基于网络药理学和分子对接探讨益肾健骨方治疗绝经后乳腺癌患者骨质疏松的机制及实验验证＊

孟 慧 ，于明薇 ，陈宇晗 ，马云飞 ，王笑民

（1. 北京中医药大学研究生院 北京 100029；2. 首都医科大学附属北京中医医院 北京 100010）

1 引言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，约70%呈激素受体阳性表现，其中60%以上为65 岁及以上患者[1]。内分泌治疗是激素受体阳性乳腺癌患者的一线治疗，绝经后乳腺癌患者接受内分泌治疗能够显著降低疾病的复发和转移，然而体内雌激素水平明显下降，出现骨量减少、骨微结构改变[2-3]，导致骨脆性增加，骨质破坏，临床可表现为骨痛、关节痛，严重者出现骨质疏松，甚至骨折，严重影响患者的生活质量，降低治疗依从性，影响乳腺癌的预后。目前针对绝经后乳腺癌患者骨质疏松尚无统一治疗方案，临床多以双膦酸盐、钙剂等为主要治疗方法[4-5]，但疗效尚不确切。

在祖国传统医学中，绝经后乳腺癌患者骨质疏松属于“骨痿”“骨枯”的范畴，肝肾亏虚，经络瘀阻是其主要病机，故多从肾肝论治。益肾健骨方是王笑民教授从肝肾论治绝经后乳腺癌患者骨质疏松症的常用方剂，取得了良好的疗效，临床研究证实，益肾健骨方可以减轻绝经后乳腺癌患者的骨关节痛，提高患者的骨钙素水平，增加骨转换，改善骨质疏松[6-7]。由于益肾健骨方药物组成多，成分复杂，治疗绝经后乳腺癌患者骨质疏松的机制尚不明确。网络药理学[8]是通过生物网络平衡的办法构建疾病-成分-靶点网络，预测中药治疗作用靶点[9]，探索药物作用机制。

据此，本文拟通过网络药理学及分子对接方法探讨益肾健骨方治疗绝经后乳腺癌患者骨质疏松的作用机制，以期为后期研究提供理论基础支持。

2 研究思路与方法

本文通过TCMSP 数据库筛选益肾健骨方中药物活性成分及靶点，TTD、Drugbank、DisGenet 数据库获得疾病靶点，取交集后获得益肾健骨方治疗绝经后乳腺癌骨质疏松症的靶点，通过Cytoscape 构建中药-活性成分-靶点网络图和蛋白相互作用图，并对作用靶点进行GO 功能富集和KEGG 通路富集，根据富集分析的结果进行实验验证。研究流程图如图1所示。

图1 研究流程图

3 材料与方法

3.1 益肾健骨方的中药成分与靶点的获取

通过中药系统药理数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）[10]检索熟地黄、山茱萸、菟丝子、川牛膝、香附、当归、茯苓、白芍、川芎、延胡索、络石藤、透骨草十二味中药并获取成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 为条件进行筛选，得到益肾健骨方活性成分集合。通过有机小分子生物活性数据库（PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和 Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）获得药物活性成分的靶点，去除重复靶点基因即得到益肾健骨方活性成分的靶点。

3.2 骨质疏松疾病基因获取

以“breast cancer”“postmenopausal osteoporosis”为关键词，从药物靶标数据库（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/），药 物 数 据 库（DrugBank，https://go. drugbank.com/），疾病相关的基因与突变位点数据库（DisGenet，https://www.disgenet.org/）中获得绝经后乳腺癌患者骨质疏松相关靶点171个。

3.3 核心靶点筛选和中药-活性成分-靶点网络图的构建

利用Venn diagram 在线绘图工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）将益肾健骨方活性成分靶点与绝经后乳腺癌骨质疏松靶点绘制Venny 图，交集靶点即为益肾健骨方治疗绝经后骨质疏松的核心靶点。利用Cystoscape 3.7.2构建益肾健骨方治疗绝经后乳腺癌骨质疏松中药-化合物-靶点网络图。

