黄芪甲苷干预的EPC-Exos对高糖诱导损伤间充质干细胞向内皮分化的影响＊

彭阿建，欧阳范馨，张 熙，谭梅鑫，梁文菲，朱晨鸿，刘锦清，张璐瑶，肖郁婷，熊 武

（1. 湖南中医药大学中西医结合学院 长沙 410208；2. 湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007；3. 湖南省脑科医院/湖南中医药大学临床医学院 长沙 410007）

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）作为一种具有多向分化潜能的“种子细胞”在组织修复、促血管新生及降低细胞因子风暴等方面均具有巨大医疗价值[1-2]。有研究报道生长因子刺激的人脐血间充质干细胞（hUCBMSCs）可通过其旁分泌外泌体发挥较强的血管新生作用，在治疗糖尿病及其并发症方面有广泛的临床应用前景[3]。外泌体是由细胞分泌的参与胞间通信、物质交换和血管再建的脂质膜性囊泡，所包含的mRNA、miRNA（MicroRNA，微小RNA）和各种功能蛋白及生长因子等是其发挥重要生物学功能不可或缺的成分[4-5]。 内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是一种主要来源于骨髓可分化为内皮细胞（Endothelial cells，ECs）的血管干细胞，因其在血管内皮损伤修复与血管新生方面发挥重要功能而成为近年来的研究热点。内皮祖细胞外泌体（Endothelial progenitor cells derived exosomes，EPCExos）是EPCs 的重要旁分泌物质。最新研究表明，EPC-Exos 能增强ECs 的成管功能，在缺血性疾病血管的修复和再生中有较大潜能。有关研究显示，EPCExos 可调控MSCs 生物学功能并充分发挥MSCs 作为干细胞的优越性，参与诱导分化为创面修复所必需的成纤维细胞及血管内皮细胞，为外泌体修复糖尿病创面提供理论依据[6]。目前临床上糖尿病血管新生困难，高糖受损ECs 的血管再生能力弱，而MSCs 具有良好的血管分化潜能，若能充分激活MSCs 定向分化为血管内皮的潜能，可弥补高糖受损ECs 成管功能低下的不足，对于攻克糖尿病血管新生困难的瓶颈有重要意义。

黄芪甲苷是中药黄芪中最主要的活性成分，因其能诱导血管新生而广受关注[7]。本团队前期研究表明黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）对人EPCs 分泌外泌体有明显促进作用，AS-Ⅳ干预的EPC-Exos 负载大量 miR-126，且 miR-126 可能 调 控 下 游 PIK3R2/SPRED1 （Phospholipylinositol-3-kinase regulatory subunit，磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基-2；Sproutyrelated，EVH1 domain-containing protein-1，Sprouty 相关EVH1 结构域蛋白1）途径发挥促进血管新生效应[8]。然而AS-Ⅳ干预的EPC-Exos是否能促进高糖受损的MSCs 向内皮分化，目前尚无相关研究。本文是在前期研究发现AS-Ⅳ干预的EPC-Exos 具有较强血管新生的活性基础上，进一步研究其对高糖诱导损伤MSCs向ECs分化的影响。

1 材料

1.1 主要试剂与仪器

黄芪甲苷（S31401，纯度≥98%）源叶生物；胎牛血清（10270-106），美国 GIBCO；Dil-Ac-LDLc（BT-902）美国Biomedical Technologies；DMEM/F12培养基，美国Hyclone（SH30023.01B）；CCK-8 试剂盒（C0037），上海碧云天生物技术研究所；成骨诱导分化培养基（HUXMA-90021），成脂诱导分化培养基（RASMD-90031），美 国 Cyagen；DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole，4'，6- 二 脒 基 -2- 苯 基 吲 哚）染 液（D9542），油红O 溶液（O1391-250ML），美国Sigma；成软骨诱导分化培养基试剂盒（HUXUB-90042），美国OriCell；Matrigel 基质胶（354234），美国 BD BioCoat；FITC anti-human CD44 抗体（338803），PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) 抗体（344003），APC antihuman CD105 抗体（323207），美国 Biolegend；Anti-CD9 抗体（ab92726），Anti-CD63 抗体（ab134045），TSG101（ab125011），Anti-vWF 抗体（ab154193），Anti-CD31 抗体（ab28364），山羊抗小鼠IgG H&L（FITC，异硫氰酸荧光素）（ab6785），英国Abcam。

