基于系统药理学分析野生真菌硬皮马勃治疗肿瘤多层次作用机制＊

李 敏，王宜磊，高 霞，周广灿，唐 欣，张桂荣，崔 慧

（1. 菏泽学院农业与生物工程学院微生物重点实验室 菏泽 274015；2. 山东省农业技术推广中心 济南 250014）

肿瘤是指人体在各种致瘤因子的作用下局部组织细胞异常增生所形成的新生物。肿瘤已是严重威胁全球居民生命和健康的疾病之一，根据国际癌症研究中心数据表明，2018 年全球新发恶性肿瘤病例约1800 万，死亡 960 万例，位居全球死因首位[1]，我国每年肿瘤新发病例约392.9 万例，死亡233.8 万例[2]，且恶性肿瘤发病率呈上升趋势。常规的治疗方法为手术、放疗和化疗等，放疗、化疗在杀死肿瘤细胞的同时对机体的消化系统和造血系统损伤严重，且具有显著的毒性、耐药性等不良反应。与其相比，中药具有对控制病情，提高生存质量，降低放、化疗不良反应，降低肿瘤复发等发挥越来越重要的作用[3]。药用真菌作为中药的一种，含有多种抑制肿瘤生长的功能成分[4]，在治疗肿瘤和疑难杂症中具有独特的优势和潜力。

药用真菌在我国传统医学中具有悠久的使用历史[5]，东汉《神农本草经》中就有10 余种药用真菌的记载[6]，但是对药用真菌的分类、鉴定缺少模式标本材料和方法单一[7]，且同一药用真菌的形态特征在不同环境和生长阶段也不相同，对其研究相对匮乏，导致认知不充分，特别是民间药用真菌的研究、整理甚是稀少，使其广泛推广应用和深度开发受到严重限制。因而，开展当地民间药用资源大型真菌的鉴定、分类、药效成分分析及其作用机理十分必要。本文对当地民间应用最普遍的野生药用真菌进行组织分离，获得菌株M-1，通过形态学和核糖体rRNA 基因内转录间隔区（ITS）序列进行鉴定，该菌为硬皮马勃（Scleroderma sinnamariense）。

硬皮马勃（Scleroderma sinnamariense）属于马勃目，马勃科，硬皮马勃属，该属分布于世界各地，约60多种，我国较常见的有11种[8]，主要分布于山东、吉林、内蒙古自治区等地。《名医别录》记载马勃“味辛平无毒，主治恶疮马疥”[9]，恶疮即为现代肿瘤[10-12]。最近研究表明，硬皮马勃活性成分4,4-二甲氧基维甲酸及其衍生物显著抑制NCI-H187 肿瘤细胞生长[13]，Zhang 在多根硬皮马勃研究同样发现甾醇类活性成分能抑制肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素（IL-6）[14]，而且马勃状硬皮马勃多糖提取物对肿瘤细胞HepG2 和人肺癌A549 细胞具有显著的抑制作用[15]。但是硬皮马勃活性成分和作用机制仍不清楚，药用真菌药效成分复杂，其作用位点较多且各成分间协同作用体系复杂，采用传统的方法筛选药物成分、解释其作用机理难度极大。然而，中药系统药理学（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）借助于计算机技术在药物靶点、疾病的发病、治疗机制研究、精确调控细胞内复杂网络和提高药物的疗效等方面提供了新的策略[16]。因此，本文应用系统药理学理论和技术体系，文献中硬皮马勃化学成分，借助TCMSP 数据库寻找硬皮马勃有效的、新颖的、潜在的抗肿瘤成分，整合网络分析、功能富集和通路等技术，探讨其抑制肿瘤的潜在作用机制及其规律（图1），为揭示有效成分的作用机制提供新思路，希冀为肿瘤药物的开发提供新的视角和理论依据。