3.4 蛋白质相互作用网络的构建和分析

将药物治疗绝经后骨质疏松的交集靶点蛋白导入SRTING 数据库，研究生物选择“Homo sapiens”，隐藏孤立蛋白，导出tsv 文件，运用Cytoscape3.7.2 绘制PPI网络图并进行拓扑学分析，获得核心蛋白。

3.5 GO生物过程富集分析与KEGG通路富集分析

利用Metascape 在线作图进行GO 功能富集分析与KEGG 通路富集分析。选取P值前20 条绘图。利用Cytoscape3.7.2 构建靶点-通路图，直观阐释益肾健骨方治疗芳香化酶抑制剂相关骨质疏松的靶点和信号通路。

3.6 分子对接

将疾病-成分-靶点网络中拓扑分析结果按照Degree 值排序，取排名前5 的化合物进行分子对接。排名前5 位靶点蛋白与PPI 网络中Degree 排名前5 的靶点蛋白取交集，得到2 个核心靶点。通过KEGG 通路富集结果，得到通路关键靶点。通过蛋白结构数据库（Protein Data Bank）获得核心靶点和关键靶点的3D结构，通过PubChem 数据库获得活性成分3D 结构，通过DockThor数据库（https://dockthor.lncc.br/v2/）进行分子对接。

3.7 实验验证

3.7.1 药物及试剂

益肾健骨方（含生药熟地黄20 g，酒萸肉15 g，菟丝子10 g，川牛膝15 g，香附10 g，当归10 g，茯苓15 g，白芍15 g，川芎10 g，延胡索15 g，透骨草15 g，络石藤20 g）购自北京中医药大学东直门医院颗粒药房，由专业人员质检确保药品质量。阿那曲唑片（阿斯利康，批号：J20150021）、阿仑膦酸钠片（默沙东，批号：J20130085）由本院药房提供。多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：1605162），pi3k 一抗（批号CST4263），akt 一抗（批号 CST9272），β-actin 兔抗（CST3700）。

3.7.2 实验动物

9月龄SD雌性大鼠15只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011，随机分为假手术组、去势组、西药组、中药高剂量组、中药低剂量组，每组3只。

3.7.3 造模及给药

大鼠经适应性喂养一周后，其中12只做双侧卵巢摘除，正常组仅摘除卵巢周围等质量的脂肪组织。术后一周灌胃给药，中药组以阿那曲唑片和益肾健骨方灌胃，给药剂量根据大鼠与人的体表面积等效剂量比值进行换算，低剂量组为2 g/kg/天，高剂量组为8 g/kg/天，阿那曲唑片0.1 mg/kg/天，阿仑膦酸钠片1 mg/kg/天。连续给药12 周后处死大鼠，取股骨做HE 染色，Masson 染色观察骨微结构并比较各组胶原容积比，Western blot法检测大鼠骨组织pi3k蛋白相对表达。

3.7.4 统计学分析

4 结果

4.1 益肾健骨方中药物活性成分与靶点的筛选

利用TCMSP 数据库检索益肾健骨方中12 味中药，共得到141种药代动力学特征较好的活性成分，其中白芍10种，川牛膝4种，川芎6种，当归2种，茯苓15种，络石藤9 种，山茱萸19 种，熟地黄2 种，透骨草4种，菟丝子11种，香附16种，延胡索43种，去除重复活性成分，共113 种，部分有效成分见表1。通过PubChem 数据库获得活性成分化合物的SMILE 结构，提交Swiss Target Prediction 数据库进行靶点预测，获得对应靶点的Gene Symbol。所有活性成分共得到靶点基因1186 个。通过TTD 数据库、DrugBank 数据库、DisGenet 数据库获得疾病相关靶点171 个，与中药复方靶点取交集即得到益肾健骨方治疗绝经后骨质疏松的潜在靶点，共43个（图2）。