CO2培养箱（XD-101），日本SANYO；生物倒置显微镜（BX51），日本OLYMPUS；台式低速离心机5804(R)，4℃离心机（5415R），德国Eppendorf Centrifuge；流式细胞仪（FACSCalibur），美国BD；酶联免疫检测仪（热电MK3 酶标仪），超低温冰箱（905），美国Thermo；共聚焦显微镜（LSM800），德国蔡司；超速离心机（Optima L-100XP），美国Beckman；透射电镜（Tecnai Spirit T12）美国 FEI；Nanosight NS300 纳米颗粒跟踪分析仪，英国Malvern。

2 方法

2.1 EPCs及hUCBMSCs细胞分离、培养和鉴定

2.1.1 EPCs分离、培养及鉴定

本团队前期已从人脐带血中分离并提取人EPCs，细胞鉴定于前期研究[9]中已验证。

2.1.2 hUCBMSCs分离、培养

无菌条件下取足月健康新生儿脐带血10 mL（标本采集获得产妇和家属知情同意），用密度梯度离心得到单个核细胞，移入DMEM/F12 培养基（5%胎牛血清、1%双抗）中，在37℃培养箱中培养24 h 后换液并清除漂浮细胞，换培养液，继续培养至第7 天，细胞生长达90%融合时进行传代培养，每隔2天换液1次。

2.1.3 hUCBMSCs的鉴定

将P3 代生长状态良好的人脐血间充质干细胞置于200 倍光学显微镜下观察。取P4 代人脐血间充质干细胞用胰酶消化，后转至1.5 mL EP 管制成细胞悬液，1200 r·min-1离心 5 min。将 P4 代生长状态良好的人脐血间充质干细胞依次进行成骨、成软骨和成脂诱导分化鉴定，鉴定成功的P4 代hUCBMSCs 用于后续实验。

2.2 细胞造模和分组

将鉴定成功的EPCs 按照随机数字表法分为2 组，每组 3 孔，每孔 1×105个。一组加入 100 mg·L-1[10]黄芪甲苷培养24 h；另一组加入等量的PBS 培养24 h，分别提取并鉴定内皮祖细胞外泌体（EPC-Exos），用于后续实验。将鉴定成功的hUCBMSCs 随机分为3 等份，取其中2 份在葡萄糖浓度为 30 mmo1·L-1的 EGM 培养基中预培养120 h，随机分为2组，实验组和对照组；将另1份hUCBMSCs 用无糖的EGM 培养基预培养120 h，作为正常组。实验组加入适量黄芪甲苷干预的EPCExos，对照组和正常组加入等量PBS 干预的EPCExos，随后检测hUCBMSCs 体外成管及内皮分化的能力。

2.3 EPC-Exos的分离与鉴定

采用经典超速离心法提取P3-P6 代EPCs 培养后分泌的外泌体。在37℃中速融样本（样本常温寄送，融化状态），将样本移动至一个新的离心管内，2000×g，4℃，30 min 离心；将上清液移至新的离心管中，12,000×g，4℃，45 min再次离心，以去除较大的囊泡及杂蛋白；得到的上清液经0.45 μm 滤膜过滤；将过滤液移至新的离心管中，4℃，100,000 × g 超速离心70 min；去除上清，用PBS 重悬后，再次4℃，100,000 ×g 超速离心70 min；去除上清，用 PBS 重悬，取 5 μL 稀释至 24 μL后分3 份20 μL 提取蛋白，采用蛋白质印迹法检测外泌体特征性标志物 CD9、CD63 和 TSG101 的表达[11-12]。以上三者均阳性结果提示EPC-Exo 提取成功，用于后续实验。