图1 系统药理学流程图

1 材料与方法

1.1 供试材料

2018 年6 月，从山东省定陶区仿山草丛里采集一株野生药用真菌子实体，置于一次性封口袋中，在微生物实验室进行分离、纯化、鉴定和保藏，菌株编号为M-1。

1.2 试验方法

1.2.1 M-1菌株纯化和鉴定

形态学鉴定：先将采集的子实体用清水清洗干净，然后用75%乙醇消毒，再用无菌水清洗掉乙醇，在无菌条件下将组织切成小块接种于PDA 培养基上，置于26℃培养，获得纯化菌株M-1，分别置于4℃和-80℃保藏备用。无菌条件下挑起菌丝接种平板上，接种点2 cm 处插入无菌盖玻片，待菌丝生长其上后取出置于光学显微镜下观察菌株的形态特征。

分子鉴定：将分离纯化的菌丝采用CTAB 法[17]提取菌株DNA，基于核糖体rRNA 基因内转录间隔区序列 ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对其 DNA 进行扩增，PCR 反应体系为 50 μL，包括 DNA 模板 2.0 μL，2.5 μmol·L-1的前后引物各 2 μL，2×tag PCR Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR 扩增程序为94℃ 5 min，35 个循环（94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min），72℃ 10 min，PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余PCR扩增产物纯化后送上海生物工程股份有限公司进行测序，测序结果用DNAMAN6.0 和Chromas Pro 软件进行碱基修正与拼接，利用在线数据库NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）对拼接后的序列进行同源序列比对，获取相似序列。

1.2.2 马勃活性成分库的构建及靶点预测

从文献中获取硬皮马勃化学成分，利用TCMSP 数据库检索其化学成分，并进行后续的系统分析。利用虚拟ADME 系统，计算硬皮马勃化学成分药用动力学参数，依据网站推荐阀值，以参数口服生物利用度（Oral Bioavailability OB）＞18% 和 类 药 性（Drug Likeness DL）＞0.1 为潜在高活性成分进行筛选，利用ChemBio获得潜在高活性成分的结构式。

在筛选到活性成分的基础上，利用药物靶向工具（SysDT）[18]和加权系综相似度（WES）[19]系统预测获得活性成分对应作用靶点。首先利用SysDT即两个数学工具，随机森林（RF）和支持向量机（SVM））系统对潜在作用靶点打分，选择参数SVM≥0.8 和RF≥0.7 的靶点作为有效作用靶点，利用WES模型挖掘药物直接靶点，该模型在预测敏感性和特异性方面表现良好，准确度达到78%。对筛选到的靶点进行整理，利用Gene Cards Suite（https://www.genecard.org）对靶点名称进行标准化，将标准化靶点映射到CTD（http://ctdbase.org/）数据库，获得与肿瘤相关靶点，这些靶点作为硬皮马勃活性成分的药理学靶点进行后续的探讨。

1.2.3 活性成分—靶点网络（C-T）的构建及分析

为明确硬皮马勃潜在活性成分和靶点之间的关系，基于TCMSP 数据库筛选出的活性成分和靶点导入Cytoscape3.8.0软件，构建可视化网络图（C-T），并进行网络拓扑参数分析。在C-T 网络图中，节点表示硬皮马勃活性成分和靶点，边表示活性成分和靶点蛋白之间的相互作用。在C-T 网络图中，与节点相关联的边的数量为“度值”，根据节点关联的边数的多少来评价节点的重要程度，边数越多，该节点越重要，节点也越大，反之越小，遴选出关键活性成分和核心靶点。

1.2.4 靶点的生物功能和通路富集分析

为了揭示活性成分潜在的作用机制，利用在线分析平台 DAVID（https://david.ncifcrf.gov）和 Metascape（https://metascape.org）对靶点进行GO（Gene Ontology）生物功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。设定阀值p-value ＜0.01，筛选排名靠前的通路，使用柱状图对富集结果进行展示，利用在线分析平台Metascape 构建抗癌靶点蛋白互作网络，揭示硬皮马勃潜在活性成分在治疗肿瘤中参与的生物学过程和涉及的通路。