图2 药物-疾病靶点基因图

表1 益肾健骨方治疗绝经后骨质疏松的药物活性成分信息

4.2 网络构建

利用Cytoscape3.7.2 软件对益肾健骨方治疗绝经后骨质疏松的靶点进行网络可视化构建，结果见图3。绿色菱形代表靶点，蓝色方形代表中药，六边形为益肾健骨方的不同活性成分，其中黄色六边形为12味中药共有的9 种活性成分。节点的大小根据自由度确定，其中Degree 值排名前5 个的靶点是CYP19A1、ESR2、AR、SRC、ESR1，其Degree 值分别为91、71、68、67、65。活性成分对照信息见表2。

表2 益肾健骨方活性成分对照表

图3 疾病-中药-化合物-靶点网络图

4.3 蛋白质相互作用关系

将筛选出的益肾健骨方治疗芳香化酶抑制剂相关骨质疏松的43个靶点利用STRING数据库获取蛋白相互作用数据，通过Cytoscape3.7.2 对PPI 网络进行可视化，隐藏孤立靶点，网络图中包含38 个节点，200 条边，节点代表不同的基因蛋白，边代表其相连接的蛋白有相互作用的关系。节点的大小和颜色按照Degree 值大小确定。按照Degree 值，排名前5 位的基因蛋白为别为ESR、ALB、IL6、SRC、CTNNB1（图4）。

图4 蛋白相互作用网络图

4.4 GO和KEGG富集分析结果

GO 富集分析共得到GO 条目（P＜0.05）1048 个，其中生物学过程（Biological process）923 个，分子功能（Molecular function）78 个 ，细 胞 成 分（Molecular function）47 个。通过KEGG 通路分析，得到KEGG（P＜0.05）条目84 个，涉及肿瘤通路、人乳头瘤病毒感染等相关通路（图5-图6）。

图5 GO富集分析结果

图6 KEGG通路富集分析结果

4.5 KEGG关系网络的构建

根据益肾健骨方成分-靶点网络、蛋白相互作用网络，将益肾健骨方可能作用到绝经后骨质疏松的前20 条KEGG 信号通路及作用靶基因进行分析，通过Cytoscape3.7.2 得到KEGG 网络图（图7），中间黄色节点代表靶蛋白，周围红色节点代表信号通路，根据Degree 值大小调节节点大小和透明度。如图所示，益肾健骨方可能通过多个通路、多靶点共同起效治疗绝经后乳腺癌骨质疏松。

图7 KEGG通路-靶点网络

4.6 分子对接结果

根据疾病-成分-靶点网络中网络拓扑学分析结果，Degree 值排名前五的化合物为β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚，排名前五的靶点分别为CYP19A1、ESR2、SRC、AR、ESR1，将疾病-成分靶点网络中Degree 排名前 5 的靶点与 PPI 网络中Degree 排名前5 的靶点取交集，得到核心靶点2 个，分别为ESR1、SRC。通过KEGG 通路富集，COX2与绝经后骨质疏松的关系紧密，在此与核心靶点一起通过分子对接进行验证（表3）。

表3 Degree前5的化合物与核心靶点和潜在靶点的分子对接信息

通过DockThor数据库（https://dockthor.lncc.br/v2/）进行分子对接，并计算靶点与化合物对接后的结合能。一般认为，配体与受体之间的结合能越低，结合越稳定，其发生作用的可能性就越大，分子对接结果见表2。核心靶点SRC、ESR，潜在靶点COX2 与β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、槲皮苷、山柰酚均能较好结合，对接示意图见图8～图10。

图8 从上至下依次为SRC与β-谷甾醇（A）、豆甾醇（B）、谷甾醇（C）、槲皮苷（D）、山奈酚（E）的分子对接

图9 从上至下依次为ESR与β-谷甾醇（A）、豆甾醇（B）、谷甾醇（C）、槲皮苷（D）、山奈酚（E）的分子对接

图10 从上至下依次为COX2与β-谷甾醇（A）、豆甾醇（B）、谷甾醇（C）、槲皮苷（D）、山奈酚（E）的分子对接

可以看出核心靶点和潜在靶点与槲皮苷的结合能最低，表明槲皮苷与核心靶点和潜在靶点的结合稳定。图 9 中槲皮苷通过 Gln198、Glu54、Lys44、Asp194形成氢键相互作用，结合在SRC的活性口袋。图10中槲皮苷通过残基 Glu75、Glu111、Tyr231、Asp232 形成氢键相互作用，结合在ESR的活性口袋。图11中槲皮苷通过残基His2、Asn7、Gln296 形成氢键，与潜在靶点COX2结合。