2.4 EPC-Exos的形态观察

将直径2 nm 的载样铜网固定于支架上，分别滴加4 组 EPC-Exos 悬液 20 μL，室温静置 3 min；用滤纸吸取多余的液体，加入30 μL体积分数2%醋酸铀酰溶液负染EPC-Exos 5 min；用滤纸吸干负染液，将铜网置于Tecnai Spirit T12透射电镜的样品室内，放大10万倍观察EPC-Exos的形态并拍摄照片。

2.5 EPC-Exos的粒径分析

采用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis，NTA）技术检测 4 组 EPC-Exos 的粒径。取 4组各20 μL EPC-Exos 悬液，用去离子水稀释至1000μL，稀释后的样品装入1 mL 注射器，放进纳米颗粒跟踪分析仪的装载管，设置温度25℃、黏度0.90 cP、折射率1.330、每秒帧数25 及测量时间60 s 等参数。待屏幕上的粒子图像稳定后追踪并分析每个EPCExos 颗粒的无规则布朗运动轨迹；利用Stockes-Einstein方程式计算EPC-Exos粒径。

2.6 EPC-Exos干预MSCs后对其内皮分化的影响

4 组 EPC-Exos 分别干预 MSCs 后，采用 Matrigel 体外成管实验，检测其对MSCs 成管的影响；采用免疫荧光检测其对MSCs向内皮分化的影响。

2.6.1 Matrigel体外成管实验

选用去除酚红、低生长因子的Matrigel 基质胶4℃过夜溶解，枪头盒、EP 管、96 孔板均4℃过夜预冷；翌日于冰盒上铺胶，先用M200 培养基按1:1 稀释Matrigel 基质胶，混匀后，50 μL/孔加入 96 孔板提前预冷），避免产生气泡，37℃孵箱放置30-60 min，使基质胶凝固；选用P4代处于对数期的MSCs，随机分为实验组、对照组及正常组，待细胞贴壁后，消化后用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养基重悬，使细胞密度达到1×105，在固化的基质胶上每孔加入1 mL 重悬液，放入37℃，5% CO2孵箱孵育18 h 后，倒置显微镜下观察并拍照，Image J 软件测量MSCs成环数量、成管长度及节点数。

2.6.2 内皮分化指标CD31、vWF测定

在培养板中放置载玻片，玻片上滴加2 mL 含有1×106/mL MSCs 细胞悬液，加入 20 μL EPC-Exos 悬液，48 h 后取出载玻片；放入-20℃的冷丙酮中固定30 min，用PBS 冲洗3次，每次2 min；滴加3%H2O2室温孵育 10 min，PBS 冲洗 3 次，每次 2 min，0.5% Triton X-100（PBS 配制）室温通透20 min；PBS 浸洗3 次，每次3 min，吸干PBS，再滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸掉封闭液，每孔分别滴加CD31 及vWF 一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；PBST 浸洗细胞3 次，每次3 min，吸取一抗，再滴加稀释后的荧光二抗，湿盒中孵育1 h，PBST浸洗3次；滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，洗去多余的DAPI；吸干液体，荧光显微镜下观察采集图像。

2.7 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计。计量资料以平均值±标准差（）表示，实验采用完全随机设计，满足正态性和方差齐性采用单因素方差分析，组间比较采用多重比较分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 hUCBMSCs的培养及诱导分化鉴定

光学显微镜下观察P3 代细胞边缘清晰，形态均一，排列整齐,呈典型的长梭状结构，排列呈漩涡状（图1A）。P4代hUCBMSCs成骨分化鉴定可见细胞内红色结节沉积，成软骨分化鉴定可见细胞呈蓝色改变，成脂分化鉴定可见细胞呈红色改变，经鉴定细胞为正常间充质干细胞（图1B-D）。