1.2.5 靶点-通路（T-P）网络的构建及通路整合分析

为了探究活性成分作用靶点和通路之间的关系，利用富集分析获得KEGG 通路，构建靶点-通路（T-P）网络图，用Cytoscape3.8.0 软件对T-P 进行网络可视化，并利用网络分析模块对网络拓扑参数分析。在TP 网络中，节点表示活性成分作用靶点和KEGG 通路，边表示靶点和通路之间的隶属关系。在T-P 网络图中，与节点关联的边的数量为“度值”，根据节点相关联的边数多少来评价节点的重要程度，边数越多，该节点越重要，节点也越大，反之越小，筛选出关键靶点和主要作用通路。

2 结果与分析

2.1 野生真菌形状和显微鉴别

M-1 菌株子实体呈（图2a）梨形、近球形，菌柄较短，子实体较硬，菌盖有裂口，外表浅黄色，局部微褐色，内部洁白。无菌条件下将子实体接种于PDA 培养基上，分离纯化后的菌落干燥洁白，圆形，边缘整齐，平板背面无菌丝分泌物呈现（图2b）。菌丝粗壮，有横隔，分支较多，顶端略圆（图2c）。形态学鉴定在本校微生物教研室王宜磊教授的指导帮助下完成。

图2 M-1菌株鉴别

采用CTAB 法提取菌株DNA，PCR 扩增获得长度530 bp ITS 序列片段，将扩增片段回收、测序，测定序列为：CATTATCGAAGTCGAACGCTAGGAGGGAGAAGGGGAGCC CGTCGCTCCTCGGACCTCTCCGAAGCTTCAACCTTCTT CACACCCGTGTGCACCCGCTGTAGGTCCTTCGGGATCC TACGTCTTCGCTCTCGAACTCGCATGTCTACAGAATGTC CATGTCGTGTCGACCGGCGTCCGCGTCGGCGACCGCAA ACCTTTGTACAACTTTCAGCAATGGATCTCTTGGCTCTC GCATCGATGAAGGACGCAGCGAATCGCGATAAGTAATGT GAATTGCAGATTTTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACG CACCTTGCGCTCCTCGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGT TTGAGTGTCATCGAAATCTCGAACCGAAGCCTTCGATCC GTTCGAAGCTCGGTCTCGGAACGTGGGGGTCTGCGGGC GGCGACGTCGGCTCCCCTCAAACGCATCAGCTGTGGGC ACGAGCCCTGCGTGGCACGGCCTCCCCGACGTCGTAACGATCGTCGTGGGCTGGAAGCGCAGTGATCGGCGATCCC ATGCTTTCCAACCTTTTTCTCGAAGCT。 在 线 NCBI 数据库进行核酸序列比对，该序列与硬皮马勃对应序列同源度100%，结合子实体、菌落和菌丝特征，初步认为该菌株为硬皮马勃（Scleroderma sinnamariense）。

2.2 硬皮马勃活性成分库的构建及ADME 虚拟筛选

从文献中获得硬皮马勃的化学成分59 个，通过TCMSP数据库查找到的化学成分37个，根据ADME系统虚拟筛选标准，以参数OB%＞18，DL＞0.1 进行筛选，获得活性成分7 个，分别为脂肪酸、甾体化合物、脂类和醇类，其药用动力学和结构相关信息在表1 中。其中，活性成分亚油酸（LA）[20]和棕榈酸（PA）[21]已被报道具有抗肿瘤作用。