4.7 骨组织H&E染色及Masson染色结果

大鼠股骨下段H&E染色，正常大鼠股骨骨小梁排列紧密规则，模型组可见骨小梁稀疏且排列不规则；中药高剂量组和中药低剂量组骨小梁排列致密，可见少量新生骨组织（图11）。

图11 术后12周各组大鼠股骨组织切片H&E染色（10×）

对SD 大鼠股骨下段矢状面进行Masson 染色，骨小梁蓝染，骨髓腔呈红色。光镜下观察，正常组骨小梁排列规则，层次清晰；模型组骨小梁稀疏且排列不规则；与模型组相比较，中药低剂量组及中药高剂量组骨小梁结构完整，胶原层次清晰（图12-图13）。

图12 术后12周各组大鼠股骨组织Masson染色（10×）

图13 各组大鼠股骨下段胶原容积比

4.8 各组大鼠骨组织pi3k蛋白相对表达

采用Western blot 法检测各组大鼠股骨组织pi3k蛋白表达，结果显示，中药低剂量组pi3k 表达量较模型组显著降低（P＜0.05），中药低剂量组p-pi3k 的表达水平显著低于正常组、阳性对照组、中药高剂量组（P＜0.05）（图14、表4）。

表4 各组大鼠骨组织中pi3k和p-pi3k蛋白表达比较（）

表4 各组大鼠骨组织中pi3k和p-pi3k蛋白表达比较（）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与正常组比较，ΔP＜0.05，与阳性对照组比较，▲P＜0.05，与中药高剂量组比较，**P＜0.05。

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图14 各组大鼠骨组织pi3k和p-pi3k蛋白表达

4 讨论

绝经后乳腺癌患者骨质疏松是绝经后激素受体阳性乳腺癌患者服用芳香化酶抑制剂后常见的临床疾病。绝经后女性体内雌激素主要通过芳香化酶从雄激素转化而来，芳香化酶抑制剂可以选择性阻断芳香化酶的作用，降低循环雌激素水平。雌激素有利于骨细胞的生成，雌激素水平下降，破骨细胞及其前体产生增多，骨吸收增加，骨量减少及骨微结构改变[11]，患者可以有骨痛、关节痛等表现，双能X 线吸收测定（DXA）可表现骨密度下降。益肾健骨方以补肾健脾、调肝理气为法，全方共12 味药，熟地黄、山茱萸、菟丝子、川牛膝补肾健骨，香附、当归、白芍调肝理气，川芎、延胡索、透骨草、络石藤通络止痛，茯苓补中有泻，兼益心脾。

本研究通过TCMSP 数据库对益肾健骨方进行成分-靶点的筛选，以OB≥30%，DL≥0.18 为筛选条件，得到113 种药代动力学较好的活性成分，药物-活性成分-靶点网络显示，延胡索的活性成分最多，其次为山茱萸、茯苓、香附。益肾健骨方中活性成分较好的化合物β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮苷、山奈酚等可能 通 过 Pathways in cancer、Human papillomavirus infection、Pi3k-Aktsignaling pathway、Focal adhesion 等通路作用于 ESR1、SRC、ALB、IL-6、PTGS2、CTNNB1等靶点发挥抗骨质疏松作用。β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇是常见的植物甾醇类成分，植物甾醇具有抗炎[12]、抗肿瘤[13]及免疫调节[14-15]等功能。有研究发现，β-谷甾醇可以改善骨骼脆性[16]，通过刺激OPG mRNA 的表达促进成骨细胞生成，抑制骨吸收[17]。槲皮苷、山柰酚为黄酮类化合物，具有抗氧化[18-19]、抗肿瘤[20-21]的作用，其中槲皮苷是山茱萸、菟丝子、川牛膝、香附、延胡索、透骨草的共有成分。实验研究发现，槲皮苷可能通过抑制NFATc1、TRAP 的表达，从而抑制破骨细胞活性及骨吸收[22]，发挥抗骨质疏松的作用。山柰酚是菟丝子、香附、透骨草、白芍的共有成分，体外研究报道，山柰酚可能通过下调RANKL、c-Fos 及TRAF6 的表达减少破骨细胞的生成[23-24]治疗骨质疏松。