图1 hUCBMSCs形态观察与成骨、成软骨及成脂分化鉴定结果

3.2 EPC-Exos的鉴定

分离及提纯后黄芪甲苷干预的EPC-Exos 电镜观察下形态为包膜完整的圆形或椭圆形小囊泡结构，数量较多且分布集中（图2A）；分离提纯的样本EPCExos 中，97.6% 的 EPC-Exos 粒径在 81.4-142.1 nm（图2B）；EPC-Exos 表面特异标志物 CD9、CD63、TSG101呈阳性（图2C）；与对照组相比，实验组CD9、CD63、TSG101表达均显著增加，差异有统计学意义（图2D）。

图2 EPC-Exos的形态、粒径及表面特异标志物表达情况

3.3 黄芪甲苷干预的EPC-Exos 诱导hUCBMSCs 体外成管能力

Matrigel 成管实验显示，实验组、正常组和对照组体外形成管网状结构的长度分别为373.12±49.38 mm、110.36±13.19 mm、70.57±12.23 mm，3 组成管实验典型图如图3A-C。单因素方差分析结果表明3 组的体外形成管网状结构的长度不相等或不全相等（F=88.07，P＜0.001）；多重比较结果提示：与对照组相比，实验组形成的血管长度明显高于对照组（P＜0.001）；与正常组相比，实验组形成的血管长度明显高于正常组，（P＜0.001）（图3D）。

图3 AS-Ⅳ对hUCBMSCs体外成管长度的影响

3.4 AS-Ⅳ干预的EPC-Exos 诱导 hUCBMSCs 向内皮分化情况

实验组CD31 和vWF 荧光强度分别为（3.96±0.68）和（3.15±0.62），对照组 CD31、vWF 荧光强度分别为（1.01±0.19）和（1±0.32），正常组CD31、vWF 荧光强度分别为（1.27±0.15）和（1.41±0.17）。单因素方差分析结果表明3 组的CD31 和vWF 荧光强度不相等或不全相等（F1=42.63，F2=22.72，P均＜0.05）；与对照组相比，实验组CD31 和vWF 蛋白免疫荧光强度显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01），与正常组相比，实验组CD31 和vWF 免疫荧光强度亦显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）（图4～图6）。

图4 各组MSCs免疫荧光CD31表达情况

图5 各组MSCs免疫荧光vWF表达情况

图6 免疫荧光CD31、vWF荧光强度半定量分析图

4 讨论

内皮祖细胞外泌体（EPC-Exos）是由EPCs 旁分泌的一种直径在40-150 nm 的微囊泡，其与EPCs 促进内皮细胞（ECs）增殖和血管新生功能密切相关。已有研究证实EPCs 在血管内皮损伤修复与血管新生方面扮演着重要的角色。间充质干细胞属于干细胞的一种，具有低免疫原性及调节免疫功能特点，具有多向分化潜能和强大的自我更新能力[13]。此外，魏韩笑等[6]利用基因芯片高通量筛选技术筛选兔外周血EPCs-Exos中调控MSCs 的差异基因，结果表明EPC-Exos 主要通过调节细胞周期和MAPK（Mitogen activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶）通路进而促进MSCs 增殖分化。这一研究结果表明EPC-Exos可以调控MSCs的生物学功能。Yue 等[14]研究证实IL-10 基因敲除小鼠EPC-Exos 中富含促进凋亡和炎症、抑制血管新生的蛋白，且整合素连激酶基因敲除可逆转这一现象。尹倩倩等[15]将EPC-Exos 注射到同时患有糖尿病和动脉粥样硬化的小鼠体内，检测到相关炎症因子以及氧化应激指标下降。Hu 等[16]研究表明EPC-Exos 可通过负载高浓度的miRNA-21-5p 靶向抑制血小板凝血酶蛋白1以促进人脐血静脉内皮细胞体外成管。本研究证实黄芪甲苷干预EPCs 后分泌的外泌体作用于MSCs，可促进MSCs 向ECs 分化，这一结论是基于本课题组前期研究[8]黄芪甲苷可改善人EPCs 分泌外泌体的功能，且分泌的外泌体负载miR-126 的基础上进一步探索得出。这与Wu 等[17]研究显示的EPC-Exos 中miR-126 通过下调SPRED1，可以部分增强RAF/ERK（Raf-1 proto-oncogene，serine/threonine kinase，Raf-1原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶；Extracellular signalregulated kinase，细胞外信号调节激酶）信号通路，从而促进ECs 增殖、迁移和血管生成相吻合。上述研究均提示EPC-Exos 具有促进血管内皮细胞增殖迁移、血管新生及减轻细胞炎症从而促进创面愈合的功能，且EPC-Exos 改善ECs 的功能可能与其负载血管生成相关的蛋白质和miRNA有关。