表1 硬皮马勃活性成分及其药用动力学参数

2.3 硬皮马勃活性成分靶点预测及C-T 网络的构建

通过SysDT 和WES 系统获得7 个活性成分（表1），其中TCMSP 数据库里仅有5 个潜在活性成分的靶点，共获得38 个无重复靶点，分别为：PTGS1、PTGS2、RXRA、NCOA2、IGHG1、GABRA1、PGR、CTSD、BCL2、IL10、TNF 等，平均每个潜在活性成分靶点为7.6 个。将38 个靶点映射到CTD 数据库中，获得靶点的功能，以Cancer 为关键词筛选与肿瘤相关靶点16 个。将5个活性成分和肿瘤相关16 个靶点导入Cytoscape3.8.0软件构建硬皮马勃活性成分和药理学靶点（C-T）网络图（图3），基于21 个节点（活性成分5 个和靶点16 个）和26条边构建C-T网络图。图中红色圆点表示靶点，绿色箭头表示活性成分，边表示潜在活性成分对靶点的作用。通过拓扑分析发现，高度值的分子和靶点可能在肿瘤治疗过程中发挥重要作用，硬皮马勃活性成分LA和PA的度值较高，分别为7和11，这些活性成分可能在硬皮马勃治疗肿瘤中发挥重要作用。取前6个靶点为核心靶点，分别为 NCOA2、PTGS1、PTGS2、PGR、IGHG1和RXRA等靶点的拓扑参数相对较高，表明这些靶点可能是活性成分作用的核心靶点。不同活性成分作用在同一个靶点，且同一活性成分作用不同靶点，推测这些活性成分可能存在多靶点、多途径的协同作用。

图3 活性成分-靶点网络

2.4 马勃靶点的生物功能和通路富集分析

为进一步证实硬皮马勃活性成分靶点与肿瘤相关性，应用Metascape 工具和DAVID 数据库对靶点进行生物功能和通路富集分析（图4）。为了更好的明确活性成分作用靶点过程和位置，对其生物功能分析，分别从生物学过程（biological process, BP）、分子功能（molecular function, MF）和 细 胞 组 分（cellular component, CC）3 个水平对 16 个靶点进行 GO 富集分析，按照P＜0.01 的阈值过滤，共富集到65 条生物功能，选取富集显著程度靠前的条目进行绘制可视化图形（图4a）。富集度较高的生物学过程主要包括：糖皮质激素分泌、一氧化碳合成正向调控、铁离子对初始转移的正向调控、药物反应、细胞对缺氧反应、正调控序列特异性DNA 结合转录因子活性、免疫反应、发热产生的积极调节、细胞因子分泌的负调控参与免疫反应；分子功能包括：prostaglandin-endoperoxide 合酶活性、酶结合、过氧化物酶活性、相同的蛋白结合、细胞外配体门控离子通道活性、类固醇激素受体活性、PDZ结合功能域、特异性DNA结合、锌离子结合等；细胞组分包括：突触后膜、质膜的外部、胞外区、胞器膜、细胞外空隙（图4a）。KEGG 富集通路分析显示（图4b），硬皮马勃活性成分参与的通路有小细胞肺癌信号通路（hsa05222），MAPK 信号通路（hsa04071），NF-kappa B信号通路（hsa04064）等多个信号通路，这些通路参与不同的肿瘤细胞的增殖和迁移，诱导或加速肿瘤细胞的凋亡，活性成分在通路上主要作用的靶点有IL10、PTGS1、PTGS2、TNF、RXRA 和BCL2 等，这些靶点参与免疫应答，肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡等多种生物学过程。