由蛋白质相互作用网络，ESR、IL-6、SRC 等可能是益肾健骨方治疗绝经后乳腺癌患者骨质疏松的关键靶点。ESR 可以通过多种方式参与骨代谢过程，雌激素与ESR 结合参与成骨细胞的生成与矿化[25]，破骨细胞的增殖与凋亡[26]，雌激素存在条件下，ESR 可以激活 PI3K/AKT/GSK 通路[27]，通过 RANKL/RANK/OPG 途径调节破骨细胞的生成和活性[28]，影响骨代谢。IL-6为骨吸收诱导剂，主要作用于破骨细胞，增强破骨细胞活性。有研究报道，去势大鼠血清中IL-6水平明显升高[29]，骨密度与 IL-6 呈明显负相关[30]。SRC 家族成员有调节雌激素依赖的雌激素受体靶基因表达的作用[31]，同时也是调节乳腺癌细胞增殖和雌激素受体转录活性的调节因子[32]，有研究发现，SRC 可以通过调控ERα 的活性促进人成骨细胞的增殖分化[33]，促进骨形成过程。

通过 GO 富集分析及 KEGG 通路分析，GO-BP 富集集中在细胞迁移和运动的正向调节，移行的正向调节，血管形态的发生，而GO-MF 富集分析结果主要集中在转录因子结合、细胞黏附分子结合及蛋白质结构域特异性结合等方面，GO-CC 富集分析显示黏着斑、细胞基质黏着连接、质膜蛋白复合物等与绝经后乳腺癌患者骨质疏松相关。益肾健骨方通过癌症通过癌症通路、人乳头瘤病毒感染通路、Pi3k-Akt 通路等。其中Pi3k-Akt 信号通路通过多种方式参与信号转导，与骨质疏松、骨关节炎等疾病相关[34-35]，强胜林等[36]通过实验研究发现，抑制Pi3k-Akt 信号通路的激活可以减少破骨细胞的分化，从而改善骨质疏松。在癌症通路和人乳头瘤病毒感染通路图中，益肾健骨方还可对Wnt信号通路、COX2等进行调节以治疗骨质疏松。

5 结论

本研究利用网络药理学、分子对接方法展示了益肾健骨方通过β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮苷、山柰酚等多种成分作用于 CYP19A1、ESR2、AR、SRC、ESR1 等靶点，从而影响癌症通路、人乳头瘤病毒感染通路、Pi3k-Akt 通路干预绝经后乳腺癌骨质疏松症。为验证以上网络药理学方法预测结果，本研究通过大鼠体内实验进行验证，结果显示，益肾健骨方可以增加大鼠骨小梁密度及骨组织胶原溶剂，改善骨质疏松状态。Pi3k-AKt 信号通路参与成骨细胞和破骨细胞活动的调控，本实验中益肾健骨方下调大鼠骨组织中Pi3k蛋白表达，改善大鼠骨质疏松状态。

参照《网络药理学评价方法指南》[37]，本文中疾病、药物成分靶点来源于目前网络药理学研究的权威数据库；所用的数据网络分析软件及分析方法为网络药理学研究广泛使用。通过动物体内研究对结果进行验证，实验设计合理，结果具有可重复性。但本研究仍有一定局限性：本文中中药成分众多，组成复杂，结合临床实际，实验验证针对中药可能作用的信号通路进行，但未涉及处方中筛选到的主要活性成分，未来可开展相关实验研究。