研究表明谷氨酸（Glu）为广泛分布于哺乳类动物脑内中可引起兴奋作用的一类神经递质[25]，其重要原料谷氨酰胺（Gln）在谷氨酰胺酶（TG酶）的协同作用下生成谷氨酸，所以谷氨酰胺转化为谷氨酸的程度对机体内维持谷氨酸含量的高低十分的重要[26]。GluR1是谷氨酸的相关受体蛋白且具有传递兴奋性信息作用；VGluT1 广泛分布与谷氨酸囊泡陌上，在囊泡膜离子浓度改变的条件下，协助谷氨酸在囊泡间转运，其对机体谷氨酸含量的维持起到至关重要[27-28]。结果发现造模组小鼠脑组织中的VGluT1 蛋白量下降较为明显（P＜ 0.05），而GluR1 的蛋白量有下降的趋势，但差异无统计学意义；地西泮对照组与熏点吸入各组的GluR1表达量增加（P＜0.05），地西泮对照组与熏点吸入中剂量及高剂量组的VGluT1 蛋白表达量增加（P＜ 0.05）（图4）。

图4 沉香线香熏香后对小鼠脑组织中GluR1及VGluT1蛋白表达的影响

4 讨论

目前药效研究中，针对改善失眠症药物评价的经典模型为戊巴比妥钠诱导的睡眠模型以及使用氯苯丙氨酸注射制作失眠模型[29,13]，睡眠实验的评价指标常考察睡眠潜伏期和睡眠时间两个指标[30-31]，参考文献研究[32-33]利用PCPA 制作动物失眠模型。本研究结果显示，相比正常组，连续注射PCPA 2d，小鼠自主活动显著增加，表明小鼠出现了失眠症状。与模型组相比较，熏点沉香线香可以缩短失眠小鼠模型的睡眠潜伏期，且在一定熏香剂量下可延长其睡眠时间，表明沉香线香熏点吸入具有改善睡眠作用。

给予动物相应的药物后观察其自主活动行为的变化情况，是评价作用于精神方面药物或者神经方面药物常用的方法之一[23]。本实验参照徐飞飞[14]和王帅[12]报道的自主活动评价方法，选择运动总路程、平均速度和静止时间作为评价指标。结果显示，与模型组相比较，低剂量组和中剂量组沉香线香熏香后能够减少小鼠运动总路程，且运动的平均速度同时下降，而高剂量组这两个指标改变不明显，这与睡眠实验结果中高剂量组反而不能显著延长睡眠时间相一致，可能与有效物质成分代谢转化或高剂量的反作用有关，均需做进一步研究；低剂量组、中剂量组和高剂量组均可增加小鼠旷场中静止时间，根据文献研究报道[15]，自主活动能力的降低可以说明沉香线香熏香后对氯苯丙氨酸造模的失眠小鼠睡眠有一定的改善作用。之前已有文献报道采用沉香提取物灌胃，可以降低小鼠自主活动频率以及延长睡眠时间[12]，综上表明无论是采用熏香还是沉香提取物灌胃均能够降低小鼠的自主活动。

5-HT 可影响“睡眠-觉醒”的节律过程，是与睡眠功能密切相关的神经递质之一，抑制5-HT 的合成或者破坏5-HT 能神经元均能导致机体出现不同程度的失眠行为[34-35]。通过给予动物腹腔注射PCPA，从而阻碍动物机体内5-HT 生成，进而达到睡眠剥夺的目的[36]。本研究发现与模型组比较，熏点沉香线香后，能够升高失眠模型小鼠5-HT 递质含量，表明沉香线香熏点吸入改善小鼠失眠症状的作用机制，可能与其具有调节脑内5-HT 递质的作用有关。但是随着熏香剂量的增加，5-HT 含量呈现下降趋势，是否说明沉香熏香具有双向调节作用，需要进一步研究。

神经生理学实验研究表明，大脑的兴奋-抑制功能存在着平衡关系，其对睡眠状态有一定的影响[37-38]，谷氨酸脱羧酶可以辅助使得机体内兴奋型的神经递质Glu 可以转化为抑制型的神经递质GABA，因此GABA 与Glu 之间的平衡是否稳定，对失眠质量提升有很大的关系[39]。熏点沉香线香后可同时提高小鼠脑组织中兴奋型神经递质Glu 和抑制型神经递质GABA的量，从而整体上使得GABA/Glu 平衡值增加，可以推断出熏点沉香线香助睡眠的机制有可能与调节Glu和GABA 有关，这与报道的沉香气体吸入给药后，可以促进小鼠睡眠，改善小鼠失眠状态，作用机理有可能是通过下调Glu 的水平，或上调GABA 的水平，进而最终使得Glu/GABA 比值整体下调有关[9]的说法相一致。而降低的Glu 是否转化为GABA 则需要后期深入研究。在睡眠-觉醒的周期调控中，AD 递质会跟随着神经元活动而快速分泌，文献研究表明[40]谷氨酸能神经元能引起腺苷的分泌，腺苷水平的高低变化可以起到调控睡眠的作用。本研究表明，与模型组相比较，熏点沉香线香后可显著提高腺苷的水平，这也可能是沉香熏香助睡眠的作用机制之一。

谷氨酰胺（Gln）在谷氨酰胺酶的作用下转化为Glu，而Glu 是影响调节睡眠的重要中枢神经递质之一[26]，而VGluT1是谷氨酸能神经递质转运的主要蛋白之一，其表达水平的高低决定了体内组织中谷氨酸水平的高低，因此课题组选择影响Glu 兴奋传递及转运相关的GluR1和VGluT1水平进行测定，发现熏点沉香后能显著提高脑组织中GluR1及VGluT1水平，表明它们可能通过间接调控Glu/GABA 的平衡发挥促睡眠作用。

综上所述，在一定剂量下熏点吸入沉香线香，可以改善失眠模型小鼠的睡眠指标，减少失眠模型小鼠自主活动并增加其静止的时间，对其脑内与睡眠相关的如5-HT等神经递质有相应的调节作用，对与Glu相关的GluR1 及VGluT1 相关蛋白的表达也有一定的影响。基于以上结果可以得出，沉香线香燃烧熏香后具有助睡眠的作用，其作用机制可能与调节脑内5-HT递质含量、调控GABA-Glu 分泌平衡以及Glu 合成代谢和转运有关，提示沉香熏香吸入后通过“多通路、多靶点、多成分”发挥助睡眠的作用。但是长时间大剂量熏点沉香线香是否会产生反向调节作用需要做进一步研究。沉香熏香改善睡眠的疗法目前在临床上已有小范围的推广应用[11]，本研究结果可为以后沉香熏香在临床上治疗失眠症的推广以及沉香大健康产品的优化升级提供重要的依据和借鉴。