图4 GO和通路富集分析。

2.5 靶点-通路（T-P）网络构建及分析

为了进一步揭示硬皮马勃活性成分作用靶点和通路之间的关系，提取富集分析结果中KEGG 通路及通路相关靶点，利用Cytoscape3.8.0 软件构建T-P 网络图（图5）。T-P 网络图含有25 个节点（9 个靶点和16条通路）和45 条边。网络拓扑图分析表明，网络的某些通路与多个靶点相关联，如小细胞肺癌通路（hsa05222）和Toll-like receptor（hsa05152）等通路分别与4 个靶点相关联，该通路主要参与肿瘤细胞的转移和增殖。MAPK通路（hsa04071）与4个靶点相关联，主要参与免疫与肿瘤细胞增殖。NF-Kappa 通路（hsa04064）与3 个靶点相关联，主要参与肿瘤细胞的凋亡。由此我们推断硬皮马勃活性成分整合多信号通路抑制肿瘤细胞转移和增殖，促进癌细胞凋亡等生物学功能。目标靶点也与多个通路相关联，如：TNF靶点与11 个通路相关联，其次BCL2 靶点与8 个通路相关联，IL10靶点与7个通路相关联，说明这些靶点是硬皮马勃活性成分主要作用的靶点。

图5 T-P网络图

2.6 马勃活性成分治疗通路的整合分析

为了深入理解硬皮马勃治疗肿瘤的整体机制，我们整合MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT、NF-Kappa和小肺癌细胞中的PI3K-AKT 等关键信号通路，构建了硬皮马勃治疗肿瘤的主要通路图（图6），这些通路参与细胞免疫应答，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，促进肿瘤细胞的凋亡等生物学功能。

图6 目标靶蛋白在精简癌细胞途径上的分布

3 讨论

根据国际癌症研究中心数据表明，肿瘤发病率呈上升趋势，已威胁全球居民生命和健康。常规治疗方法容易造成机体损伤和明显不良反应，而中药治疗对机体安全性相对较高，特别是药用真菌在一些疑难杂症和慢性病的治疗中显示其突出优势。硬皮马勃为当地民间药用大型真菌，在治疗老年外阴湿疹及痔疮手术后排便困难，阻止伤口止血、冻疮流水等疾病方面具有较好的疗效。为了更好了解、开发和利用此药用真菌，对其进行形态学和核糖体rRNA 基因内转录间隔区（ITS）方法鉴定，确定为硬皮马勃（Scleroderma sinnamariense），属于硬皮马勃科的一种。

从已有文献资料中获知，硬皮马勃化学成分59个，根据药用动力学ADME 系统虚拟筛选获得7 种活性成分，分别为脂肪酸（2种）、甾体化合物（3种）、脂类（1 种）和醇类（1 种）。由于硬皮马勃活性成分作用机制的相关研究较少，目前仅发现5种活性成分的靶点，其中PA 和LA 作用靶点较多，可能是抑制肿瘤的主要成分。有关机制表明，PA通过调节膜流动性和糖代谢来抑制肿瘤细胞的生长[21]，也可通过抑制肿瘤细胞分泌的外泌体[26]或下调靶点基因IL-10 的表达水平来抑制肿瘤细胞的增殖和转移[27]。Lei研究发现PA 通过自噬激活和内质网应激诱导Saos-2肉瘤细胞凋亡[28]。而LA 主要通过调节雌激素受体（ERa）、G13a G 蛋白、p38 MAP kinase 基因表达，改善细胞微环境，间接参与肿瘤细胞的凋亡[29-30]。甾体化合物是真菌次生代谢产物，属于天然抗氧化剂，具有抗炎、抑制肿瘤血管生成的作用[31]，它主要通过上调抑癌基因Foxo3 表达和激活凋亡蛋白Puma 和Bax，有效抑制肿瘤细胞的迁移、增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[32-33]。由此可见，这些成分在抑制肿瘤细胞生长、增殖、迁移，诱导其凋亡方面具有重要作用。

通过KEGG 通路分析获得65 条相关信号通路，整合 PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT、NF-Kappa 等关键信号通路及其通路上的靶点蛋白，能够清晰展示通路、靶点蛋白之间的关联，更好揭示硬皮马勃活性成分治疗肿瘤的机制。本研究发现，MAPK 、Toll-like receptor 和 NF-Kappa 信号通路参与了免疫应答，除了NF-Kappa通路其余4条通路均参与肿瘤细胞的转移和增殖，此外Toll-like receptor和Jak-STAT 信号通路还参与了肿瘤细胞的凋亡，表现出多通路，多层次的协同增效作用。