黄芪甲苷（AS-Ⅳ）乃是黄芪主要的有效药理成分，而黄芪素有“疮家之圣药之称”。现代研究表明，AS-Ⅳ的药理作用主要在于其能促进血管新生、加速创面溃烂愈合，此外在抗炎，抗氧化及降血糖等方面也具有较强的药理作用[18-20]。血管新生离不开诱导因素，其中与血管新生相关因子在激发EPCs 潜能、促进血管网新生和重构中发挥了重要作用。本团队前期研究证明，离体的EPCs能在AS-Ⅳ的诱导下加强分泌与血管新生的相关因子（血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子和血管紧张素1）等[21]。此外，前期研究不仅证实AS-Ⅳ能改善体外人EPCs 的生物学功能，AS-Ⅳ干预后EPCs 的增殖能力、黏附细胞数、细胞迁移率及体外成管数较对照组均明显增加[22]；还证实AS-Ⅳ对hUCBMSCs 无毒性，且能改善其细胞活力并提高其诱导分化为内皮细胞及成管的潜能[23]。目前，关于AS-Ⅳ促进MSCs向ECs分化的研究较少，研究大多停留在表型验证阶段，对于AS-Ⅳ如何促进MSCs向内皮分化的分子机制尚未涉及。本研究采用AS-Ⅳ干预EPCs，进一步证实AS-Ⅳ可促进EPCs 分泌EPCExos，且EPC-Exos 可有效改善高糖诱导损伤hUCBMSCs 向内皮细胞分化能力及成管潜能，但黄芪甲苷干预的EPC-Exos 中的具体活性成分通过何种关键信号通路介导MSCs 向内皮分化的深层机制还有待探究。AS-Ⅳ干预的EPC-Exos 对高糖诱导损伤MSCs体外成管的影响，是后续研究其具体机制的前提条件，也为后续开展黄芪甲苷促进干/祖细胞定向内皮分化的临床应用奠定了前期基础。

EPCs 是 ECs 的前体细胞[24]，其可定向分化为 ECs，EPCs 分泌的外泌体负载有大量有促血管新生的RNA[25]及蛋白质[26]等。本项目组推测AS-Ⅳ调控EPCs干预血管新生可能通过其干预EPC-Exos 负载调控血管生成的miRNA 及蛋白质被高糖受损MSCs摄取后促进MSCs 向内皮分化进而发挥血管新生的作用。因此，本团队今后将重点探究AS-Ⅳ干预的EPC-Exos促进高糖受损hUCBMSCs 向内皮分化及血管新生的分子机制，为以中药活性成分调控干/祖细胞分泌外泌体为基础的细胞药物治疗提供新的理论依据，加速了中医药现代化进程，为中医药与细胞工程结合以及糖尿病创面疗法革新等提供了理论基础。