免疫是一个复杂的生物学过程，免疫系统对病原体的抑制，导致炎症反应和专业吞噬细胞积累到入侵部位[34]。硬皮马勃活性成分可能通过MAPK、NFKappa 和Toll-like receptor 信号通路（图6）上的关键靶点 IL10、TNFα、BcL2/XL 和 COX2 参与细胞的免疫反应。MAPK、NF-Kappa 和 Toll-like receptor 信号通路参与多种炎症过程并能促进炎症的发生[35-36]，下调或抑制这些炎症通路，可以控制炎症反应，提高免疫应答[37]。活性成分作用靶点TNFα、BcL2 和 IL10 的通联度较高（图5），分别为11、8 和7，说明这些靶点可能是其关键靶点。我们推测，硬皮马勃活性成分可能是通过抑制炎症提高免疫达到抑制肿瘤增殖和迁移的目的。Hu 沉默 DPP4 基 因和 Zhen 敲除 COL12A1 基因 抑制MAPK 通路，从而抑制细胞增殖和迁移，促进肿瘤细胞凋亡[38-39]，证明该推测正确，表明硬皮马勃活性成分在炎症反应和抑制肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。

硬皮马勃活性成分可能通过PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT信号通路抑制肿瘤细胞的迁移和增殖，调控这些信号通路在肿瘤治疗过程中可能具有较好的疗效。硬皮马勃活性成分可能通过调控基因表达或沉默基因，抑制通路[40-41]和趋化因子，间接参与抑制肿瘤细胞转移和增殖[42]；也可能抑制AKT磷酸化[43]，导致细胞周期蛋白表达的改变[44]，或直接作用于靶点蛋白IFNy，通过Jak-STAT 通路抑制肿瘤细胞的增殖和转移，此推测需要实验进一步证实。总之，不同通路在不同类型的肿瘤中可以被不同分子激活，从而呈现出不同表型。

通过整合通路发现，硬皮马勃活性成分可能通过Toll-like receptor、Jak-STAT 信号通路，作用于靶点蛋白iNOS，促进肿瘤细胞的凋亡，这与Li 用姜黄素上调miR-99a基因抑制JAK/STAT通路，抑制视网膜母细胞瘤（Rb）增殖，并促进凋亡[45]的研究结果一致。表明JAK/STAT 通路在很多癌症中被激活，加强了癌细胞的扩散[46-47]，由此可推导抑制该通路可以控制某些肿瘤细胞扩散。

本研究通过GO 功能和KEGG 通路富集分析，进一步揭示硬皮马勃活性成分作用的16个关键靶点，以及它们在基因功能和信号通路中的作用。TNF、IL10、BCL2 和PTGS2 等靶点在细胞膜、细胞质和细胞器部位发生蛋白结合、调控关键基因表达、抑制趋化因子和磷酸化等分子反应，进而调控PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT 和 NF-Kappa 等 信 号 通路，抑制肿瘤细胞的生长和侵袭，诱导或促进肿瘤细胞凋亡，充分体现了硬皮马勃活性成分具有多通路，多靶点、多层次的增效作用。

综上所述，通过形态学和分子生物学鉴定当地民间药用野生大型真菌为硬皮马勃（Scleroderma sinnamariense）。基于中药系统药理学、ADME、靶点预测、网络拓扑图分析和通路分析等方法，挖掘潜在的活性成分（PA、LA 等）5 种，这些活性成分主要通过Toll-like receptor、PI3K-AKT、MAPK 和 NF-kappa B 等通路作用于关键靶点蛋白（TNF、IL10、BCL2 等），参与免疫应答，抑制肿瘤细胞生长、增殖，促进其凋亡，为传统药用真菌研究提供方法，肿瘤新药的开发和临床应用提供了理论支撑和新思路，但潜在活性物质的分离及其在体外抑制肿瘤的效果还需要进一步验证。